首页> 中国专利> 调节EIF4A3表达以调控肝癌细胞增殖能力的应用

调节EIF4A3表达以调控肝癌细胞增殖能力的应用

页面导航

摘要
著录项
说明书
相似文献

摘要

本发明涉及一种调节EIF4A3表达以调控肝癌细胞增殖能力的应用，通过生物信息学分析EIF4A3在肝癌的作用及探索与EIF4A3相关基因富集的通路和功能，随后预测并构建了EIF4A3参与肝癌细胞增殖的综合调控网络。在以上基础，以肝癌细胞系LM3和Hep3B为来源构建干扰EIF4A3表达的细胞系，进一步阐明干扰EIF4A3表达对肝癌细胞增殖的影响，有助于在肝癌进展中的作用提供了新的见解，并有助于确定该疾病的潜在治疗靶点，为EIF4A3应用于基因工程、肿瘤学及在临床上肝癌的诊断指标和治疗靶标提供可靠的理论依据。

著录项

公开/公告号CN113025718A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-06-25

原文格式PDF
申请/专利权人叶甲舟;
展开▼

申请/专利号CN202110421241.3
发明设计人叶甲舟;梁嵘;林燕;张锦燕;骆敏;马良;
展开▼

申请日2021-04-19
分类号C12Q1/6886(20180101);C12Q1/6858(20180101);G16B30/00(20190101);G16B40/00(20190101);
代理机构44214 广州市红荔专利代理有限公司;
代理人胡昌国
地址 530000 广西壮族自治区南宁市河堤路71号
入库时间 2023-06-19 11:37:30

说明书

技术领域

本发明涉及生物信息学技术领域和基因工程技术领域，公开一种调节EIF4A3表达以调控肝癌细胞增殖能力的应用，具体涉及一种调节EIF4A3表达以影响肝癌细胞增殖的分子机制及应用。

背景技术

原发性肝癌是全球癌症相关死亡的第二大原因，原发性肝癌包括肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌)、肝内胆管癌(ICCA)和其他罕见的肿瘤(Sia D，Villanueva A，Friedman SL，et al.Liver Cancer Cell of Origin，MolecularClass，and Effects on Patient Prognosis[J].Gastroenterology，2016，152(4)：745.)。肝癌是我国死亡率最高的消化系统肿瘤，肝癌的早期治疗极其重要，然而患者常常被发现时已经是肝癌晚期，索拉菲尼是治疗晚期肝细胞癌(HCC)的靶标药物，然而其总体效果却不佳，报告出严重的不良事件及患者出现对索拉菲尼的耐药(Zhu Y J，Zheng B，Wang H Y，etal.New knowledge of the mechanisms of sorafenib resistance in liver cancer[J].Acta Pharmacologica Sinica，2017，38(005)：614-622.)。肝癌的晚期治疗极其有限，虽然已经涌现了一批靶向治疗肝癌药物和免疫药物，但是由于其高昂的治疗费用与其不理想的治疗效果，使得许多患者望而却步。肝癌细胞过度增殖是肝癌难以治愈的原因之一，因此亟需寻找影响肝癌增殖的机制，将会为治疗肝癌提供坚实的理论基础。

外显子连接复合体(EJC)是一种蛋白质复合物，通过剪接而在mRNA的外显子-外显子连接处组装。EJC蛋白在剪接后事件中起着重要作用，包括mRNA输出、细胞质定位和无意义介导的衰变。EJC可能参与提高剪接mRNA翻译的效率(Hl.W，Sh.L，Br.C.Exon junctioncomplexes mediate the enhancing effect of splicing on mRNA expression[J].Proceedings of the National Academy of ences，2003，100(20)：11327-11332.；Dreyfuss G，Kim VN，Kataoka N.Messenger-RNA-binding proteins and the messagesthey carry.[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2002，3(3)：195.)。最近的证据表明mRNA的翻译也受转录体剪接历史的影响。EIF4A3是一个Dead-box RNA解旋酶，是一种依赖ATP的RNA解旋酶，也是翻译起始因子EIF4A家族的成员，是EJC的一个新的组成部分(Chan C C，

