一种检测全血中免疫抑制剂药物的方法

摘要

本发明提供一种检测全血中免疫抑制剂药物的方法，所述免疫抑制药物为依维莫司和西罗莫司，其特征在于，所述方法包括对全血样品进行提取后采用HPLC‑MS法检测分析，其中，提取液为三氟醋酸和氟化铵的甲酸溶液。本发明的方法解决了现有或常规方法采用有机溶剂蛋白沉淀提取药物在上机检测过程中对人员和环境产生危害、储存和回收成本高，以及提取药物信号和灵敏度低的问题，尤其对免疫抑制剂药物中的依维莫司和西罗莫司信号低达不到检测要求的问题，并且本发明的方法线性良好可行性高。

说明书

技术领域

本发明涉及血药监测技术领域，具体涉及一种检测全血中免疫抑制剂药物的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

依维莫司和西罗莫司属于免疫抑制剂类药物，主要用于抗器官移植排斥反应，还可应用于治疗某些自身免疫性疾病，临床应用较广。由于免疫抑制剂类药物在人体中生物利用度个体差异大，血药浓度与疗效及毒性密切相关，且血药浓度易被多方面因素影响。因此，定时对患者体内依维莫司和西罗莫司的血药浓度监测，制定个体化给药方案，对提高器官移植的存活率，促进免疫抑制剂类药物在临床的合理应用具有重要的临床意义。

目前临床或实验室诊断方法有荧光偏振免疫法、化学发光微粒子免疫检测法、高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-紫外检测法、均相酶免疫法等，其中HPLC-MS方法越来越受到关注。样本预处理简单，样品需要量少，不需水解及衍生化，是临床常规检测的理想选择方法。其中依维莫司和西罗莫司等药物在人体中参考范围较低，检测信号低，部分文献采取简单的有机溶剂蛋白沉淀法，部分文献报道采取萃取方法，操作方法复杂费时。

血液样本成分复杂，含有大量的内源性大分子，使得分析结果易受基质效应的影响，因此在分析前需要对样本进行适当地预处理，将待测组分从生物样本基质中分离出来，以降低基质效应的影响。

简单的有机溶剂蛋白沉淀并不能完全去除杂质，且长期使用有机溶剂有一定毒性，易对操作人员和环境造成不可逆性损害，且有机溶剂的使用、回收和存储都比较麻烦，增加了检测成本；在进行定量分析时，杂质的存在严重影响检测结果的准确性。而过于复杂的提取方法如液相、固相萃取技术操作繁琐，且检测成本过高，不适合市场化大规模推广。因此样本提取技术就成为提高分析测定效率、改善和优化检测分析的重要环节。

发明内容

为了改善现有技术的不足，本发明提供了一种检测全血中免疫抑制剂药物的方法，解决了现有或常规方法采用有机溶剂蛋白沉淀提取药物在上机检测过程中对人员和环境产生危害、储存和回收成本高，以及提取药物信号和灵敏度低的问题，尤其对免疫抑制剂药物中的依维莫司和西罗莫司信号低达不到检测要求的问题，并且本发明的方法线性良好可行性高。

具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种检测全血中免疫抑制剂药物的方法，所述免疫抑制药物为依维莫司和西罗莫司，其中，所述方法包括对全血样品进行提取后采用HPLC-MS法检测分析，其中，提取液为三氟醋酸和氟化铵的甲酸溶液。

在本发明的实施方式中，本发明的提取液不会使样品立刻沉淀为一团，而是呈现出蓬松絮状、利于涡旋混匀，而且缩短涡旋混匀时间，使得提取更为充分，能够有效去除杂质，降低基质效应，增强待测物质的离子化效率，有效提高依维莫司和西罗莫司的信号。尤其是，经过优化，发明人发现提取液中三氟醋酸体积分数为0.01-0.05％，氟化铵的浓度为0.1-0.5mM，三氟醋酸体积分数优选为0.025％，氟化铵的浓度优选为0.4mM时效果较优，在本发明的一些实施方式中，相较于常规的提取方法，比如加入乙腈/硫酸锌沉淀剂，使用本发明的提取液可使得分析物西罗莫司的峰面积至少提升5.9倍，依维莫司的峰面积至少提升6.5倍。

