用于使用融合蛋白进行TCR重编程的组合物和方法

摘要

本文提供了对超过一种肿瘤细胞相关抗原具有特异性的T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、被工程化以表达一种或多种TFP的T细胞以及其用于治疗包括癌症在内的疾病的使用方法。

说明书

交叉引用

本申请要求2018年8月30日提交的美国临时专利申请号62/725,098的权益，其全部内容以引用的方式并入本文中。

技术背景

大多数患有血液恶性肿瘤或晚期实体瘤的患者使用标准疗法无法治愈。另外，传统的治疗选项通常具有严重的副作用。已经进行了许多尝试来使患者的免疫系统排斥癌细胞，这种方法被统称为癌症免疫疗法。但是，一些障碍使得实现临床效果相当困难。尽管已经鉴定出数百种所谓的肿瘤抗原，但是这些抗原通常是自体产生的并且因此可以指导针对健康组织的癌症免疫疗法，或者免疫原性差。此外，癌细胞利用多种机制使其自身变得由癌症免疫疗法引发和传播的免疫攻击不可见或敌对。

使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞疗法的最新进展依赖于将基因工程化的T细胞重定向至癌细胞上合适的细胞表面分子，在利用免疫系统的力量来治疗癌症方面显示出有希望的结果。例如，一项正在进行的B细胞成熟抗原(BCMA)特异性CAR T细胞试验的临床结果显示，在一些多发性骨髓瘤患者中部分缓解(一项此类试验可通过clinicaltrials.gov标识符NCT02215967找到)。另一种方法是使用针对肿瘤相关肽抗原选择的T细胞受体(TCR)α和β链来使自体T细胞基因工程化。这些TCR链将形成完整的TCR复合物，并为具有TCR的T细胞提供第二确定的特异性。在患有滑膜癌的患者中，使用表达NY-ESO-1特异性TCRα和β链的工程化自体T细胞获得了令人鼓舞的结果。

除了表达CAR或第二TCR的基因修饰的T细胞在体外/离体识别和破坏相应靶细胞的能力之外，用工程化的T细胞对患者进行成功的治疗需要T细胞能够强烈活化、扩增、随时间持续以及在疾病复发的情况下能够实现‘记忆’应答。CAR T细胞的高且可管理的临床疗效目前仅限于间皮素阳性B细胞恶性肿瘤和表达HLA-A2的表达NY-ESO-1肽的滑膜肉瘤患者。显然需要改进基因工程化的T细胞，以更广泛地抵抗各种人类恶性肿瘤。本文描述了具有细胞表面抗原特异性结合结构域的TCR亚基(包括CD3ε、CD3γ和CD3δ)的新型融合蛋白以及TCRα和TCRβ链的新型融合蛋白，其具有克服现有方法局限性的潜力。本文描述了新型融合蛋白，其比CAR更有效地杀死靶细胞，但释放相当或更低水平的促炎性细胞因子。这些融合蛋白及其使用方法代表了TFP相对于CAR的优势，因为这些细胞因子水平升高与过继性CAR-T疗法的剂量限制性毒性有关。

发明内容

本文提供了对超过一种靶标具有特异性的结合蛋白，以及包含此类双特异性结合蛋白的抗体和T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)。此外，提供了被工程化以表达一种或多种TFP的T细胞以及其用于治疗疾病的使用方法。TFP在单个分子上或在单个工程化TCR中可能具有双特异性；或者，双特异性可能通过混合两种包含TFP的工程化T细胞群或用两种不同的病毒转导单个T细胞群体而来。

因此，在一方面，提供了一种组合物，其包含编码第一T细胞受体复合物(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述第一T细胞受体复合物(TCR)融合蛋白(TFP)包含：TCR亚基，所述TCR亚基包含TCR胞外结构域的至少一部分、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞内结构域包含来自仅衍生自选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链组成的组的TCR亚基的胞内信号传导结构域的刺激结构域；和包含抗MUC16结合结构域的鼠、人或人源化抗体结构域，其中所述TCR亚基和所述抗MUC16结合结构域可操作地连接，其中所述第一TFP在T细胞中表达时在功能上与TCR相互作用或并入TCR中；以及编码第二TFP的第二重组核酸序列，所述第二TFP包含TCR亚基，所述TCR亚基包含TCR亚基胞外结构域的至少一部分、跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自仅衍生自选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链组成的组的TCR亚基的胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)包含抗间皮素(MSLN)结合结构域的鼠、人或人源化抗体结构域，其中所述TCR亚基和所述抗MSLN结合结构域可操作地连接，其中所述第二TFP在T细胞中表达时在功能上与TCR相互作用或并入TCR中。

