稳定表达生物素连接酶Bir A的细胞株制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种稳定表达生物素连接酶Bir A的细胞株制备方法及其在重组蛋白体内定点生物素化中的应用。本发明提供了该细胞株的构建方法及其应用实例：将Bir A基因插入真核表达载体；转染宿主细胞得到稳定表达BirA的细胞系；构建带Avi‑蛋白纯化联合标签的重组蛋白表达载体；转染BirA细胞系用于生产体内定点生物素化蛋白。本发明的独特之处在于实现了BirA基因在真核哺乳动物细胞内表达和重组蛋白体内定点生物素化；选用HEK 293F为宿主细胞，便于在生产重组蛋白的同时进行细胞内的定点生物素化，提高了后续进行生物学功能检测的效率；提供了应用HEK 293F‑Bir A细胞株生产体内生物素化重组蛋白检测、鉴定的基本方法和技术途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种稳定表达Bir A细胞株的制备方法及其在重组蛋白生产体内生物素化中的应用。

背景技术

生物素－亲和素系统(Biotin-Avidin—System，BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。通过体外化学法进行生物素化是目前最常用的方法之一。这种方法方便、快捷、生物素化标记效率高。缺点是在对蛋白类试剂生物素化的过程中，生物素化位点是随机标记的，某些位点的生物素化形成的空间位阻会对蛋白活性造成影响。如何解决这一缺陷是蛋白质生物学活性研究中待解决的问题之一。

生物素连接酶(Biotin Protein Ligase)用于催化生物素化反应，可将生物素连接到特定的氨基酸位点上。常见类型包括大肠杆菌中的Bir A。Bir A作为生物素--[乙酰辅酶a羧化酶]连接酶可以在ATP存在下，Bir A激活生物素形成Bir A-生物素-5'-腺苷酸(BirA-bio-5'-AMP)复合物，通过共价结合到蛋白质赖氨酸位点上。 Avi-Tag标签蛋白是一个15个氨基酸的短肽(GLNDIFEAQKIEWHE)，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化。这样，借助Avi-tag和生物素连接酶，无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi-tag位点有效且特异性地被生物素化，大大降低了因为生物素化而引起的空间位阻效应，以避免影响蛋白生物学功能活性。

生物素连接酶来源于细菌等低等生物，在高等哺乳动物细胞是没有这类酶的。本发明通过实现Bir A基因真核哺乳动物细胞内表达，在蛋白质生产过程中的体内定点生物素化，可以极大地提高后续进行蛋白质生物学功能检测的效率；同时体内定点生物素化在保持重组蛋白生物学功能活性上明显优于体外化学标记法。

发明内容

本发明提供一种具有功能活性的稳定表达Bir A细胞系及其制备方法和应用。

一方面，本发明提供了一种稳定表达具有功能活性的BirA的真核细胞系

生物素连接酶来源于细菌等低等生物，在高等哺乳动物细胞是没有这类酶的。因此，本发明将(1)Bir A 基因插入真核表达载体，导入到HEK 293F细胞中，经过加压筛选得到稳定表达Bir A的细胞系；(2)同时构建带有Avi-蛋白纯化标签的蛋白表达载体；(3)将步骤2构建的蛋白表达载体导入步骤1建立的Bir A 细胞系用于生产体内定点生物素化蛋白质。具体步骤如下：

将Bir A基因克隆到真核表达载体，该真核表达载体具有如下特点：

Bir A编码基因处于转录调控原件的控制之下，可以在哺乳动物细胞中表达；

该真核表达载体具备在真核细胞中驱动外源基因表达的所有转录、翻译所需要的调控原件，包括启动子 promoter、增强子enhancer、转录起始区、polyA加工和转录终止信号，以及核糖体结合区、翻译起始信号、翻译终止信号等。

将含有BirA基因的表达载体导入到宿主细胞中，经过筛选得到稳定表达且具有功能活性的Bir A细胞株。表达载体导入细胞的方式包括经化学方式(包括liposome，lipofectamin等脂质成份为主体的微球结构介导的细胞转染)、物理方式或生物学方式导入哺乳动物细胞；

表达载体导入细胞方式中的物理学方式包括但不限于利用电穿孔方式导入DNA到哺乳动物细胞；

表达载体导入细胞中的生物学方式包括但不限于基因片段包裹入病毒颗粒，通过病毒颗粒感染哺乳动物细胞的方式导入外源基因片段；

上述宿主细胞是蛋白质生产常用的细胞系；例如HEK 293F，Expi293细胞，CHO-K1,CHO-S细胞等。

阳性细胞株筛选

上述细胞的筛选可以通过以下途径得到：

基于单细胞分离技术比如流式细胞分选，可以是通过基因片段相关联的荧光素基因(如绿色、黄色、红色荧光蛋白GFP、YFP、RFP等)的表达，以荧光强度挑选高表达的细胞株；

