一种香水柠檬叶精油的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种香水柠檬叶精油的制备方法及其应用，涉及香水柠檬应用领域。所述香水柠檬叶精油的制备方法，包括以下步骤：(1)香水柠檬叶预处理；(2)采用水蒸气蒸馏法提取步骤(1)中选取的香水柠檬叶；其中，所述水蒸气蒸馏法，包括如下步骤：(a)将步骤(1)中预处理后的香水柠檬叶和水混合，进行蒸馏，得到提取液；(b)将步骤(a)中的提取液分液处理，并加入干燥剂，经过微孔滤膜过滤后，得到所述香水柠檬叶精油。本申请提供了一种低毒、安全、绿色的香水柠檬叶精油的制备方法。

说明书

技术领域

本发明涉及香水柠檬应用领域，尤其是一种香水柠檬叶精油的制备方法及其应用。

背景技术

柠檬(学名：Citrus limon(L.)Burm.f.)，为双子叶植物纲芸香科柑橘属植物，原产东南亚，主要产地为美国、意大利、西班牙和希腊。柠檬叶含有有机酸、挥发油、维生素C及叶绿素等组分。在我国柠檬叶里的有效成分主要应用在食品及日用化工方面，如作为食品中的增味剂直接使用在冰淇淋、糖果、饮料、烘烤食品等食品中；作为活性成分应用于化妆品、肥皂、洗涤剂等日用化工领域。在人体生理功效杀虫、杀菌领域只有少量研究。柠檬叶的开发和应用主要在国外研究较多，国内的开发研究还处于起步阶段，且产品开发研究较单一，效益较低，无论是国内外对于柠檬叶都还存在极大的开发利用空间。

香水柠檬是柠檬的主要品种，原产东南亚，在我国大部分地区都有普遍的种植。香水柠檬树生长旺盛，开花性强，为了保证座果率和养分分配，一年内要对柠檬树进行多次的修剪，每个果园每年都会产生大量的修剪弃叶，而果农对于这些弃叶的处理方法一般都是将其堆积在果园，待其干枯后焚烧掉，不但耗时、耗空间还污染环境。国内外都没有发现对这些香水柠檬叶进行合理的开发利用，造成了很大的资源浪费现象。现有的化学合成类防抗蚊产品对人体具有一定的毒性；现有的植物精油类防抗蚊产品作用效果单一，只具有单一的驱蚊功能，而且效果并不明显。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种低毒、安全、绿色的香水柠檬叶精油的制备方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种香水柠檬叶精油的制备方法，包括以下步骤：(1)香水柠檬叶预处理；(2)采用水蒸气蒸馏法提取步骤(1)中选取的香水柠檬叶；

其中，所述水蒸气蒸馏法，包括如下步骤：(a)将步骤(1)中预处理后的香水柠檬叶和水混合，进行蒸馏，得到提取液；(b)将步骤(a)中的提取液分液处理，并加入干燥剂，经过微孔滤膜过滤后，得到所述香水柠檬叶精油。

本发明通过对香水柠檬叶进行简单蒸馏处理，得到了香水柠檬叶精油，实现了废弃资源的再利用，以及促进了可持续发展农业的发展。

优选地，所述步骤(a)中，香水柠檬叶和水的质量体积比为：香水柠檬果：水＝1g:(4～10)mL，蒸馏的温度为94～114℃，蒸馏的时间为0.5～3.0h；进一步优选地，所述步骤(a)中，香水柠檬叶和水的质量体积比为：香水柠檬果：水＝1g:4mL，蒸馏的温度为103～104℃，蒸馏的时间为1.5～2.0h。

优选地，所述步骤(b)中，干燥剂为无水硫酸钠，微孔滤膜的孔径为0.10～0.50 μm；进一步优选地，微孔滤膜的孔径为0.25μm。

此外，本发明提供了一种采用上述的制备方法制备得到的香水柠檬叶精油。

优选地，所述的香水柠檬叶精油，包含以下成分：右旋萜二烯、3,7-二甲基 -6-辛烯醛、3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇和3,7-二甲基-6-辛烯乙酸酯。

进一步优选地，所述的香水柠檬叶精油，包含以下质量分数的成分：右旋萜二烯12.24％、3,7-二甲基-6-辛烯醛78.35％、3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇7.15％和 3,7-二甲基-6-辛烯乙酸酯1.82％。

进一步地，本发明提供了所述香水柠檬叶精油在驱蚊、抗菌产品中的应用。

优选地，所述香水柠檬叶精油的质量浓度为0.0725～0.166g/mL(g)

相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)实现废弃资源利用，还能促进可持续发展农业的发展；(2)作为一种天然产物，香水柠檬叶精油在具有低毒、安全、绿色的特性，具有传统化学防抗蚊药物无法比拟的优势；(3)香水柠檬叶精油具有抗蚊、抗菌双功能性。