在另一方面，提供了一种组合物，其包含第一重组核酸序列，所述第一重组核酸序列编码第一T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)，所述第一T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)包含TCR亚基，所述TCR亚基包含TCR胞外结构域的至少一部分、跨膜结构域和TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自仅衍生自选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链组成的组的TCR亚基的胞内信号传导结构域的刺激结构域；以及包含抗MUC16结合结构域的第一人或人源化抗体结构域和包含抗MSLN结合结构域的第二人或人源化抗体结构域，其中所述TCR亚基、所述第一抗体结构域和所述第二抗体结构域可操作地连接，并且其中所述第一TFP在T细胞中表达时在功能上与TCR相互作用或并入TCR中。

在另一方面，提供了一种组合物，其包含分离的重组核酸分子，所述分离的重组核酸分子编码包含TCR亚基的第一T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、包含作为抗MUC16结合结构域的第一抗原结合结构域的第一人或人源化抗体结构域；以及包含TCR亚基的第二T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、包含作为抗MSLN结合结构域的第二抗原结合结构域的第二人或人源化抗体结构域，其中第一TFP的TCR亚基和第一抗体结构域可操作地连接，并且第二TFP的TCR亚基和第二抗体结构域可操作地连接。

在另一方面，提供了一种组合物，其包含分离的重组核酸分子，所述重组核酸分子编码包含TCR复合物亚基第一T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、包含作为抗MUC16结合结构域的第一抗原结合结构域的第一人或人源化抗体结构域和包含作为抗MSLN结合结构域的第二抗原结合结构域的第二人或人源化抗体结构域；其中第一TFP的TCR亚基、第一抗体结构域和第二抗体结构域可操作地连接。

在一个实施方案中，第一TFP的编码的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链组成的组的TCR亚基。在另一个实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链和TCRε链组成的组的TCR亚基。在另一个实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRα链。在另一个实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRβ链。在另一个实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRγ链。在另一个实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRδ链。在另一个实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3γ链。在另一个实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3δ链。在另一个实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3ε链。

在一个实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRα链。在另一个实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRβ链。在另一个实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRγ链。在另一个实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRδ链。在另一个实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3γ链。在另一个实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3δ链。在另一个实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3ε链。

在一个实施方案中，第一TFP、第二TFP或两者当在T细胞中表达时并入TCR中或在功能上与TCR相互作用。在另一个实施方案中，第一TFP、第二TFP或两者当在T细胞中表达时并入TCR中或在功能上与TCR相互作用。在另一个实施方案中，编码的第一抗原结合结构域通过第一接头序列连接至第一TFP的TCR胞外结构域并且编码的第二抗原结合结构域通过第二接头序列连接至第二TFP的TCR胞外结构域，或者第一抗原结合结构域通过第一接头序列连接至第一TFP的TCR胞外结构域并且编码的第二抗原结合结构域通过第二接头序列连接至第二TFP的TCR胞外结构域。在另一个实施方案中，第一接头序列和第二接头序列包含(G

在一个实施方案中，第一人或人源化抗体结构域、第二人或人源化抗体结构域或两者包含抗体片段。在另一个实施方案中，第一人或人源化抗体结构域、第二人或人源化抗体结构域或两者包含scFv或V

在一个实施方案中，编码的第一TFP和编码的第二TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自由TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能性片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列组成的组的蛋白质的跨膜结构域。在另一个实施方案中，重组核酸包含编码共刺激结构域的序列。在另一个实施方案中，共刺激结构域是从选自由OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)及对其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域。在另一个实施方案中，重组核酸包含编码胞内信号传导结构域的序列。在另一个实施方案中，重组核酸包含编码前导序列的序列。在另一个实施方案中，重组核酸包含编码蛋白酶切割位点的序列。在一个实施方案中，对其的至少一个但不超过20个修饰包括介导细胞信号传导的氨基酸的修饰或响应于配体与第一TFP、第二TFP或两者的结合而磷酸化的氨基酸的修饰。

在一个实施方案中，分离的重组核酸分子是mRNA。

在一个实施方案中，第一TFP、第二TFP或两者包含TCR亚基的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，所述ITAM包含选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、TCRζ链、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a，CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能性片段及对其具有至少一个但不多于20个修饰的其氨基酸序列组成的组的蛋白质的ITAM或其一部分。