肝癌细胞过度增殖是肝癌难以治愈的原因之一，因此分析EIF4A3促进肝癌细胞增殖的机制能为治疗肝癌提供理论基础。

发明内容

为解决现有技术的问题，本发明通过生物信息学分析EIF4A3在肝癌的作用及探索与EIF4A3相关基因富集的通路和功能，随后预测并构建了EIF4A3参与肝癌细胞增殖的综合调控网络。在以上基础，以肝癌细胞系LM3和Hep3B为来源构建干扰EIF4A3表达的细胞系，进一步阐明干扰EIF4A3表达对肝癌细胞增殖的影响，有助于在肝癌进展中的作用提供了新的见解，并有助于确定该疾病的潜在治疗靶点，为EIF4A3应用于基因工程、肿瘤学及在临床上肝癌的诊断指标和治疗靶标提供可靠的理论依据。

本发明通过以下技术方案进行实现：

一方面，本发明提供一种调节EIF4A3表达以影响肝癌细胞增殖的综合调控网络的构建方法，包括如下步骤：

(1)数据处理：从癌症基因组图集数据库中下载肝癌数据，并对这些肝癌数据进行预处理；所述肝癌数据包括基于Affymetrix人类基因组U133a阵列平台的RNA_Seq的基因表达谱、甲基化的基因表达谱、SNP的数据和CNV的数据；

(2)差异表达分析：对肝癌数据分别在EIF4A3低表达的样本和EIF4A3高表达的样本中的情况进行差异表达分析以寻找与EIF4A3表达相关的基因；

(3)加权基因共表达网络分析：提取在EIF4A3低表达的样本和EIF4A3高表达的样本中分别低表达和高表达的mRNA，执行WGCNA以探索与肝癌相关的模块；

(4)构建综合调控网络：对与表型相关性最大的模块基因进行功能富集分析，构建调节EIF4A3表达以影响肝癌细胞增殖的综合调控网络。

进一步地，所述数据处理步骤如下：

在CNV数据中有375个肝癌样本和391个对照样本，对CNV数据进行基因注释，将拷贝数位点转换为基因symbol，以供后续分析；

在肝癌甲基化的基因表达谱数据中有380个肝癌样本和50个对照样本，使用R软件包ChAMP进行甲基化阵列分析，对数据进行过滤，随后用函数champ.norm对数据进行标准化处理，最后计算差异甲基化；

所述SNP的数据总共有387个样本，其中包括345个肝癌样本和42个对照样本，使用MATLAB2018b软件计算出SNP位点的Pvalue值，查看基因突变的显著性；

在所述RNA-seq的基因表达谱的数据中总共有387个样本其中包括345个肝癌样本和42个对照样本。

进一步地，所述差异表达分析的步骤如下：

使用perl语言对肝癌的CNV数据进行正常样本比肝癌样本的差异表达分析；

使用R软件包limma对RNA表达谱数据进行差异表达分析；进一步地，基于背景集Homo_sapiens.GRCh38.98.chr.gtf提取mRNA和lncRNA表达谱，并且与健康对照相比，对肝癌样本进行差异表达分析；进一步地，limma包中的normalize Between Arrays函数被用来对表达谱进行标准化；进一步地，当某一个RNA对应多个探针，则选择这些探针的平均表达值作为该RNA的表达值。

进一步地，所述加权基因共表达网络分析包括如下步骤：

使用hclust函数对提取的与EIF4A3显著相关的上调和下调的7574个mRNA进行层次聚类分析；利用pick Soft Threshold函数筛选模块构建过程中的软阈值功率值；用候选功率检验不同模块的平均连通度及其独立度；WGCNA R包用于构建共表达网络；最小模块大小被设置为30，并且每个模块被分配一个唯一的颜色；基于string数据库，构建了蛋白质互作网络，只保留了与联合得分＞500的交互作用。进一步地，所述候选功率为1～30。进一步地，当独立度＞0.9时，选择合适的功率值。

进一步地，所述构建综合调控网络包括如下步骤：

应用clusterProfiler包对与EIF4A3表型相关性最大的3个模块的1619个mRNA进行功能富集分析，以探索模块基因参与的功能和信号通路；

应用基因集富集分析(GSEA)探索富集在肝癌样本和EIF4A3高表达样本通路，并对通过基因集变异分析(GSVA)获得每条通路在肝癌样本和EIF4A3高表达样本的GSVA评分；在肝癌样本具有高GSVA评分的通路可能是参与肝癌发生过程的通路，在EIF4A3高表达样本中具有高GSVA评分的通路可能是被EIF4A3影响的参与肝癌的通路；