附图说明

图1为香水柠檬叶精油对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的抑制效果图；

图2为香水柠檬叶精油对表皮葡萄球菌(ATCC12228)的抑制效果图；

图3为香水柠檬叶精油对白色葡萄球菌(ATCC29213)的抑制效果图；

图4为香水柠檬叶精油和溴氰菊酯对白纹伊蚊成蚊毒性拟合结果图；图(a) 为香水柠檬叶精油拟合结果图，图(b)为溴氰菊酯拟合结果图；

图5为右旋萜二烯和3,7-二甲基-6-辛烯醛对白纹伊蚊幼虫毒性拟合结果图；图(c)为右旋萜二烯拟合结果图，图(d)为3,7-二甲基-6-辛烯醛拟合结果图；

图6为香水柠檬叶精油的GC-MS谱图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本申请所述香水柠檬叶精油的制备方法，包括如下步骤：(1)香水柠檬叶预处理；(2)采用水蒸气蒸馏法提取步骤(1)中选取的香水柠檬叶；

其中，所述水蒸气蒸馏法，包括如下步骤：(a)将步骤(1)中预处理后的香水柠檬叶和水混合，其中，香水柠檬叶和水的质量体积比为：香水柠檬果：水＝1g:4mL，进行蒸馏，蒸馏的温度为103℃，蒸馏的时间为2h，得到提取液；(b)将步骤(a)中的提取液分液处理，并加入干燥剂，经过微孔滤膜过滤后，微孔滤膜的孔径为0.25μm，得到所述香水柠檬叶精油。

实施例2

本申请所述香水柠檬叶精油的制备方法，包括如下步骤：(1)香水柠檬叶预处理；(2)采用水蒸气蒸馏法提取步骤(1)中选取的香水柠檬叶；

其中，所述水蒸气蒸馏法，包括如下步骤：(a)将步骤(1)中预处理后的香水柠檬叶和水混合，其中，香水柠檬叶和水的质量体积比为：香水柠檬果：水＝1g:10mL，进行蒸馏，蒸馏的温度为94℃，蒸馏的时间为3h，得到提取液； (b)将步骤(a)中的提取液分液处理，并加入干燥剂，经过微孔滤膜过滤后，微孔滤膜的孔径为0.5μm，得到所述香水柠檬叶精油。

实施例3

本申请所述香水柠檬叶精油的制备方法，包括如下步骤：(1)香水柠檬叶预处理；(2)采用水蒸气蒸馏法提取步骤(1)中选取的香水柠檬叶；

其中，所述水蒸气蒸馏法，包括如下步骤：(a)将步骤(1)中预处理后的香水柠檬叶和水混合，其中，香水柠檬叶和水的质量体积比为：香水柠檬果：水＝1g:6mL，进行蒸馏，蒸馏的温度为114℃，蒸馏的时间为0.5h，得到提取液； (b)将步骤(a)中的提取液分液处理，并加入干燥剂，经过微孔滤膜过滤后，微孔滤膜的孔径为0.1μm，得到所述香水柠檬叶精油。

本发明采用实施例1所述制备方法制备得到的香水柠檬果纯精油，进行效果验证，具体如下所示，实施例2和3所述制备方法制备得到的香水柠檬果纯精油，其效果与实施例1相似，在此不一一赘述：

试验例1香水柠檬叶精油抑菌圈测定

试验方法为：以DMSO为溶剂配制香水柠檬叶精油样品溶液浓度为 512mg/mL，并设立DMSO为空白对照，加替沙星药物为阳性对照，通过滤纸片－琼脂扩散法测定。实验时往涂布好细菌的培养基上铺上6mm的灭菌滤纸片，再往滤纸片上滴加5μL的样品溶液，空白组滴加5μL的DMSO溶剂。培养基放置在恒温培养箱内，37℃培养24h后观察结果

试验结果：结果如表1所示

表1香水柠檬叶精油抑菌圈活性结果

注：DMSO空白对照组无抑菌圈出现，表明DMSO无抑菌效果，即以DMSO 为溶剂配制样品不会影响实验结果的准确性。

试验例2香水柠檬叶精油最小抑菌浓度MIC测定

试验方法：以DMSO为溶剂配制香水柠檬叶精油样品溶液浓度为512、256、 128、64、32、16、8mg/mL，并设立空白对照、DMSO阴性对照和加替沙星药物阳性对照，用96孔板测定，其中样品组每个微孔加5μL样品液和195μL菌悬液，空白组加5μL DMSO和195μL液体培养基。微孔板放置恒温培养箱内，37℃培养16～24h后观察结果，根据微孔的浑浊现象和样品液浓度确定最终浓度，即最小抑菌浓度MIC值。

试验结果：结果如表2所示

表2香水柠檬叶精油最小抑菌浓度MIC结果

试验例3香水柠檬叶精油最小杀菌浓度MBC测定

试验方法：从测定MIC的微孔中选取无细菌生长的微孔，取50μL涂布于平板培养基上，放置37℃恒湿培养箱内，培养24h后观察结果，无细菌生长的香水柠檬叶精油浓度为MBC值。