在另一个实施方案中，ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。在另一个实施方案中，ITAM选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组，并替代选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组的不同ITAM。在一个实施方案中，编码的重组核酸还包含前导序列。

在另一方面，提供了一种组合物，其包含由本文所述的任何核酸分子编码的多肽分子。在一个实施方案中，所述多肽包含由第一核酸分子编码的第一多肽和由第二核酸分子编码的第二多肽。

在另一方面，提供了一种组合物，其包含由本文所述的任何核酸分子编码的重组TFP分子。

在另一方面，提供了一种组合物，其包含编码本文所述的多肽或重组TFP分子的载体。在一个实施方案中，载体包含：a)第一载体，其包含编码第一TFP的第一核酸分子；和b)第二载体，其包含编码第二TFP的第二核酸分子。在另一个实施方案中，载体包括第一TFP和第二TFP，其中编码第一TFP的序列和编码第二TFP的序列被切割位点分开，载体选自由DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体组成的组。在一个实施方案中，载体包含启动子。在一个实施方案中，载体是体外转录的载体。在一个实施方案中，载体中的核酸分子进一步编码聚(A)尾。在另一个实施方案中，载体中的核酸分子进一步编码3’UTR。在另一个实施方案中，载体中的核酸分子进一步编码蛋白酶切割位点。

在一个实施方案中，组合物还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含含有抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。在另一个实施方案中，抑制性分子包含含有PD1的至少一部分的第一多肽和含有共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。

在另一方面，提供了一种包含本文公开的重组核酸序列的载体。在一个实施方案中，载体包含第一重组核酸序列。在另一个实施方案中，载体包含第二重组核酸序列。

在另一方面，提供了一种包含组合物的细胞，所述组合物包含本文公开的任何分离的重组核酸分子、载体或多肽。在一个实施方案中，细胞是人T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是CD8+或CD4+ T细胞。在一个实施方案中，细胞包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含含有抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。在一个实施方案中，抑制性分子包含含有PD1的至少一部分的第一多肽和含有共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。

在另一方面，提供了一种包含至少两种TFP分子的人CD8+或CD4+T细胞，所述TFP分子包含抗MUC16结合结构域、抗MSLN结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+或CD4+T细胞表面中、表面处和/或表面上的内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽在功能上相互作用。在另一个实施方案中，是蛋白质复合物，其包含第一TFP分子，所述第一TFP分子包含抗MUC16结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；第二TFP分子，所述第二TFP分子包含抗MSLN结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；和至少一种内源性TCR亚基或内源性TCR复合物。

在另一方面，提供了一种蛋白质复合物，其包含TFP分子，所述TFP分子包含抗MUC16结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；和至少一种内源性TCR亚基或内源性TCR复合物。

在另一方面，提供了一种蛋白质复合物，其包含TFP分子，所述TFP分子包含抗MSLN结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；和至少一种内源性TCR亚基或内源性TCR复合物。

在一个实施方案中，蛋白质复合物中的TCR包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的胞外结构域或其一部分。在一个实施方案中，抗MUC16结合结构域、抗MSLN结合结构域或两者通过接头序列连接至TCR胞外结构域。在一个实施方案中，接头区包含(G

在另一方面，提供了一种人CD8+或CD4+ T细胞，其在本文所述的任何蛋白质复合物中包含至少两种不同的TFP蛋白。在另一方面，提供了一种人CD8+或CD4+T细胞，其包含由本文公开的任何分离的核酸分子编码的至少两种不同的TFP分子。

在另一方面，提供了一种人CD8+或CD4+T细胞群体，其中所述群体的T细胞单独或共同包含至少两种TFP分子，所述TFP分子包含抗MUC16结合结构域或抗MSLN结合结构域、或抗MUC16结构域和抗MSLN结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+或CD4+T细胞表面中、表面处和/或表面上的内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽在功能上相互作用。

在另一方面，提供了一种人CD8+或CD4+T细胞群体，其中所述群体的T细胞单独或共同包含由本文公开的任何分离的重组核酸分子编码的至少两种TFP分子。在另一方面，提供了一种药物组合物，其包含有效量的本文公开的组合物、载体、细胞或蛋白质复合物以及药学上可接受的赋形剂。