基于RNAInter数据库提取能够调控EIF4A3的lncRNA，结合富集结果获得的通路构建了lncRNA靶向EIF4A3介导的影响肝癌细胞增殖的综合调控网络。

另一方面，本发明提供一种调节EIF4A3表达以调控肝癌细胞增殖能力中的应用，包括如下步骤：

步骤A：构建稳定感染的敲除EIF4A3细胞系；

步骤B：构建稳定感染过表达EIF4A3基因的细胞系；

步骤C：检测干扰EIF4A3基因表达对肝癌细胞的增殖能力的影响。

进一步地，步骤A的过程如下：针对EIF4A3序列设计shRNA，构建EIF4A3干扰慢病毒质粒并包装慢病毒；制备重组EIF4A3-shRNA慢病毒；在LM3细胞感染敲除EIF4A3基因的慢病毒载体，获得稳定感染的敲除EIF4A3细胞系。

进一步地，所述稳定感染的敲除EIF4A3细胞系制备步骤如下：

(1)将核苷酸序列如SED ID NO：1所示的的shRNA模板连接至序列如SED ID NO：2所示的慢病毒载体，获得EIF4A3干扰慢病毒载体；

(2)利用EIF4A3干扰慢病毒载体包装制备序列如SED ID NO：3所示的EIF4A3干扰慢病毒；EIF4A3干扰慢病毒感染肝癌细胞株，培养感染后细胞，用抗生素进行筛选，获得稳定敲低EIF4A3基因的细胞株。

进一步地，所述包装的条件为：室温混匀20min，转染20h，收集。

进一步地，所述连接的条件为：22℃连接1h。

进一步地，所述慢病毒载体为hU6-MCS-CMV-zsGreen1-PGK-puromycin；所述抗生素为嘌呤霉素。

进一步地，所述肝癌细胞株选自LM3细胞。

进一步地，所述方法还包括利用qRT-PCR和western blot方法对所得稳定敲低EIF4A3基因的细胞株中EIF4A3表达量进行验证。

进一步地，步骤B的过程如下：利用CMV-MCS-3XFlag-PGK-Puro载体构建了标记EIF4A3的表达质粒，并将该质粒转染293T细胞；利用这些细胞的重组逆转录病毒多重感染感染肝癌细胞系Hep3B，使细胞感染过表达EIF4A3基因的慢病毒载体，以获得稳定感染过表达EIF4A3基因的细胞系。

进一步地，所述稳定感染过表达EIF4A3基因的细胞系的制备步骤如下：

(a)分别用限制性内切酶XhoI和EcoR酶切序列如SED ID NO：4所示的慢病毒载体，电泳，获得序列如SED ID NO：5所示的线性化的载体；

(b)从新鲜组织标本中提取组织总RNA，经反转录成cDNA，PCR扩增获得序列如SEDID NO：6所示的EIF4A3基因片段；

(c)将线性化的载体与EIF4A3基因片段用DNA连接酶连接获得EIF4A3过表达慢病毒载体；

(d)利用EIF4A3过表达慢病毒载体包装制备序列如SED ID NO：7所示的EIF4A3过表达慢病毒，经EIF4A3过表达慢病毒感染肝癌细胞株，利用抗生素进行药物筛选，获得稳定过表达EIF4A3基因的细胞株。

进一步地，所述包装的条件为：室温混匀20min，转染20h，收集。

进一步地，所述电泳条件为：1％琼脂糖凝胶，230V，30min。

进一步地，所述PCT扩增的体系如下：

模板1-2μg；引物1 2μL；引物2 2μL；PCR mix 25μL；ddH2O补足50μL

此处引物1的序列：CTACCGGACTCAGATCTCGAGGCCACCATGGCGACCACGGCCACGAT；

引物2的序列为：GTCATCCTTGTAATCGAATTCGATAAGATCAGCAACGTTCATCGG；

进一步地，所述连接的条件为：37C°水浴30min，转化。

进一步地，所述慢病毒载体为CMV-MCS-3XFlag-PGK-Puro；所述抗生素为嘌呤霉素。

进一步地，所述肝癌细胞株选自Hep3B细胞。

进一步地，所述方法还包括利用qRT-PCR和western blot方法对所得稳定过表达EIF4A3基因的细胞株中EIF4A3表达量进行验证。

本发明通过将EIF4A3过表达慢病毒直接感染肝癌细胞，构建了稳定过表达EIF4A3基因的细胞株；并且利用qRT-PCR和western blot方法验证了细胞株中EIF4A3基因的表达量，显示构建的细胞株表达量高于对照细胞株。通过验证表明EIF4A3基因在构建的细胞株中能够高效、稳定过表达。