试验结果：结果如表3所示

表3香水柠檬叶精油最小杀菌浓度MBC结果

试验例4香水柠檬叶精油抑菌动力学测定

试验方法：根据所测定的MIC值设定实验浓度，设0.5倍MIC、1倍MIC、 2倍MIC，并设立DMSO阴性对照和加替沙星药物阳性对照，用96孔板测定，放37℃恒培养温箱中培养24h，并利用多功能酶标仪每隔1个小时检测一次细菌的生长情况(测定OD值)，连续监测24h。

试验结果：结果如图1～3所示，案例1～4表明，在高浓度情况下，香水柠檬叶精油对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、表皮葡萄球菌这三种细菌(革兰氏阳性菌)具有明显的抑菌活性。

试验例5香水柠檬叶精油毒杀白纹伊蚊幼虫活性测定

试验方法：以丙酮为溶剂配制香水柠檬叶精油样品溶液，并以丙酮设立空白对照，同时以阳性药物溴氰菊酯作对比，采用24孔板高通量法测定。实验过程中的温湿度变化范围为：26.5℃～28℃、60％～80％。实验时吸取5条三龄末至四龄初的白纹伊蚊幼虫放置在24孔板的测试孔中，用吸管尽量吸干净幼虫带进去的水体；加入985μL的纯水；加入13mg/mL的饲料溶液5μL；加入10μL 配制好的的柠檬叶精油样品液，使柠檬叶精油测试终浓度介于150～550ppm之间(1ppm＝1mg/L)；最后盖上24孔板的盖子，轻轻摇晃24孔板，使溶液混合均匀；将24孔板转移至恒温恒湿培养箱中，设定日间温湿度为：28℃&80％，夜间温湿度为：27.5℃&75％，培养24小时后，清点白纹伊蚊幼虫的死亡情况；利用Origin 8.5软件进行非线性拟合，得出回归方程，评估其急性毒性。

注：丙酮空白对照组中白纹伊蚊幼虫无死亡情况，表明丙酮对白纹伊蚊幼虫无灭杀效果，即以丙酮为溶剂配制样品不会影响实验结果的准确性。

试验结果：结果如表4～5所示

表4香水柠檬叶精油对白纹伊蚊幼虫灭杀结果

表5香水柠檬叶精油对白纹伊蚊幼虫急性毒性结果

由表4～5可知，香水柠檬叶精油可以杀死白纹伊蚊幼虫，且具有剂量依赖性。

试验例6香水柠檬叶精油毒杀白纹伊蚊成蚊活性测定

试验方法：以丙酮为溶剂配制香水柠檬叶精油样品溶液，并以丙酮设立空白对照，同时以阳性药物溴氰菊酯作对比，采用Tarsal测试法测定。实验时，吸取1000μL的各浓度梯度的柠檬叶精油样品液滴加在底面积为20cm

试验结果：结果如表6～7所示

表6香水柠檬叶精油对白纹伊蚊成蚊灭杀结果

表7香水柠檬叶精油对白纹伊蚊成蚊急性毒性结果

由表6～7、图4可知，香水柠檬叶精油可以杀死白纹伊蚊成蚊，且具有剂量依赖性。

试验例7香水柠檬叶精油成分分析

试验方法：通过气相色谱-质谱联用法(GC-MS)对香水柠檬叶精油进行定性、定量分析。采用峰面积归一化法计算精油中各组分的峰面积相对质量分数，然后选取相对质量分数大于0.1％的化学成分进行分析。与正构烷烃标准品对照品C

试验结果：GC-MS谱图如图6所示，香水柠檬叶精油主要成分如表8所示

表8香水柠檬叶精油主要成分

试验例8香水柠檬叶精油主要成分毒杀白纹伊蚊幼虫、成蚊活性测定

采用与实验例5、例6相同的方法对香水柠檬叶精油中的右旋萜二烯、3,7- 二甲基-6-辛烯醛两种主要成分进行单一成分的毒杀白纹伊蚊幼虫、成蚊活性测定。值得注意的是：由于右旋萜二烯单一成分具备强挥发性，测试以丙酮与苯基硅油的体积配比为10:1的混合液作为溶剂配制不同浓度的右旋萜二烯样品溶液，且由空白组可确定以丙酮和苯基硅油的混合液作为溶剂不会影响实验结果的准确性。由于单一成分对成蚊活性较低，只进行测试不进行结果拟合。

试验结果：结果如表9～11所示

表9右旋萜二烯和3,7-二甲基-6-辛烯醛对白纹伊蚊幼虫灭杀结果

表10右旋萜二烯和3,7-二甲基-6-辛烯醛对白纹伊蚊成蚊灭杀结果

表11右旋萜二烯和3,7-二甲基-6-辛烯醛对白纹伊蚊幼虫急性毒性结果

由表9～11可知，右旋萜二烯、3,7-二甲基-6-辛烯醛单一成分可以杀死白纹伊蚊幼虫且具有剂量依赖性，并且相对于香水柠檬叶精油的LC

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。