在本发明的实施方式中，所述提取方法包括：使用提取液对全血进行提取后涡旋离心，然后取上清液氮吹浓缩至吹干，然后加入复溶液进行复溶。

在本发明的实施方式中，相较于常规使用的普遍认为更利于涡旋离心的1.5mL尖底离心管，发明人选用了2mL圆底离心管，结果发现，使用2mL圆底离心管时，样品与提取液更能充分反应混悬，而且离心管底部不存在紧实团状物，蛋白沉淀更为完全，能够有效去除杂质，降低基质效应，提高了沉淀效率，进而提高信号相应，在一些实施方式中，该效果提升可达至少2倍；以及，蛋白沉淀离心后上清液澄清，取足量上清液时不易吸取到沉淀残渣，无需进一步离心，简化操作步骤、节约时间，在本发明的一些实施方式中，将样品溶液涡旋3-10min，离心机转速为12000r/min；离心2-5min即可；此外，样品预处理干净，后期不会存在堵塞色谱柱、仪器管路和损坏仪器的现象，降低检测和维护成本。

在本发明的一些实施方式中，所述复溶液为含有三氟醋酸和氟化铵的甲醇和水的混合溶液。

在本发明的一些实施方式中，复溶液中水与甲醇的体积比为7:7-7:1，优选为7:3。

本发明的复溶液中加入了三氟醋酸和氟化铵，相较于普通的复溶液，比如甲醇和水的混合溶液，能够进一步改善提取效果，尤其是，复溶液中三氟醋酸体积分数为0.01-0.05％，氟化铵的浓度为0.1-0.5mM，该改善效果更为明显，其中，在本发明的一些实施方式中，复溶液中三氟醋酸体积分数为0.025％，氟化铵的浓度为0.4mM时，能够较好的提高依维莫司和西罗莫司的信号响应，以峰面积计，对于分析物依维莫司和西罗莫司的提升可达2.4倍。

在本发明的实施方式中，HPLC-MS分析时，流动相A为含有三氟醋酸和氟化铵的HPLC级水，流动相B为含有三氟醋酸和氟化铵的甲醇。

在本发明的实施方式中，本发明的流动相可进一步提升依维莫司和西罗莫司的信号同时还能够改善峰形。尤其是，流动相A和B中含有的三氟醋酸体积分数为0.01-0.05％，氟化铵的浓度为0.1-0.5mM时改善效果更优；在本发明的一些实施方式中，当流动相A和B中含有的三氟醋酸体积分数为0.025％，氟化铵的浓度为0.4mM时，与常规的流动相比如流动相A为含0.1％甲酸10mM乙酸铵的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的甲醇溶液相比，分析物依维莫司的峰面积能够提升至少2倍，分析物西罗莫司的峰面积能够提升至少4.3倍。

在本发明的实施方式中，检测时的色谱条件为：

色谱柱：ZORBAX SB C18(2.1mm×50mm,3.5μm)；

柱温：40-70℃，优选60℃；

流动相A：0.025％三氟醋酸和0.4mM氟化铵的HPLC级水，流动相B：0.025％三氟醋酸和0.4mM氟化铵的甲醇；

梯度洗脱条件：0-1.0min，2％流动相B；1.0-1.1min，2％-98％流动相B；1.1-3.5min，98％流动相B；3.5-3.6min，98％-2％流动相B；3.6-5min，2％流动相B。

流速：0.2-0.5mL/min，优选0.4mL/min；

进样量2-8uL，优选5uL。

在本发明的实施方式中，检测时的质谱条件为：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，喷雾电压4000V：去溶剂温度：315℃，采用MRM模式采集数据；

优选地，分析物依维莫司的母离子为975.512m/z，子离子为908.333m/z，透镜电压为203V，碰撞能量为15.12V；

分析物西罗莫司的母离子为931.462m/z，子离子为864.375m/z，透镜电压为180V，碰撞能量为18.95V。

本发明的上述方法能够提升分析物依维莫司和西罗莫司在全血中的提取效果，提升分析检测时的分析物信号，并且绘制得到的标准曲线图相关系数R2均大于0.99，线性良好。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种检测全血中免疫抑制剂药物的试剂盒，所述免疫抑制药物为依维莫司和西罗莫司，所述试剂盒包括提取液、复溶液和流动相溶液；

其中，所述提取液为三氟醋酸和氟化铵的甲酸溶液；提取液中三氟醋酸体积分数为0.01-0.05％，氟化铵的浓度为0.1-0.5mM；进一步地，在一些优选的实施方式中，提取液中三氟醋酸体积分数为0.025％，氟化铵的浓度为0.4mM。

