一种检测女性乳腺癌的miRNA标记物及其应用

摘要

本发明涉及检测女性乳腺癌的标志物技术领域，尤其涉及一种检测女性乳腺癌的miRNA标记物及其应用。标记物，其为miR‑98‑3p，其序列为SEQ ID NO.1：CUAUACAACUUACUACUUUCCC。以患者的血清或/血浆作为样品，测定样品中miRNA标记物的浓度，判断浓度是否在103pmol/L以上，即可确定是否患有乳腺癌。采用本发明的标记物，其具有更好的准确性。

说明书

技术领域

本发明涉及检测女性乳腺癌的标志物技术领域，尤其涉及一种检测女性乳腺癌的miRNA标记物及其应用。

背景技术

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤之一，也是导致女性癌症相关死亡的主要原因。据Globocan 2018年数据报道：在全球女性中，乳腺癌的发病率高达24.2％，而其死亡率也以15％居于女性癌症死亡原因首位。在我国，乳腺癌的发病率也呈逐年上升趋势。国家癌症中心陈万青教授发布的我国居民癌症现患数据显示我国女性乳腺癌的5年预期发病率已达156/10万人；同时，流行病学研究发现，我国年轻女性乳腺癌患者的比例显著高于西方，发病高峰足足比西方提前了10余年，这与欧美国家2/3以上患者发病时已是绝经后形成鲜明对比。指南上把年龄≤40岁定义为年轻乳腺癌的范畴，年轻患者通常具有高淋巴结转移率、高组织学级别、高临床分期、高三阴性比例、大肿块的“四高一大”特征，相对来说预后较差；而此结果可能与年轻女性不注重乳腺检查有关，同时也与当前医学界缺乏简单、便捷、有效的年轻女性乳腺癌检测手段息息相关。

乳腺X线摄影是欧美国家普遍开展的乳腺癌筛查手段，这使乳腺癌的死亡风险降低了16-20％。但我国女性发病年龄轻，乳腺小且致密，导致其对X线摄影的敏感度和特异度均较低，基于此种情况，超声检查成了我国女性筛查的主要手段之一。然而，现有的研究数据表明超声发现的乳腺癌中91.4％为浸润性癌，而X线摄影发现的乳腺癌中30.5％为原位癌，即超声漏诊的乳腺癌大部分是仅表现为钙化的原位癌，这就意味着虽然乳腺超声对乳腺癌检出率与X线摄影的乳腺癌检出率相当，但超声筛查对发现早期乳腺癌效能欠佳。目前，确诊乳腺癌主要靠病理检查，但是这种有创性检测并不适用于大规模临床筛查。

近年来的研究发现，血液标本中的不同成分常可作为恶性肿瘤早期诊断、预后预测及筛查的生物标志物，应用前景及其广泛。而miRNAs作为外周循环血液中的一种生物标志物，也是癌症体液活检的研究热点，独特的血清miRNAs有助于恶性肿瘤的早期发现和诊断，一些筛查产品正处于科学验证阶段，有的甚至已经进入临床验证阶段。

miRNAs是一类长约18-25个碱基的小分子非编码RNA，其可通过与靶基因的5’或3’UTR区结合从而参与调节基因的表达。其调控基因表达的方式主要是通过降解mRNA或抑制蛋白翻译过程,在许多生物学功能上都有着重要的作用。在乳腺癌组织中，miRNAs既可以作为癌基因也可以作为肿瘤抑制因子，循环miRNAs可能与疾病进展、治疗反应和患者生存率相关，这表明血清或血浆中miRNAs水平可作为非侵入性血液生物标记物。普遍认可的乳腺癌发生发展模型认为其过程一般是乳腺从单纯的上皮细胞过度增殖导致乳腺增生到导管原位癌(DCIS)，再到浸润性导管癌，而miRNAs在这一过程中扮演着重要的角色；据报道miR-21的上调在乳腺肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。此外，差异的miRNA谱除了可以区分正常组织和癌组织外，还可以成功地对特定癌症的不同亚型进行分类，特别是乳腺癌。而miRNA谱用来预测乳腺癌化疗、靶向治疗、内分泌治疗耐药也具有令人期待的应用前景。2017年Mitsuhashi等的研究就显示，三个miRNA(miR-183-5p、miR-194-5p和miR-1285-5p)可以单独或联合作为乳腺癌患者预后的准确生物标志物，具有良好的借鉴意义。在所以的乳腺癌患者中，年轻乳腺癌往往更具有侵袭性，分子分型以三阴性和her-2过表达为主，治疗过程中容易出现耐药现象。

目前，在乳腺癌相关文献中无相关miR-98-3p的报道。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种新的用于检测女性乳腺癌的miRNA标记物miR-98-3p，其具有很高的准确率。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明实施例提供一种用于检测女性乳腺癌的miRNA标记物，其为miR-98-3p，其序列为SEQ ID NO.1：CUAUACAACUUACUACUUUCCC。

第二方面，本发明实施例提供一种上述miRNA标记物的逆转录引物，其序列为SEQID NO.2：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGG GAAA。

第三方面，本发明实施例提供一种利用上述miRNA标记物检测女性乳腺癌的方法，其包括以下步骤：以患者的血清或/血浆作为样品，测定样品中所述miRNA标记物的浓度，判断浓度是否在10