在另一方面，提供了一种治疗患有与MSLN或MUC16表达有关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的本文公开的任何组合物。在一个实施方案中，与MUC16或MSLN表达有关的疾病选自由以下组成的组：增生性疾病、癌症、恶性肿瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合症、白血病前期、与MUC16表达有关的非癌相关适应症、与MSLN表达有关的非癌相关适应症、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、食道癌、胃癌和不可切除的卵巢癌伴复发性或难治性疾病。在另一个实施方案中，所述疾病是选自由以下组成的组的血液癌症：B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴性白血病(T-ALL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞前淋巴细胞性白血病、母细胞浆细胞样树突细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞滤泡性淋巴瘤、大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病状、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合症、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、白血病前期、与MUC16或MSLN表达有关的疾病及其组合。在另一个实施方案中，表达第一TFP分子和第二TFP分子的细胞或细胞群体与增加表达第一TFP分子和第二TFP分子的细胞或细胞群体的功效的剂组合施用。在一个实施方案中，与施用有效量的表达抗MSLN嵌合抗原受体(CAR)、抗MUC16 CAR、抗MSLN CAR和抗MUC16 CAR；或其组合的T细胞的哺乳动物相比，在哺乳动物中释放更少的细胞因子。在一个实施方案中，将表达第一TFP分子和第二TFP分子的细胞与减轻与施用表达第一TFP分子和第二TFP分子的细胞有关的一种或多种副作用的剂组合施用。在另一个实施方案中，将第一TFP分子和第二TFP分子与治疗与MSLN或MUC16有关的疾病的剂组合施用。

以引用的方式并入

在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，其程度就如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用的方式并入一般。

附图说明

图1是示出本文公开的一些双重靶向癌细胞的方法的图。肿瘤细胞抗原靶标MUC16和MSLN是示例性抗原。

图2描绘了蛋白质序列，示出了与报道的另一种抗体4H11的表位相比，抗MUC16抗体R3MU4和R3MU29的MUC16胞外域序列上的结合表位。

图3是未转导(图3A，“NT”)、用抗间皮素TFP转导(图3B，“MSLN TFP”)、用抗MUC16TFP转导(图3C，“MUC16 TFP”)或用双特异性TFP转导(图3D)的Jurkat细胞的FACS分析的一系列图像。将所有Jurkat细胞(NT、MSLN TFP、MUC16 TFP、双特异性TFP)首先用标记的Fc_MSLN和MUC16-生物素同时染色，然后用链霉亲和素-PE染色。

图4是示出未转导或用MSLN TFP、MUC16 TFP或双特异性TFP转导并与K562细胞(“DN”，圆形)、表达MSLN的K562细胞(“MSLN+”，正方形)、表达MUC16的K562细胞(“MUC16+”，向上箭头)和表达两种蛋白质的K562(“DP”，向下箭头)共培养的Jurkat细胞的IL-2产生的测量的图。

图5是用各种构建体转导的原代人T细胞的FACS分析的一系列图像。NT(非转导的)、MSLN TFP、MUC16 TFP和双特异性TFP T细胞通过用编码单特异性或双特异性TFP的慢病毒转导来由健康供体T细胞生成。如图3所述扩增并染色细胞。检测MSLN TFP T细胞的MSLN特异性TFP(图5C)而非MUC16 TFP(图5D)的表达；此外，检测MUC16 TFP T细胞的MUC16TFP(图5F)而非MSLN TFP(图5E)。对于双特异性TFP T细胞，在转导细胞的表面上检测到MSLN TFP和MUC16 TFP(图5G和5H)。对于NT Jurkat细胞没有检测到MSLN TFP或MUC16 TFP(图5A和5B)。

图6是示出未转导或用MSLN TFP，MUC16 TFP或双特异性TFP转导并与K562细胞(“DN”，圆形)、表达MSLN的K562细胞(“MSLN+”，正方形)、表达MUC16的K562细胞(“MUC16+”，向上箭头)和表达两种蛋白的K562(“DP”，向下箭头)共培养的原代人T细胞的细胞毒性(占总百分比)的测量的图。

图7A-7C是示出未转导或用MSLN TFP、MUC16 TFP或双特异性TFP转导并与K562细胞(“DN”，圆形)、表达MSLN的K562细胞(“MSLN+”，正方形)、表达MUC16的K562细胞(“MUC16+”，向上箭头)和表达两种蛋白的K562(“DP”，向下箭头)共培养的原代人T细胞的靶特异性细胞因子产生的一系列图。所测得的细胞因子为IFN-γ(图7A)、GM-CSF(图7B)和TNF-α(图7C)。