进一步地，步骤C的过程如下：分别将稳定感染过表达EIF4A3基因的细胞系和稳定感染的敲除EIF4A3细胞系接种于96孔板中；在不同时间点，向每个孔中加入CCK-8溶液，孵育后测定吸光度，检测细胞增殖情况以判断干扰EIF4A3基因表达对肝癌细胞的增殖能力的影响。

相对于现有技术，本发明提供的技术方案具备有益效果如下：

本发明通过构建EIF4A3参与肝癌细胞增殖的综合调控网络，筛选出EIF4A3通过FOXO信号通路对肝癌的细胞增殖产生影响，进而说明EIF4A3参与肝癌细胞增殖的作用机制。通过构建过表达或敲除EIF4A3基因的细胞系，对本发明构建的综合调控网络进一步进行验证，为后续探索EIF4A3参与肝癌细胞增殖的分子机制提供理论依据，也为肝癌的诊断指标和治疗靶标提供可靠的理论依据。

本发明构建综合调控网络过程中通过对大样本的生物信息数据进行挖掘和有效信息的提取，采用差异表达分析提取表达一致的mRNA，应用加权基因共表达网络分析探索与肝癌相关的模块，运用分析EIF4A3影响的模块基因参与的功能和通路并构建EIF4A3调控肝癌细胞增殖的调控网络，能满足标准分析需求同时满足个性化分析需求，为研究肝癌标记物筛选、分子机制提供有意义的探索和依据，为肝癌的诊断提供检测标志物及新的治疗通路，为疾病的预防和治疗提供可靠的科学依据。

本发明通过成功构建敲除或过表达EIF4A3的细胞系，可稳定低表达或高表达ELF4A3蛋白，研究肝癌标记物筛选、分子机制提供有意义的探索和依据，提供了一种肝癌治疗的新思路，为研究肝癌药物治疗靶点提供了新途径。

附图说明

图1调节EIF4A3表达以影响肝癌细胞增殖的分子机制及应用的流程图

图2EIF4A3在肝癌样本和对照样本中的SNP，CNV和甲基化情况。

图3加权基因共表达网络分析探索EIF4A3相关的分子表达共失调景观。

图4EIF4A3介导的影响肝癌细胞增殖的分子机制的综合网络景观图。

图5敲除或过表达EIF4A3后的转染效率图。

图6调节EIF4A3表达以影响肝癌细胞增殖结果图。

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明内容，而不是对本发明保护范围的进一步限定。

实施例1

如图1所示，本发明提供一种调节EIF4A3表达以影响肝癌细胞增殖的分子机制及应用的流程图。从TCGA数据库中获得四类肝癌数据，经过差异表达分析后，鉴定与EIF4A3表达相关的基因，通过加权基因共表达网络分析探索与肝癌相关的模块，再经功能富集分析，构建EIF4A3参与肝癌细胞增殖的综合调控网络。

如图1所示，本发明提供一种调节EIF4A3表达以影响肝癌细胞增殖的综合调控网络的构建方法，包括如下步骤：

(1)数据处理：

从癌症基因组图集(TCGA)数据库中下载肝癌的数据，以获得包括RNA_Seq，Methylation(甲基化)2种组学的基因表达谱及其临床信息及肝癌SNP和CNV的数据；其中基因表达谱是基于Affymetrix人类基因组U133a阵列平台(Affymetrix；Thermo FisherScientiIFC Inc.，Waltham，MA，USA)。