所述复溶液为含有三氟醋酸和氟化铵的甲醇/水混合溶液；复溶液中水与甲醇的体积比为7:7-7:1，优选为7:3。在本发明的一些实施方式中，复溶液中三氟醋酸体积分数为0.01-0.05％，氟化铵的浓度为0.1-0.5mM；优选为三氟醋酸体积分数为0.025％，氟化铵的浓度为0.4mM。

所述流动相溶液包括流动相A和流动相B：流动相A为含有三氟醋酸和氟化铵的HPLC级水，流动相B为含有三氟醋酸和氟化铵的甲醇；流动相A和B中含有的三氟醋酸体积分数为0.01-0.05％，氟化铵的浓度为0.1-0.5mM；优选为三氟醋酸体积分数为0.025％，氟化铵的浓度为0.4mM。

通过上述技术手段，可实现以下有益效果：

(1)本发明的方法提取并分析全血中的免疫抑制剂药物，相比传统液液萃取和固相萃取方法操作更简单快速，样品用样量少，试剂消耗少，提取效果更佳。

(2)本发明采用特定的提取液利用等电点原理进行提取，相对于文献报道的利用常规有机溶剂的蛋白沉淀法，蛋白沉淀和除杂更加彻底，同时避免了有机溶剂对人员和环境的不可逆性伤害，减少了后期回收处理有机试剂的工作量和成本。

(3)本发明发现利用2mL圆底离心管进行蛋白沉淀相比于常规的1.5mL尖底离心管进行蛋白沉淀时，样品与蛋白沉淀剂能充分混悬，不存在团状物，均为细小颗粒状，蛋白沉淀更为完全，离心后沉淀紧实且上清液澄清，取足量上清液时不易吸取到沉淀固体。沉淀充分和足量上清，协同明显提高依维莫司和西罗莫司药物的提取效果。

(4)本发明的方法加入在提取液和复溶液中加入一定浓度的三氟醋酸和氟化铵后，能够明显增强离子化效率，可以明显提高依维莫司和西罗莫司药物的提取效果。以及，液相方法流动相中加入一定浓度的三氟醋酸和氟化铵后也可以明显提高依维莫司和西罗莫司药物的信号，满足检测要求。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为实施例1的依维莫司的信号图。

图2为实施例1的西罗莫司的信号图。

图3为对比例1的依维莫司的信号图。

图4为对比例1的西罗莫司的信号图。

图5为对比例2采用1.5mL尖底离心管涡旋离心处理后的效果。

图6为实施例1采用2mL圆底离心管涡旋离心处理后的效果。

图7为对比例2的依维莫司的信号图。

图8为对比例2的西罗莫司的信号图。

图9为对比例3的依维莫司的信号图。

图10为对比例3的西罗莫司的信号图。

图11为对比例4的依维莫司的信号图。

图12为对比例4的西罗莫司的信号图。

图13为实施例2的依维莫司的标准曲线图，其中，相关系数R2＝0.9950，标准曲线方程为Y＝8.604E-2X+5.931E-2，即Y＝0.08604X+0.05931。

图14为实施例2的西罗莫司的标准曲线图，其中，相关系数R2＝0.9992，标准曲线方程为Y＝2.331E-2X+1.444E-2，即Y＝0.02331X+0.01444。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B，同时存在A和B三种情况，本文中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，A/和B，可以表示：单独存在A，单独存在A和B两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本文使用的术语仅用于描述特定实施例，并且不意在限制本发明的示例实施例。如本文所使用的，单数形式“一”、“一个”以及“该”意在包括复数形式，除非上下文明确指示相反意思。还应当理解术语“包括”、“包括了”、”包含”、和/或“包含了”当在本文中使用时，指定所声明的特征、整数、步骤、操作、单元和/或组件的存在性，并且不排除一个或多个其他特征、数量、步骤、操作、单元、组件和/或他们的组合的存在或增加。

应当理解，尽管在本发明可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在……时”或“当……时”或“响应于确定”。

此外，特定特征、结构、功能或特性可以以任何适合的方式组合到一个或多个实施例中。例如，第一实施例(实施例1)可以结合第二实施例(实施例2)，只要与这两个实施例相关联的特定特征、结构、功能或特性不互相排斥。

本发明全血样品取自同时使用了依维莫司和西罗莫司的病患，于下一次给药前采血用于检测。

1、全血样品中免疫抑制剂药物依维莫司和西罗莫司的提取

(1)向2mL圆底离心管中加入20μL全血样品，加2mL提取液，提取液成分为含有一定浓度的三氟醋酸和氟化铵的甲酸溶液，三氟醋酸体积分数为0.025％，氟化铵浓度为0.4mM。