具体实施方式

本文提供了用于使用双特异性T细胞受体(TCR)融合蛋白或双特异性T细胞群体治疗疾病例如癌症的物质组合物和使用方法。如本文所用，“T细胞受体(TCR)融合蛋白”或“TFP”包含衍生自包含TCR的各种多肽的重组多肽，所述TCR通常能够i)结合靶细胞上的表面抗原并且ii)与完整TCR复合物的其他多肽组分相互作用，通常当共同位于T细胞内或表面上时。如本文所提供的，与嵌合抗原受体相比，TFP提供了实质性益处。术语“嵌合抗原受体”或可替代地“CAR”是指包含scFv形式的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(在本文中也称为“胞内信号传导结构域”)的重组多肽，所述胞质信号传导结构域包含衍生自如下文定义的刺激性分子的功能性信号传导结构域。通常，CAR的中心胞内信号传导结构域衍生自通常发现与TCR复合物缔合的CD3ζ链。CD3ζ信号传导结构域可以与衍生自至少一种共刺激分子例如4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28的一个或多个功能性信号传导结构域融合。

在一方面，本文提供一种组合物，其包含(I)编码第一T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的第一重组核酸序列，所述第一T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分、(ii)跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自仅衍生自选自由TCRα链、TCRβ链、CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链组成的组的TCR亚基的胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)包含抗MUC16结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中所述TCR亚基和所述抗MUC16结合结构域可操作地连接，其中所述第一TFP在T细胞中表达时在功能上与TCR相互作用或并入TCR中；以及(II)编码第二TFP的第二重组核酸序列，所述第二TFP包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分、(ii)跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自仅衍生自选自由TCRα链、TCRβ链、CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链组成的组的TCR亚基的胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)包含抗间皮素(MSLN)结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中所述TCR亚基和所述抗MSLN结合结构域可操作地连接，其中所述第二TFP在T细胞中表达时在功能上与TCR相互作用或并入TCR中。

在一方面，本文提供了一种组合物，其包含(I)编码第一T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的第一重组核酸序列，所述第一T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)包含TCR亚基，所述TCR亚基包含TCR胞外结构域的至少一部分、跨膜结构域和TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自仅衍生自选自由TCRα链、TCRβ链、CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链组成的组的TCR亚基的胞内信号传导结构域的刺激结构域；以及包含抗MUC16结合结构域的第一人或人源化抗体结构域和包含抗MSLN结合结构域的第二人或人源化抗体结构域；其中所述TCR亚基、所述第一抗体结构域和所述第二抗体结构域可操作地连接，并且其中所述第一TFP在T细胞中表达时在功能上与TCR相互作用或并入TCR中。

在一方面，本文提供了一种组合物，其包含重组核酸分子，所述重组核酸分子编码：包含TCR亚基的第一T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、包含作为抗MUC16结合结构域的第一抗原结合结构域的第一人或人源化抗体结构域；以及包含TCR亚基的第二T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、包含作为抗MSLN结合结构域的第二抗原结合结构域的第二人或人源化抗体结构域，其中第一TFP的TCR亚基和第一抗体结构域可操作地连接并且第二TFP的TCR亚基和第二抗体结构域可操作地连接。

在一方面，本文提供了一种组合物，其包含重组核酸分子，所述重组核酸分子编码：包含TCR亚基的第一T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、包含作为抗MUC16结合结构域的第一抗原结合结构域的第一人或人源化抗体结构域和包含作为抗MSLN结合结构域的第二抗原结合结构域的第二人或人源化抗体结构域；其中第一TFP的TCR亚基、第一抗体结构域和第二抗体结构域可操作地连接。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自选自由TCRα链、TCRβ链、CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链组成的组的TCR亚基。

在一些实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链和TCRε链组成的组的TCR亚基。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRα链。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRβ链。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRγ链。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRδ链。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3γ链。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3δ链。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3ε链。

在一些实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRα链。

在一些实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRβ链。

在一些实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRγ链。

在一些实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自TCRδ链。

在一些实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3γ链。

在一些实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3δ链。

在一些实施方案中，第二TFP的TCR亚基的胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域仅衍生自CD3ε链。

