一种利用外泌体改善弱精症精子功能的方法

摘要

本发明公开了一种利用外泌体改善弱精症精子功能的方法，属于医学技术领域。该方法包括：正常人精浆外泌体的分离、弱精症精子的筛选与前处理、外泌体对弱精症精子的干预三个步骤。本发明通过利用来自人体自身的精浆外泌体在体外干预精子，改善精子运动能力等功能，以期通过人工受精等简单的非创伤手段干预和治疗弱精症，改善患者的生育结局。

说明书

技术领域

本发明属于医学技术领域，具体涉及一种利用外泌体改善弱精症精子功能的方法。

背景技术

男性生殖健康已成为当今人类社会密切关注的一个焦点问题。据WHO统计，全世界育龄夫妇的不育率为10-15%，其中，由男方因素导致的不育占一半左右。精子质量问题是导致男性不育的主要原因。流行病调查发现，弱精已经成为导致男性不育的一大类重要因素，且呈逐年上升趋势。弱精症是指由于精液中精子的前向运动百分率低于32%所导致的一类不育病（WHO第五版）。同时，弱精精子不仅存在前向运动能力降低，也伴随着其他精子功能的异常，如获能、超活化、顶体反应等，这些综合因素导致了男性不育。然而，由于导致弱精的病因复杂，发病机理尚不清楚，研究模型和手段也相对匮乏，目前尚缺乏有效的治疗手段。尽管可以通过非正常受孕方式（如卵细胞胞浆单精子显微注射技术、胚胎植入前遗传学诊断/筛查）产生子代，但试管婴儿的健康仍存在较大风险。因此，对弱精症患者进行常规治疗，使其通过自然方式或创伤较小的人工受精方式生育对人类健康具有重要的意义。

精液是由细胞（精细胞）和非细胞组分（精浆）组成。精浆富含脂质、糖、生长因子、转录因子和蛋白质等精子生命活动需求的各种物质，能够为精子生存与运动提供稳定和舒适的环境，还可作为运输精子到达女性生殖道受精部位的载体，它具有了几个重要的作用：为精子运输提供营养；够保护精子，防止其受到有害物质的感染；使精子克服阴道敌对的化学和免疫学环境。研究表明，精浆也含有大量外泌体，它们在射精时随前列腺分泌物排出，并参与到精子细胞的成熟与功能调控中，因此，外泌体在治疗弱精症中具有很大的潜力。

当前，急需开发一种毒副作用小且临床应用方便的治疗弱精症的方法，以改善精子功能，使患者经过干预后即可自然生育或利用创伤较小的人工受精方法生育。

发明内容

针对目前弱精症在临床上的常规治疗手段有限，且大部分病因不明的弱精症病还没有十分有效的治疗手段这一技术问题，本发明提供了一种利用外泌体改善弱精症精子功能的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术手段：

一种利用外泌体改善弱精症精子功能的方法，包括以下步骤：

步骤1，正常人精浆外泌体的分离：收集正常可育精液，12000 g离心10 min，去掉细胞和杂质，依次用0.45 μm和0.22 μm的微孔滤膜过滤精浆，去掉细胞碎片及大分子聚集物杂质，将2.5 mL的上清加入300 μL 含有20 mM Tris、30 wt.% 蔗糖和氧化氘的蔗糖垫溶液中100000 g、4℃超速离心90 min，收集上层清液在含有20 mM Tris、25 wt.% 蔗糖和氧化氘的的蔗糖垫溶液中100000 g、4℃超速离心5 h，将两次离心得到的外泌体混合后用HS溶液清洗一遍，将得到的外泌体用HS溶液溶解，调整为生理浓度的10倍后保存于-80℃备用；

步骤2，弱精症精子的筛选与前处理：将当天收集到的患者精液样本置于37℃恒温水浴中液化 60 min，吹打混匀，取10 µL液化后的精液，利用计算机辅助精液分析仪分析人精子的各项参数，筛选满足对弱精症的诊断参数要求的样本，并染色排除精子形态显著异常的样本；

步骤3，外泌体对弱精症精子的干预：用HS清洗弱精症精子两遍，每次1000 g、5min，加入精液体积90%的HS溶液或HTF溶液重悬精子，然后加入精液体积10%的外泌体，37℃孵育10 min，即可。

