Panx1在肝癌中的表达及其对肝癌细胞增殖能力的影响

摘要

目的：尽管肝癌的临床诊断和手术治疗取得了极大的进展，但是肝癌的死亡率仍位居前三。肝癌早期不易被发现，患者诊断时多数已发生肝内转移甚至是远端转移。因此开发新的肝细胞癌诊断和预后因子具有重要且迫切的意义。最近研究发现，Panx1（Pannexin1）与肿瘤发生发展及恶性转移密切相关，Panx1通道抑制剂可明显降低乳腺癌的转移效率，敲低Panx1基因可明显抑制胶质瘤细胞的增殖能力，Panx1的表达与胆囊癌的增殖呈负相关。在以上肿瘤的发生发展中，Panx1可能作为一种癌基因发挥着抑癌或者促癌的作用，而Panx1基因在肝癌中的功能及分子机制尚未阐明。本研究旨在探究Panx1在肝癌中的表达情况、以及其对肝癌增殖的影响，探讨与肝癌生长相关的因素，寻找新的防治靶点，为肝癌的治疗及预后提供可能的帮助。 方法：1.在TCGA数据库中，查找Panx1基因在肝癌中的RNA表达水平。 2.运用免疫组化方法检测63例肝癌标本（癌和癌旁）中Panx1蛋白的表达水平。 3.在人肝癌细胞株Hep3B、huh7、97L，97H、LM3中，运用western blotting技术检测Panx1在其中的表达情况。在Panx1表达相对低的细胞株97L和LM3中，运用慢病毒技术，将panx1过表达基因分别导入97L和LM3细胞中，构建Panx1基因过表达稳转株。 4.运用蛋白免疫印迹技术检测肝癌稳转细胞97L和LM3中，Panx1和抑癌蛋白PTEN的表达水平。 5.用CCK-8技术检测稳转细胞株97L和LM3的增殖能力，检测Panx1基因过表达对肝癌细胞97L和LM3增殖能力的影响。 6.在裸鼠皮下种植LM3稳转细胞株，检测Panx1基因过表达对小鼠皮下成瘤的影响。 7.在Panx1基因敲出小鼠和野生型小鼠中，检测Panx1敲出对Hepa1-6小鼠肝癌细胞体内成瘤的影响。 结果：1.在TCGA数据库中，我们检测发现Panx1基因在肝癌中是低表达的，在癌旁组织中Panx1基因的表达水平较高。 2.在63例肝癌和癌旁组织中，Panx1蛋白在肝癌中的表达水平明显低于癌旁组织。 3.检测肝癌细胞系中，发现Panx1在97L和LM3中的细胞表达较低，Panx1基因过表达后，PTEN蛋白表达水平增高。 4.在体外细胞增殖实验中，相对于对照组，过表达Panx1基因可明显抑制97L和LM3稳转细胞的增殖能力。 5.在裸鼠皮下成瘤实验中，与对照组相比，Panx1基因过表达能明显抑制裸鼠皮下LM3细胞成瘤的能力，其皮下成瘤体积明显减小。 6.与野生型组小鼠比，在Panx1基因敲除小鼠中，Panx1基因敲除能明显促进小鼠体内Hepa1-6细胞的增殖能力，其皮下成瘤体积明显大于野生型组。 结论：1.我们检测到Panx1在肝癌组织中的表达量明显低于肝癌旁正常组织，Panx1在肝正常细胞L02的表达量明显高于其他肝癌细胞，panx1的表达具有显著差异性。 2.Panx1的过表达能够明显抑制体内外肝癌细胞增殖能力。其表达可能起到抑制肝癌生长的作用，其可能参与肝癌的发生发展和预后。

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引 言

1实验材料及分组

1.1细胞株和组织标本

1.2实验动物

1.3实验试剂

1.4实验仪器

2 实验方法

2.1细胞培养

2.1.1细胞复苏

2.1.2细胞换液

2.1.3细胞传代

2.1.4细胞冻存

2.2质粒中抽

2.2.1细菌铺板

2.2.2摇菌

2.2.3做质粒中提（以300ml菌液提取为例）

2.3慢病毒包装及细胞稳转株构建

2.4免疫组化

2.5CCK8测细胞增殖能力

2.6组织和细胞RNA抽取

2.7Western blotting检测相应蛋白的表达

2.7.1 收集蛋白

2.7.2蛋白定量（参考碧云天BCA蛋白定量法）

2.7.3分离胶和浓缩胶的配制

2.7.4分离胶及浓缩胶的配制步骤

2.7.5上样跑胶

2.7.6转膜

2.7.7免疫显色

2.8小鼠体内肿瘤增殖检测

2.9统计分析

1Panx1基因在TCGA数据库肝癌中的表达

2 Panx1蛋白在肝癌组织中低表达

3Panx1在肝癌细胞中的表达量降低

4 97L和LM3细胞中过表达Panx1可增加PTEN表达

5Panx1过表达抑制肝癌细胞增殖

6Panx1基因过表达抑制小鼠体内成瘤

7Panx1基因敲出促进小鼠体内成瘤