(2)将上述样品溶液涡旋10min，离心机转速为12000r/min；离心5min。

(3)取离心后取上清至96孔接收板中，氮吹浓缩至吹干。

(4)加入100μL复溶液，混匀，复溶液成分为水、甲醇、三氟醋酸、氟化铵的混合液，水：甲醇＝7:3(三氟醋酸体积分数为0.025％，氟化铵浓度为0.4mM)。

(5)覆上铝箔封膜，供色谱进样分析。

2、仪器方法

包括色谱条件和质谱方法，具体为：

(1)色谱条件为：色谱柱：ZORBAX SB C18(2.1mm×50mm，3.5μm)；柱温：60℃；流动相A：0.025％三氟醋酸和0.4mM氟化铵的HPLC级水，流动相B：0.025％三氟醋酸和0.4mM氟化铵的甲醇；梯度洗脱条件：0-1.0min，2％流动相B；1.0-1.1min 2％-98％流动相B；1.1-3.5min 98％流动相B；3.5-3.6min 98％-2％流动相B；3.6-5min 2％流动相B。流速：0.4mL/min；进样量5μL；

表1梯度洗脱程序

质谱条件：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，喷雾电压4000V：去溶剂温度：315℃，采用MRM模式采集数据，条件如表2所示：

其中，依维莫司和西罗莫司的信号图如图1和图2所示，峰面积如表3所示。

表3分析物峰面积

全血样品中免疫抑制剂药物依维莫司和西罗莫司的提取：取100μL全血，加入300μL沉淀剂(乙腈：0.1M硫酸锌溶液＝7∶3)(含内标)沉淀蛋白，涡旋混匀，静置10min，于13000rpm，离心10min，取上清液75μL，HPLC-MS分析，色谱条件和质谱方法同实施例1。

其中，依维莫司和西罗莫司的信号图如图3和图4所示，峰面积如表4所示。

如表4所示，实施例1的方法相较于对比例1可以明显提高依维莫司和西罗莫司的信号，相对于对比例1依维莫司信号提高了6.5倍，西罗莫司的信号提高了5.9倍。

表4分析物峰面积比较

与实施例1的区别在于将2mL圆底离心管替换为常规1.5mL尖底离心管，其他过程与实施例1相同。依维莫司和西罗莫司的信号图如图7、图8所示。

采用常规1.5mL尖底离心管提取时，样品涡旋混匀不彻底，管底部存在紧实团状物，离心后吸取足量上清液时极易吸取到沉淀颗粒物，效果如图5所示，而实施例1采用2mL圆底离心管提取时，样品充分混匀，管底部未见紧实团状物，取足量上清时不会吸取到沉淀残渣，效果如图6。

如表5所示，实施例1的方法相较于对比例2可以明显提高依维莫司和西罗莫司的信号，依维莫司的信号提高了2.0倍，西罗莫司的信号提高了2.2倍。

表5分析物峰面积比较

与实施例1的区别在于，复溶液采用甲醇与水的混合溶液(水：甲醇＝7:3)，不添加三氟醋酸和氟化铵。其他过程与实施例1相同。依维莫司和西罗莫司的信号图如图9、图10所示。

如表6所示，实施例1的方法相较于对比例3可以明显提高依维莫司和西罗莫司的信号，依维莫司提取效果提高了2.5倍，西罗莫司提高了2.4倍。

表6分析物峰面积比较

与实施例1的区别在于流动相不同，流动相A：含0.1％甲酸10mM乙酸铵的水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的甲醇溶液。

其他过程与实施例1相同。依维莫司和西罗莫司的信号图如图11和图12所示。

如表7所示，实施例1的方法相较于对比例4可以明显提高依维莫司和西罗莫司的信号，依维莫司信号提高了2.1倍，西罗莫司信号提高了4.3倍。

表7分析物峰面积比较

向配制全血中添加依维莫司和西罗莫司的混标，使依维莫司、西罗莫司浓度为100ng/mL。采用配制全血为稀释液依次对配制全血混标液按1:1等比稀释，共6个浓度梯度，用实施例1的方法提取样本，上机检测，仪器方法同实施例1。

用数据处理软件对数据处理，计算并绘制标准曲线，其中，依维莫司和西罗莫司的标准曲线图如图13和图14所示，相关系数R2均大于0.99，满足线性要求。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。