在一些实施方案中，第一TFP、第二TFP或两者当在T细胞中表达时并入TCR中或在功能上与TCR相互作用。

在一些实施方案中，第一TFP、第二TFP或两者当在T细胞中表达时并入TCR中或在功能上与TCR相互作用。

在一些实施方案中，编码的第一抗原结合结构域通过第一接头序列连接至第一TFP的TCR胞外结构域，编码的第二抗原结合结构域通过第二接头序列连接至第二TFP的TCR胞外结构域，或者第一抗原结合结构域通过第一接头序列连接至第一TFP的TCR胞外结构域并且编码的第二抗原结合结构域通过第二接头序列连接至第二TFP的TCR胞外结构域。

在一些实施方案中，第一接头序列和第二接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至4。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基、第二TFP的TCR亚基或两者均包含TCR胞外结构域。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基、第二TFP的TCR亚基或两者包含TCR跨膜结构域。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基、第二TFP的TCR亚基或两者包含TCR胞内结构域。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基、第二TFP的TCR亚基或两者包含(i)TCR胞外结构域、(ii)TCR跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个来自同一TCR亚基。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基、第二TFP的TCR亚基或两者包含TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含选自CD3ε、CD3γ或CD3δ的胞内信号传导结构域或对其具有至少一个修饰的氨基酸序列的刺激结构域。

在一些实施方案中，第一TFP的TCR亚基、第二TFP的TCR亚基或两者包含胞内结构域，所述胞内结构域包含选自4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域或对其具有至少一个修饰的氨基酸序列的刺激结构域。

在一些实施方案中，第一人或人源化抗体结构域、第二人或人源化抗体结构域或两者包含抗体片段。

在一些实施方案中，第一人或人源化抗体结构域、第二人或人源化抗体结构域或两者包含scFv或VH结构域。

在一些实施方案中，组合物编码(i)与表2的轻链序列具有70-100％序列同一性的轻链结合结构域氨基酸序列的轻链(LC)CDR1、LC CDR2和LC CDR3，和/或(ii)表2的重链序列的重链(HC)CDR1、HC CDR2和HC CDR3。

在一些实施方案中，组合物编码轻链可变区，其中轻链可变区包含具有表2的轻链可变区氨基酸序列的至少一个但不多于30个修饰的氨基酸序列，或与表2的轻链可变区氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。

在一些实施方案中，组合物编码重链可变区，其中重链可变区包含具有表2的重链可变区氨基酸序列的至少一个但不多于30个修饰的氨基酸序列，或与表2的重链可变区氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。

在一些实施方案中，编码的第一TFP、编码的第二TFP或两者包含TCR亚基的胞外结构域，其包括选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能性片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列组成的组的蛋白质的胞外结构域或其一部分。

在一些实施方案中，编码的第一TFP和编码的第二TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能性片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列组成的组的蛋白质的跨膜结构域。

在一些实施方案中，编码的第一TFP和编码的第二TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自由TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能性片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列组成的组的蛋白质的跨膜结构域。

在一些实施方案中，组合物还包含编码共刺激结构域的序列。

在一些实施方案中，共刺激结构域是从选自由OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)及对其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域。

在一些实施方案中，组合物还包含编码胞内信号传导结构域的序列。

在一些实施方案中，组合物还包含前导序列。

在一些实施方案中，组合物还包含蛋白酶切割位点。

在一些实施方案中，对其的至少一个但不超过20个修饰包括介导细胞信号传导的氨基酸的修饰或响应于配体与第一TFP、第二TFP或两者的结合而磷酸化的氨基酸的修饰。

在一些实施方案中，分离的核酸分子是mRNA。

在一些实施方案中，第一TFP、第二TFP或两者包含TCR亚基的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，所述ITAM包含选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、TCRζ链、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a，CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能性片段及对其具有至少一个但不多于20个修饰的氨基酸序列组成的组的蛋白质的ITAM或其一部分。

在一些实施方案中，ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。

在一些实施方案中，ITAM选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组，并替代选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组的不同ITAM。