在CNV数据中有375个肝癌样本和391个对照样本，对CNV数据进行基因注释，将拷贝数位点转换为基因symbol，以供后续分析；

在肝癌甲基化谱有380个肝癌样本和50个对照样本，使用R软件包ChAMP进行甲基化阵列分析，对数据进行过滤，随后对数据进行标准化处理，最后计算差异甲基化；

SNP的数据总共有387个样本其中包括345个肝癌样本和42个对照样本，使用MATLAB2018b软件计算出SNP位点的Pvalue值，查看基因突变的显著性；

在RNA-seq数据中总共有387个样本其中包括345个肝癌样本和42个对照样本。

(2)差异表达分析，具体如下：

使用perl语言对肝癌的CNV数据进行正常样本比肝癌样本的差异表达分析；

使用R软件包limma对RNA表达谱数据进行差异表达分析，基于背景集Homo_sapiens.GRCh38.98.chr.gtf提取mRNA和lncRNA表达谱，并且与健康对照相比，对肝癌样本进行差异表达分析，limma包中的normalizeBetweenArrays函数被用来对表达谱进行标准化。当一个基因对应多个探针，则选择这些探针的平均表达值作为该基因的表达值。

与EIF4A3低表达的样本相比，在EIF4A3高表达的样本进行差异表达分析以寻找差异表达的基因。

如图2所示，EIF4A3在肝癌样本和对照样本中的SNP、CNV和甲基化情况；其中图2A是EIF4A3的SNP变异情况，图2B是EIF4A3的CNV拷贝数情况，图2C是EIF4A3在各个表型的甲基化情况。

(3)加权基因共表达网络分析，具体如下：提取在两个分组均高表达和低表达的mRNA，执行WGCNA以探索与肝癌相关的模块。

首先，使用hclust函数对提取与EIF4A3显著相关上调和下调的7574个mRNA进行层次聚类分析，然后利用pick Soft Threshold函数筛选模块构建过程中的软阈值功率值。用候选功率(1～30)检验不同模块的平均连通度及其独立性。当独立度＞0.9时，选择合适的功率值。WGCNA R包用于构建共表达网络(modules)；最小模块大小被设置为30，并且每个模块被分配一个唯一的颜色。

如图3所示，本发明实施例中加权基因共表达网络分析探索EIF4A3相关的分子表达共失调景观。其中图3A确定了加权基因共表达网络分析的权值为7，图3B得到了19个与EIF4A3显著相关的模块并且每个模块被分配了唯一的颜色，图3C为各个模块的表达热图，图3D为19个模块与与表型的相关性及其显著性，图3E是对19个模块根据共表达聚类距离进行构建模块树图。

(4)富集分析及构建调节EIF4A3表达以影响肝癌细胞增殖的网络，具体如下：

应用clusterProfiler包对与EIF4A3表型相关性最大的1619个mRNA进行功能富集分析，以探索模块基因参与的功能和信号通路。P＜0.05被认为是差异显著的。

应用基因集富集分析(GSEA)探索富集在肝癌样本和EIF4A3高表达样本和通路，并对通过基因集变异分析(GSVA)获得每条通路在肝癌样本和EIF4A3高表达样本的GSVA评分。在肝癌样本具有高GSVA评分的通路可能是参与肝癌发生过程的通路，在EIF4A3高表达样本中具有高GSVA评分的通路可能是被EIF4A3影响的参与肝癌的通路。

最后，基于RNAInter数据库库提取能够调控EIF4A3的lncRNA，构建了lncRNA靶向EIF4A3介导的肝癌全局失调的综合网络。结果显示：与5个lncRNA与EIF4A3互作并通过289个模块基因调控43条KEGG通路进而介导的肝癌全局失调的综合网络，基于文献参考我们可以发现EIF4A3可以通过FoxO信号通路促进肝癌细胞增殖。

如图4所示，本发明实施例中EIF4A3介导的影响肝癌细胞增殖的分子机制的综合网络景观，表明EIF4A3可以通过FoxO信号通路促进肝癌的细胞增殖。其中图4A是EIF4A3表型正相关性最大的3个模块共1619个基因所参与的生物学功能，图4B是与EIF4A3表型正相关性最大的3个模块共1619个基因所参与的KEGG通路，图4C是在GSEA验证得到富集在肝癌样本的通路，其GSVA分数在肝癌样本-健康对照样本组的表达情况，图4D是GSEA验证得到富集在EIF4A3高表达样本的通路，其GSVA分数在EIF4A3高表达样本-EIF4A3低表达样本组的表达情况，图4E是lncRNA互作EIF4A3通过FoxO信号通路促进肝癌的细胞增殖，图4F是EIF4A3通过FoxO信号通路促进肝癌的细胞增殖的机制。