可选地，血清或/血浆分离自外周血。

可选地，通过PCR的方法测定样品中的miRNA标记物的浓度；在PCR方法中，以miRNA为模板进行逆转录反应；

正向引物为SEQIDNO.3:CGCGGCCTATACAACTTACTACTTTCC；

反向引物为SEQIDNO.4:CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA。

第四方面，本发明实施例提供一种上述miRNA标记物在制备用于检测女性乳腺癌的试剂盒中的应用。

可选地，试剂盒中包括逆转录引物SEQ ID NO.2、正向引物SEQ ID NO.3、反向引物SEQ ID NO.4、逆转录酶、缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和探针。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

本发明提供的用于检测女性乳腺癌的miRNA标记物，其为miR-98-3p，其作为女性乳腺癌新的生物标志物，对于诊断女性乳腺癌其可以有很高的准确率。

其中，本发明miRNA标记物miR-98-3p通过PCR检测试剂盒可以准确的检测，可实现患者体外的快速检测，从而诊断女性乳腺癌。

附图说明

图1为miRNA进行PCR反应的标准曲线图；

图2为乳腺癌患者和健康患者通过实施例1方法得到的结果图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

本发明实施例提出的一种用于检测女性乳腺癌的miRNA标记物miR-98-3p，其序列为SEQ ID NO.1：CUAUACAACUUACUACUUUCCC。

其中所指的女性乳腺癌可以为Luminal A型、Luminal B型、HER2 Rich或TripleNegative型。

其中，所指的女性乳腺癌可以处于临床病期0期、I期、II期、III期或IV期。

本发明提供一种专门用于上述miRNA标记物的逆转录引物，其序列为SEQ IDNO.2：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGAAA。

其可以

本发明实施例提供一种利用上述miRNA标记物检测女性乳腺癌的方法，其包括以下步骤：以患者的血清或/血浆作为样品，测定样品中所述miRNA标记物的浓度，判断浓度是否在10

其中，血清或/血浆分离自外周血；其具有更高的准确率。

其中，通过PCR的方法测定样品中的miRNA标记物的浓度；在PCR方法中，以miRNA为模板进行逆转录反应；

逆转录引物为SEQIDNO.2：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGAAA；

正向引物为SEQ ID NO.3：

CGCGGCCTATACAACTTACTACTTTCC；

反向引物为SEQ ID NO.4：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA。

其中，以合成的miR-98-3p进行逆转录反应，制作miR-98-3p的标准曲线，检测来自受试者的样品中所述miRNA标记物的水平，其中若标记物的浓度超过10

本发明实施例提供一种上述miRNA标记物在制备用于检测女性乳腺癌的试剂盒中的应用。

试剂盒中包括逆转录引物SEQ ID NO.2、正向引物SEQ ID NO.3、反向引物SEQ IDNO.4、逆转录酶、缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和探针。

其中，探针为SYBR green。

为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1

试剂盒中包括逆转录引物SEQ ID NO.2：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGAAA、

正向引物为SEQ ID NO.3：GCGGCCTATACAACTTACTACTTTCC、

反向引物为SEQ ID NO.4：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA、

逆转录酶、缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和探针。

利用本实施例所述试剂盒检测的方法，其具体的步骤为：

S1血清样本miRNA的提取：从患者的外周血中分离出血清，往300ul血清中加入等体积TRIZOL并剧烈震荡10s，充分混匀后，4℃静置5min；加入100ul氯仿，剧烈震荡15s，4℃静置5min；4℃，14000g离心15min，吸取上层水相至一新EP管中；加入300ul异丙醇，上下颠倒混匀后于4℃静置10min,；4℃，12000g离心10min；弃去上清后加入1ml的质量浓度为75％乙醇清洗RNA沉淀；4℃，8500g，离心5min；弃去上清，留下管底RNA沉淀，干燥后加入10ulDEPC水溶解后保存于-80℃冰箱；

S2 miRNA逆转录及荧光定量PCR：以miRNA为模板进行逆转录反应，按照以下比例配置逆转录反应体系：

10X Reaction buffer 1.50ul，逆转录引物3.00ul，逆转录酶分别1.00ul，100mMdNTPs 0.50ul，待检测miRNA 1.00ul，无菌双蒸水3.00ul；配置好体系后短暂离心，进行逆转录反应；逆转录结束后按照SYBR green master mix说明书进行荧光定量PCR检测。所制作的逆转录引物序列如下：

SEQ ID NO.2：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGAAA、

在PCR中使用的正向引物为：

SEQIDNO.3：CGCGGCCTATACAACTTACTACTTTCC；

在PCR中使用的反向引物如下：

SEQ ID NO.4：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA；

逆转录反应条件如下：

16℃/30分钟；

42℃/30分钟；

85℃/5分钟；

4℃/∞；

荧光定量PCR反应条件为：

50℃/2分钟；

95℃/10分钟；

(95℃/15秒→60℃/1分钟，检测荧光)ⅹ40循环

S3标准曲线的制作：将合成的miR-98-3p的cDNA稀释成一下浓度：10pmol/L、100pmol/L、10

50℃/2分钟

95℃/10分钟

(95℃/15秒→60℃/1分钟，检测荧光)ⅹ40循环

以cDNA浓度log10的对数值为横坐标，以Q-PCR检测的Ct值为纵坐标，制作标准曲线。

通过本实施例得到如图1所示的标准曲线。

S4将步骤S1得到的血清按照步骤S3的方法测定检测来自受试者的样品中所述miRNA标记物的水平，其中若标记物的浓度超过10

试验1

为了确认所述miRNA标记物的有效性进行以下试验：

挑选80例乳腺癌患者和88例健康人群按照实施例1的方法进行检测血清中miR-98-3p的表达水平，其结果如图2所显示：80例乳腺癌患者血清中miR-98-3p的表达量均高于10

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。