在一些实施方案中，组合物还包含前导序列。

在一方面，本文提供了一种组合物，其包含由本文所述的组合物的核酸分子编码的多肽分子。

在一些实施方案中，多肽包含由第一核酸分子编码的第一多肽和由第二核酸分子编码的第二多肽。

在一方面，本文提供了一种组合物，其包含由本文所述的组合物的核酸分子编码的重组TFP分子。

在一方面，本文提供了一种包含载体的组合物，所述载体包含编码本文所述的多肽或重组TFP分子的核酸分子。

在一些实施方案中，载体包含a)第一载体，其包含编码第一TFP的第一核酸分子；和b)第二载体，其包含编码第二TFP的第二核酸分子。

在一些实施方案中，载体选自由DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体组成的组。

在一些实施方案中，载体还包含启动子。

在一些实施方案中，载体是体外转录的载体。

在一些实施方案中，载体中的核酸分子进一步编码聚(A)尾。

在一些实施方案中，载体中的核酸分子进一步编码3’UTR。

在一些实施方案中，载体中的核酸分子进一步编码蛋白酶切割位点。

在一方面，本文提供了一种组合物，其包含细胞，所述细胞包含本文所述的组合物。

在一些实施方案中，细胞是人T细胞。

在一些实施方案中，T细胞是CD8+或CD4+ T细胞。

在一些实施方案中，细胞还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含含有抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。

在一些实施方案中，抑制性分子包含含有PD1的至少一部分的第一多肽和含有共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。

在一方面，本文提供了一种治疗患有与MSLN或MUC16表达有关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的本文所述的组合物。

在一些实施方案中，与MUC16或MSLN表达有关的疾病选自由以下组成的组：增生性疾病、癌症、恶性肿瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合症、白血病前期、与MUC16表达有关的非癌相关适应症、与MSLN表达有关的非癌相关适应症、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、食道癌、胃癌和不可切除的卵巢癌伴复发性或难治性疾病。

在一些实施方案中，所述疾病是选自由以下组成的组的血液癌症：B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴性白血病(T-ALL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞前淋巴细胞性白血病、母细胞浆细胞样树突细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞滤泡性淋巴瘤、大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病状、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常、骨髓增生异常综合症、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、华氏巨球蛋白血症、白血病前期、与MUC16或MSLN表达有关的疾病及其组合。

在一些实施方案中，表达第一TFP分子和第二TFP分子的细胞与增加表达第一TFP分子和第二TFP分子的细胞的功效的剂组合施用。

在一些实施方案中，与施用有效量的表达抗MSLN嵌合抗原受体(CAR)；抗MUC16CAR；抗MSLN CAR和抗MUC16 CAR；或其组合的T细胞的哺乳动物相比，哺乳动物中释放更少的细胞因子。

在一些实施方案中，将表达第一TFP分子和第二TFP分子的细胞与减轻与表达第一TFP分子和第二TFP分子的细胞的施用有关的一种或多种副作用的剂组合施用。

在一些实施方案中，将表达第一TFP分子和第二TFP分子的细胞与治疗与MSLN或MUC16有关的疾病的剂组合施用。

在一方面，本文描述了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的核酸分子，所述T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)包含TCR亚基和包含抗肿瘤抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗肿瘤抗原结合结构域例如抗BCMA、抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗MUC16、抗MSLN等。在一些实施方案中，TCR亚基包含TCR胞外结构域。在其他实施方案中，TCR亚基包含TCR跨膜结构域。在又其他实施方案中，TCR亚基包含TCR胞内结构域。在另外的实施方案中，TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域、(ii)TCR跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个来自相同的TCR亚基。在另外的实施方案中，TCR亚基包含TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含选自CD3ε、CD3γ或CD3δ的胞内信号传导结构域或对其具有至少一个、两个或三个修饰的氨基酸序列的刺激性结构域。在另外的实施方案中，TCR亚基包含胞内结构域，其包含选自4-IBB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域或对其具有至少一个、两个或三个修饰的氨基酸序列的刺激性结构域。

在一些实施方案中，人或人源化抗体结构域包含抗体片段。在一些实施方案中，人或人源化抗体结构域包含scFv或V

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含(i)本文提供的任何抗肿瘤相关抗原轻链结合结构域氨基酸序列的轻链(LC)CDR1、LC CDR2和LC CDR3，和/或(ii)本文提供的任何抗肿瘤相关抗原重链结合结构域氨基酸序列的重链(HC)CDR1、HC CDR2和HC CDR3。

在一些实施方案中，轻链可变区包含具有本文提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在其他实施方案中，重链可变区包含具有本文提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。

在一些实施方案中，TFP包含TCR亚基的胞外结构域，其包括选自由T细胞受体的α或β链、CD3δ、CD3ε或CD3γ、或其功能性片段、或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列组成的组的蛋白质的胞外结构域或其一部分。在一些实施方案中，编码的TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自由TCR的α、β链或TCR亚基CD3ε、CD3γ和CD3δ、或其功能性片段、或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列组成的组的蛋白质的跨膜结构域。