实施例2

(1)构建敲除EIF4A3的细胞系：

制备重组EIF4A3-shRNA慢病毒和阴性对照(NC)慢病毒；在LM3细胞感染敲除EIF4A3基因的慢病毒载体(EIF4A3-KD)，获得稳定感染的敲除EIF4A3细胞系和对照细胞系。如图5A所示敲除EIF4A3后的转染效率，表明肝癌细胞系LM3确实敲除了EIF4A3。具体过程如下：

采用qRT-PCR进行检测，测序结果和EIF4A3序列比对分析。登陆Public TRCPortal网站，检索EIF4A3并从结果中选择经过验证且得分较高的EIF4A3的shRNA干涉序列5′-GGATGAAGCTGATGAAATG-3′，并通过BLAST同源性比较。将合成的shRNA模板(核苷酸序列如SED ID NO：1所示，具体为GGATGAAGCTGATGAAATG；具体合成过程针对目的基因靶基因序列，利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则，设计多个RNA干扰靶点序列，根据我们的设计经验和设计软件进行评估测定，选择最佳的动力学参数的靶点进入后续实验流程)与慢病毒载体连接(22℃连接1h)，获得的EIF4A3干扰慢病毒载体。

将获得的EIF4A3干扰慢病毒载体包装制备EIF4A3干扰慢病毒(条件为：室温混匀20min，转染20h，收集病毒)，EIF4A3干扰慢病毒感染LM3细胞。

用抗生素选择阳性克隆(LM3细胞为2μg/mL)，建立14天稳定细胞系LM3-EIF4A3-KD细胞。

通过qRT-PCR和western blot检测EIF4A3敲低的效率，结论如图5A。

所述慢病毒载体为hU6-MCS-CMV-zsGreen1-PGK-puromycin；所述抗生素为嘌呤霉素。

此处慢病毒载体序列如SED ID NO：2所示，具体为：

此处EIF4A3干扰慢病毒序列如SED ID NO：3所示，具体为：

构建过表达EIF4A3的细胞系，具体过程如下：

分别用限制性内切酶XhoI和EcoRI酶切慢病毒载体，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖凝胶，230V，30min)，回收目的条带，获得线性化的载体(质粒)。

此处慢病毒载体的序列如SED ID NO：4所示，具体如下：

此处线性化的载体的序列如SED ID NO：5所示，具体如下：

序列表

<110> 叶甲舟

<120> 调节EIF4A3表达以调控肝癌细胞增殖能力的应用

<130> 2021

<141> 2021-03-19

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggatgaagct gatgaaatg 19

<210> 2

<211> 8997

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180

ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660

cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720

caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780

aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840

aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900

caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960

gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020

cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080

ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140

aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200

tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260

aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320

gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380

cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440

gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500

ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560

actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620

gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680

aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740

ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800

tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860

actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920

cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980

cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040

gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100

aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160

acagcagaga tccagtttat cgatctgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt 2220

catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa 2280

acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg 2340

cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt 2400

tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgagg atccggacaa gcttcgaatt 2460

ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 2520

gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 2580

tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 2640

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 2700

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 2760

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 2820

ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 2880

gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 2940

gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 3000

tacggtggga ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagcgct 3060

accggtcgcc accatggccc agtccaagca cggcctgacc aaggagatga ccatgaagta 3120

ccgcatggag ggctgcgtgg acggccacaa gttcgtgatc accggcgagg gcatcggcta 3180

ccccttcaag ggcaagcagg ccatcaacct gtgcgtggtg gagggcggcc ccttgccctt 3240

cgccgaggac atcttgtccg ccgccttcat gtacggcaac cgcgtgttca ccgagtaccc 3300

ccaggacatc gtcgactact tcaagaactc ctgccccgcc ggctacacct gggaccgctc 3360

cttcctgttc gaggacggcg ccgtgtgcat ctgcaacgcc gacatcaccg tgagcgtgga 3420

ggagaactgc atgtaccacg agtccaagtt ctacggcgtg aacttccccg ccgacggccc 3480

cgtgatgaag aagatgaccg acaactggga gccctcctgc gagaagatca tccccgtgcc 3540

caagcagggc atcttgaagg gcgacgtgag catgtacctg ctgctgaagg acggtggccg 3600

cttgcgctgc cagttcgaca ccgtgtacaa ggccaagtcc gtgccccgca agatgcccga 3660

ctggcacttc atccagcaca agctgacccg cgaggaccgc agcgacgcca agaaccagaa 3720

gtggcacctg accgagcacg ccatcgcctc cggctccgcc ttgccctaac tcgagtaatt 3780

ctaccgggta ggggaggcgc ttttcccaag gcagtctgga gcatgcgctt tagcagcccc 3840

gctgggcact tggcgctaca caagtggcct ctggcctcgc acacattcca catccaccgg 3900

taggcgccaa ccggctccgt tctttggtgg ccccttcgcg ccaccttcta ctcctcccct 3960

agtcaggaag ttcccccccg ccccgcagct cgcgtcgtgc aggacgtgac aaatggaagt 4020

agcacgtctc actagtctcg tgcagatgga cagcaccgct gagcaatgga agcgggtagg 4080

cctttggggc agcggccaat agcagctttg ctccttcgct ttctgggctc agaggctggg 4140

aaggggtggg tccgggggcg ggctcagggg cgggctcagg ggcggggcgg gcgcccgaag 4200

gtcctccgga ggcccggcat tctgcacgct tcaaaagcgc acgtctgccg cgctgttctc 4260

ctcttcctca tctccgggcc tttcgacctg cagcccaagc ttaccatgac cgagtacaag 4320

cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtccccaggg ccgtacgcac cctcgccgcc 4380

gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgatc cggaccgcca catcgagcgg 4440

gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc tcgacatcgg caaggtgtgg 4500

gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc cggagagcgt cgaagcgggg 4560

gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga gcggttcccg gctggccgcg 4620

cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca aggagcccgc gtggttcctg 4680

gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc tgggcagcgc cgtcgtgctc 4740

cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct tcctggagac ctccgcgccc 4800

cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca ccgccgacgt cgaggtgccc 4860

gaaggaccgc gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg cctgaacgcg tctggaacaa 4920

tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 4980

ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 5040

ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 5100

gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 5160

ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 5220

tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 5280

gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccat ggctgctcgc 5340

ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 5400

tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 5460

ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcctg gaattaattc 5520

tgcagtcgag acctagaaaa acatggagca atcacaagta gcaatacagc agctaccaat 5580

gctgattgtg cctggctaga agcacaagag gaggaggagg tgggttttcc agtcacacct 5640

caggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa 5700

gaaaagaggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gacaagatat ccttgatctg 5760

tggatctacc acacacaagg ctacttccct gattagcaga actacacacc agggccaggg 5820

gtcagatatc cactgacctt tggatggtgc tacaagctag taccagttga gccagataag 5880

gtagaagagg ccaataaagg agagaacacc agcttgttac accctgtgag cctgcatggg 5940

atggatgacc cggagagaga agtgttagag tggaggtttg acagccgcct agcatttcat 6000

cacgtggccc gagagctgca tccggagtac ttcaagaact gctgatatcg agcttgctac 6060

aagggacttt ccgctgggga ctttccaggg aggcgtggcc tgggcgggac tggggagtgg 6120

cgagccctca gatcctgcat ataagcagct gctttttgcc tgtactgggt ctctctggtt 6180

agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 6240

ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 6300

ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg 6360

tcatcttatt attcagtatt tataacttgc aaagaaatga atatcagaga gtgagaggcc 6420

ttgacattgc tagcgtttac cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata 6480

gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 6540

cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 6600

ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca 6660

acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 6720

gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 6780

gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 6840

ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 6900

cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 6960

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 7020

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 7080

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 7140

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 7200

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 7260

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 7320

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 7380

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 7440

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 7500

tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 7560

cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 7620

aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 7680

atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 7740

cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 7800

tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 7860

atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 7920

taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 7980

tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 8040

gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 8100

cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 8160

cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 8220

gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 8280

aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 8340

accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 8400

ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 8460

gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 8520

aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 8580

taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcgacggatc 8640

gggagatcaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 8700

atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 8760

atgtatctta tcatgtctgg atcaactgga taactcaagc taaccaaaat catcccaaac 8820

ttcccacccc ataccctatt accactgcca attacctgtg gtttcattta ctctaaacct 8880

gtgattcctc tgaattattt tcattttaaa gaaattgtat ttgttaaata tgtactacaa 8940

acttagtagt ttttaaagaa attgtatttg ttaaatatgt actacaaact tagtagt 8997

<210> 3

<211> 9039

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3