进一步地，步骤2中满足对弱精症的诊断参数要求的样本是指精子活力<32%的样本。

本发明通过利用来自人体自身的精浆外泌体在体外干预精子，改善精子运动能力等功能，以期通过人工受精等简单的非创伤手段干预和治疗弱精症，改善患者的生育结局。

附图说明

图1为外泌体对弱精症精子前向运动能力的提升结果。其中：HS为溶剂对照组，N-exosome为正常外泌体，A-exosome为弱精症来源的外泌体，HSA为人血清白蛋白阳性对照。

图2为外泌体对精子超活化能力的影响结果。其中：HTF为溶剂对照组，Exosome为正常外泌体。

图3为外泌体对精子爬高能力的影响结果。其中：HTF为溶剂对照组，N-exosome为正常外泌体，A-exosome为弱精症来源的外泌体，P4为孕酮。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

本发明中所采用的HS溶液配方为：135 mM NaCl，5 mM KCl，1 mM MgSO

HTF溶液配方为：93.8 mM NaCl，4.69 mM KCl，0.2 mM MgSO

实施例1

步骤1，正常人精浆外泌体的分离

具体分离方法如下：收集正常可育志愿者精液，12000 g离心10 min，去掉精子等细胞和其他杂质；依次用0.45 μm和0.22 μm的微孔滤膜过滤精浆，去掉细胞碎片及大分子聚集物杂质等；将2.5 mL的上清加入300 μL 含有20 mM Tris/30% sucrose/deuteriumoxide的蔗糖垫溶液中100000 g，4℃，超速离心90 min；上层液被收集后继续在含有20 mMTris/25% sucrose/deuterium oxide的蔗糖垫溶液中100000 g，4℃，超速离心5 h；将30%和25%蔗糖垫中的外泌体混合后用HS溶液清洗一遍（100000 g，4℃，超速离心90 min）；将得到的外泌体用HS溶解；最后进行BCA蛋白定量，将浓度调整为生理浓度的10倍后保存于-80℃备用。

步骤2，弱精症精子的筛选与前处理

将当天收集到的患者精液样本置于37℃恒温水浴中液化 60 min。吹打混匀，取10µL液化后的精液，利用计算机辅助精液分析仪（CASA）分析人精子的各项参数，筛选满足《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》第5版(WHO5)精液标准参数中对弱精症的诊断参数（精子活力<32%）要求的样本，并染色排除精子形态显著异常的样本。

步骤3，外泌体对弱精症精子的干预

用HS清洗弱精症精子两遍，每次1000 g，5 min；按照精液起始量的90%用HS重选精子（如2 mL的精液用1.8 mL的HS或HTF溶液重悬精子），然后加入10%的外泌体，37℃ 孵育10min。

之后，利用CASA分析经过外泌体处理的精子运动参数和超活化运动水平，从而评价外泌体对精子功能的改善水平。当精子的运动参数VCL>=150um，LIN<=50%，ALH>=7μm时，认为发生了超活化，超活化的百分比为发生超活化的精子数目/精子总数。

利用爬高实验检测精子穿透粘性介质的能力，具体方法入下：

精子的穿黏液能力模拟的是精子穿越雌性生殖道的能力，用1%的甲基纤维素模拟雌性生殖道的环境，因为精子只有穿越雌性生殖道后才能与卵子结合完成受精。外泌体和精子在HTF溶液中处理30 min后，毛细玻璃管中吸入，将含有20 μL 1%的甲基纤维素毛细管放入经过混匀的精子样本中，1h后在显微镜下记录毛细管中1, 2, 3cm处精子的数目。

由图1可以看出，生理浓度的正常外泌体可以显著增加精子的前向运动能力，相对于未加外泌体组，提高约60%，但是来源于严重弱精症的外泌体则没有此能力。由图2可以看出，外泌体可以显著增加精子的超活化运动水平（增加约60%）。此外，反应精子受精能力的另一个参数，穿粘液能力也显著被添加的外泌体所改善（图3，增加约70%），其效果类似于1μM孕酮产生的效应。这些数据表明，额外添加正常外泌体具有显著改善精子功能的作用，有望今后用于弱精症的治疗。