上述细胞的筛选可以是通过表达载体中基因片段相关联的抗菌素抗性基因表达以及应用抗生素去除没有基因整合或表达量相对较低的细胞；可以用逐步提高抗生素浓度的方式挑选高表达细胞株；经过有限稀释方法的得到单克隆细胞。

带Avi-His纯化标签重组蛋白表达载体的构建：在蛋白表达载体的目的蛋白开放读码框N端或C端添加 Avi-His纯化标签，使目的蛋白与Avi-His标签融合表达；该多功能融合标签包括但不限于纯化标签His。

Bir A细胞株的功能鉴定

Bir A过表达细胞株中Bir A的功能活性可以通过以下方式确定：

体内生物素化蛋白的表达：将带Avi-His纯化标签重组蛋白表达载体转染至293F-BirA细胞中，收集细胞，分离、纯化蛋白；

采用ELISA方法检测重组蛋白生物素化效率。

另一方面本发明的细胞系可以用于重组蛋白生产过程体内定点生物素化。具体应用如下：

生物素化重组蛋白：将带Avi-His纯化标签重组蛋白表达载体转染至HEK 293F-BirA细胞中，收集细胞，分离、纯化蛋白；未生物素化蛋白体外化学标记法试剂盒进行生物素化为对照；采用ELISA方法检测生物素化重组蛋白生物学活性。

本发明的独特之处在于：1)实现了Bir A基因在真核哺乳动物细胞内表达，同时在重组蛋白表达过程中将其进行体内定点生物素化；2)选用重组蛋白生产中广泛使用的HEK293F为宿主细胞过表达Bir A，便于在生产重组蛋白的同时进行细胞内的定点生物素化，极大地提高了后续进行生物学功能检测的效率；3) 提供了应用HEK 293F-Bir A细胞株生产体内生物素化重组蛋白检测、鉴定的基本方法和技术途径。

一株稳定表达Bir A的细胞株HEK 293F-Bir A于2020年8月4日保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏单位代码：CCTCC中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉大学；保藏状态：存活；保藏日期：2020年8月4日；保藏编号：CCTCC NO:C2020144；分类命名：BirA过表达人胚肾细胞系HEK293F-BirA。

附图说明：

图1 Bir A真核表达质粒：pcDNA3.1多克隆位点中插入Bir A(UniProtKB-P06709(BIRA_ECOLI)),基因编码序列(CDS)。由CMV启动子及其基因转录调控元件驱动Bir A表达。

图2含Avi-His标签融合蛋白表达载体：在真核表达载体中插入信号肽、重组蛋白质基因和Avi-his标签序列；使它们在同一开放读码框(ORF)中；并由EF1a启动子及其基因转录调控元件驱动ORF表达。

图3 HEK 293F-Bir A稳定表达细胞株生物素化功能鉴定：重组蛋白SLN8023,SLN8024均能与包被的SA 结合，且信号值均呈现良好的浓度依赖性，结果提示SLN8023,SLN8024蛋白均有良好的生物素化。

图4体外和体内定点生物素化标记检测：体外生物素化标记的重组蛋白biotin-protein A,biotin-protein B比体内定点生物素化标记的重组蛋白Avi-protein A，Avi-protein B生物素化效率高。

图5体外和体内定点生物素化标记重组蛋白的生物学活性检测：体内定点生物素化标记的重组蛋白 Avi-protein A，Avi-protein B与受体结合能力明显优于体外生物素化标记的重组蛋白biotin-protein A, biotin-protein B。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用的方法如无特殊说明均为常规方法，实验中采用的一些关键试剂。

实施例1重组真核表达载体pcDNA3.1-Bir A的构建

在真核表达载体pcDNA3.1多克隆位点中插入Bir A(UniProtKB-P06709(BIR A_ECOLI)，BirA基因翻译成氨基酸的序列为Seq 1；开放读码框(ORF)中由CMV启动子及其基因转录调控元件驱动Bir A表达，如说明书附图1所示。BirA基因经密码子优化后人工合成，合成的BirA基因片段和pcDNA3.1载体经Bmt I,Xba I双酶切，T4 ligase连接，DH 5α感受态细胞转化，扩增，抽取质粒备用。宿主细胞为人HEK 293F。

实施例2 HEK 293F-Bir A稳定细胞系的建立

HEK 293F细胞采用奥浦迈(OPM-CD05，81075-001)培养液培养。按常规传代培养。采用含10％DMSO培养液冻存细胞，1×10

pcDNA3.1-Bir A转染HEK 293F细胞：转染前一天D0，接种1.5×10

稳定表达HEK293-Bir A细胞系的建立：D3，细胞传代，并加入400ug/ml G418加压筛选。D7，细胞换液， G418 400ug/ml。D10，对照细胞全部死亡，HEK 293F-Bir A细胞改用含G418 200ug/ml培养基培养。按常规传代、扩增培养、液氮保存备用。

