生物素-蛋白连接酶(BirA酶)的基因克隆、原核表达和活性鉴定

摘要

由于 BirA 酶生物素化的能力，其作为一种重要的试剂已广泛用于蛋白质分子之间相互作用的研究，特别是细胞表面受体-配体相互作用的研究。　　 目的：构建生物素－蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体, 并在大肠杆菌 BL21 (DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。　　 方法：用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入 pET32a 中构建BirA酶－Trx融合蛋白基因的重组表达载体 pET32a–BirA。经测序验证后, 在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达, 通过 SDS-PAGE 电泳初步检测，筛选高表达菌株。对高表达菌株进行发酵罐高密度发酵表达，表达产物采用金属螯和柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirA substrate peptide，BSP)的VR111-BSP蛋白为底物, 用ELISA鉴定表达产物的生物素化活性，并研究了BirA酶生物学活性。　　 结果：构建了 pET32a–BirA 原核表达质粒, 并在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达分子量为51779的BirA酶－Trx融合蛋白。表达菌株在30升发酵罐上建立了高密度发酵工艺，发酵密度达到了80 g湿菌体/L发酵液，BirA酶表达量为2.62×107 U/g湿菌体。表达产物经金属螯和柱纯化后, 得到N端带有Trx标签的BirA 酶蛋白，纯度大于90％。EL ISA的结果显示, 表达产物能使底物VR111-BSP蛋白生物素化。并得到了BirA酶的米氏常数Km（19.4 μM/min）和最大反应速度Vmax（0.68 μM/min）。　　 结论：成功地制备了具有生物学活性的BirA酶, 与商业化产品相比具有低成本、高比活的优点。

目录

第一章 综述

第二章 BirA 酶基因表达载体的构建、原核表达

第三章 BirA 酶发酵工艺研究

第四章 BirA 酶纯化工艺的研究

第五章 BirA 酶的活性鉴定与研究

第六章 总结与展望

参考文献

致 谢

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