实施例3含Avi多功能联合标签的蛋白表达载体的构建和重组蛋白的生产

在真核表达载体中插入信号肽、重组蛋白质基因和avi-his标签序列；avi的标签序列翻译成氨基酸序列为 Seq2；使它们在同一开放读码框(ORF)中；并由EF1a启动子及其基因转录调控元件驱动ORF表达。如说明书附图2所示。按常规转化感受态菌，扩增、抽提质粒备用。按常规转染HEK 293F-BirA细胞，细胞扩增培养6天，离心收集细胞上清，纯化、浓缩体内定点生物素化重组蛋白。

实施例4稳定表达HEK 293F-Bir A细胞生产重组蛋白体内生物素化鉴定

按常规ELISA方法1ug/ml链霉亲和素(Streptavidin，SA，85878-5MG，Sigma)包被微孔板，4℃过夜；1％BSA室温封闭1小时；PBST洗涤3次，分别将蛋白SLN8023,SLN8024各5ug，5倍稀释，室温孵育 1小时；PBST洗涤3次，二抗anti-His-HRP(abcam，ab1187，1:5000)室温孵育1小时；PBST洗涤3次， TMB显色5分钟，终止后，酶标仪450nm读取OD值。GraphPad8.0软件分析实验数据。实验结果如说明书附图3显示：重组蛋白SLN8023,SLN8024均能与包被的SA结合，且信号值均呈现良好的浓度依赖性，结果提示SLN8023,SLN8024蛋白均有良好的生物素化。

实施例5稳定表达HEK 293F-Bir A细胞在蛋白质生产细胞内定点生物素化中的应用

例1：评估重组蛋白A和重组蛋白B在体外生物素化(biotin-protein A,biotin-protein B)和采用HEK 293F-Bir A细胞生产体内定点生物素化重组蛋白A和重组蛋白B(Avi-protein A,Avi-protein B)生物素化效率和生物学活性。

按常规ELISA方法1ug/ml蛋白包被微孔板，4℃过夜；1％BSA室温封闭1小时；PBST洗涤3次，分别将蛋白各30ug，3倍稀释，室温孵育1小时；PBST洗涤3次，二抗SA-HRP(Sigma，S5512-.1MG，1:5000) 室温孵育1小时；PBST洗涤3次，TMB显色5分钟，终止后，酶标仪450nm读取OD值。GraphPad 8.0 软件分析实验数据。实验结果如说明书附图4显示：体外生物素化标记的重组蛋白biotin-protein A, biotin-protein B比体内定点生物素化标记的重组蛋白Avi-protein A，Avi-protein B生物素化效率高。

体外和体内定点生物素化标记重组蛋白与受体结合生物学活性检测：按常规ELISA方法1ug/ml SA (85878-5MG，Sigma)包被微孔板，4℃过夜；1％BSA室温封闭1小时；PBST洗涤3次，分别将重组蛋白各30ug，3倍稀释，室温孵育1小时；PBST洗涤3次，受体-mFc蛋白1ug/ml，室温孵育1小时；PBST 洗涤3次，二抗anti-mFc-HRP(abcam，ab98717，1:5000)室温孵育1小时；PBST洗涤3次，TMB显色5 分钟，终止后，酶标仪450nm读取OD值。GraphPad 8.0软件分析实验数据。实验结果如说明书附图5显示：体内定点生物素化标记的重组蛋白Avi-protein A，Avi-protein B与受体结合能力明显优于体外生物素化标记的重组蛋白biotin-protein A,biotin-protein B。

序列表

<110> 领诺（上海）医药科技有限公司

<120> 稳定表达生物素连接酶 Bir A 的细胞株制备方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BirA 氨基酸序列

<400> 1

Met Lys Asp Asn Thr Val Pro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala Asn

1 5 10 15

Gly Glu Phe His Ser Gly Glu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met Ser

20 25 30

Arg Ala Ala Ile Asn Lys His Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly Val

35 40 45

Asp Val Phe Thr Val Pro Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro Ile

50 55 60

Gln Leu Leu Asn Ala Lys Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly Ser

65 70 75 80

Val Ala Val Leu Pro Val Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu Asp

85 90 95

Arg Ile Gly Glu Leu Lys Ser Gly Asp Ala Cys Ile Ala Glu Tyr Gln

100 105 110

Gln Ala Gly Arg Gly Arg Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly

115 120 125

Ala Asn Leu Tyr Leu Ser Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala

130 135 140

Ala Ala Ile Gly Leu Ser Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val

145 150 155 160

Leu Arg Lys Leu Gly Ala Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp

165 170 175

Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr

180 185 190

Gly Lys Thr Gly Asp Ala Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn

195 200 205

Met Ala Met Arg Arg Val Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile

210 215 220

Thr Leu Gln Glu Ala Gly Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala

225 230 235 240

Met Leu Ile Arg Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu

245 250 255

Gly Leu Ala Pro Tyr Leu Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile

260 265 270

Asn Arg Pro Val Lys Leu Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile

275 280 285

Ser Arg Gly Ile Asp Lys Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly

290 295 300

Ile Ile Lys Pro Trp Met Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu

305 310 315 320

Lys

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Avi-tag氨基酸序列

<400> 2

Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

1 5 10 15