在一些实施方案中，编码的TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自由TCR的α、β或ζ链、或CD3ε、CD3γ和CD3δCD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD 154、或其功能性片段、或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列组成的组的蛋白质的跨膜结构域。

在一些实施方案中，编码的抗肿瘤相关抗原结合结构域通过接头序列连接至TCR胞外结构域。在一些情况下，编码的接头序列包含(G

在一些实施方案中，分离的核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一些情况下，共刺激结构域是从选自由OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)、或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域。

在一些实施方案中，分离的核酸分子还包含前导序列。

本文还提供了由任何先前所述的核酸分子编码的分离的多肽分子。

在另一方面，本文还提供了分离的T细胞受体融合蛋白(TFP)分子，其包含人或人源化抗肿瘤相关抗原结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施方案中，分离的TFP分子包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人或人源化抗肿瘤相关抗原结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。

在一些实施方案中，抗肿瘤相关抗原结合结构域是scFv或V

在一些实施方案中，抗肿瘤相关抗原结合结构域通过接头序列连接至TCR胞外结构域。在一些情况下，接头区域包含(G

在一些实施方案中，分离的TFP分子还包含编码共刺激结构域的序列。在其他实施方案中，分离的TFP分子还包含编码胞内信号传导结构域的序列。在又其他实施方案中，分离的TFP分子还包含前导序列。

本文还提供了包含编码任何先前所述的TFP分子的核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体选自由DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体组成的组。在一些实施方案中，载体还包含启动子。在一些实施方案中，载体是体外转录的载体。在一些实施方案中，载体中的核酸序列还包含聚(A)尾。在一些实施方案中，载体中的核酸序列还包含3'UTR。

本文还提供了包含任何所述的载体的细胞。在一些实施方案中，细胞是人T细胞。在一些实施方案中，细胞是CD8+或CD4+ T细胞。在其他实施方案中，细胞还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含含有抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述第一多肽与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。在一些情况下，抑制性分子包含含有PD1的至少一部分的第一多肽和含有共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。

在另一方面，本文提供了分离的TFP分子，其包含人或人源化抗肿瘤相关抗原结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够与内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽在功能上相互作用。

在另一方面，本文提供了分离的TFP分子，其包含人或人源化抗肿瘤相关抗原结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够在功能上整合到内源性TCR复合物中。

在另一方面，本文提供了包含至少两种TFP分子的人CD8+或CD4+ T细胞，所述TFP分子包含人或人源化抗肿瘤相关抗原结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域以及胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+或CD4+ T细胞表面中、表面处和/或表面上的内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽在功能上相互作用。

在另一方面，本文提供了蛋白质复合物，其包含：i)TFP分子，所述TFP分子包含人或人源化抗肿瘤相关抗原结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；和ii)至少一种内源性TCR复合物。

在一些实施方案中，TCR包含选自由T细胞受体的α或β链、CD3δ、CD3ε或CD3γ组成的组的蛋白质的胞外结构域或其一部分。在一些实施方案中，抗肿瘤相关抗原结合结构域通过接头序列连接至TCR胞外结构域。在一些情况下，接头区域包含(G

本文还提供了人CD8+或CD4+ T细胞，所述细胞包含每个所述蛋白质复合物至少两种不同的TFP蛋白。

在另一方面，本文提供了人CD8+或CD4+ T细胞群体，其中所述群体的T细胞单独或共同包含至少两种TFP分子，所述TFP分子包含人或人源化抗肿瘤相关抗原结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+或CD4+ T细胞表面中、表面处和/或表面上的内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽在功能上相互作用。

在另一方面，本文提供了人CD8+或CD4+ T细胞的群体，其中所述群体的T细胞单独或共同包含至少两种由本文提供的分离的核酸分子编码的TFP分子。

在另一方面，本文提供了制备细胞的方法，所述方法包括用任何所述载体转导T细胞。

在另一方面，本文提供了产生RNA工程化细胞群体的方法，所述方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞中，其中RNA包含编码任何所述TFP分子的核酸。

在另一方面，本文提供了在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的表达任何所述TFP分子的细胞。在一些实施方案中，细胞是自体T细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体T细胞。在一些实施方案中，哺乳动物是人。

在另一方面，本文提供了治疗患有与肿瘤相关抗原的表达相关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的包含任何所述TFP分子的细胞。在一些实施方案中，与肿瘤相关抗原表达有关的疾病选自增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症如脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征或白血病前期，或是与肿瘤相关抗原表达有关的非癌症相关适应症。在一些实施方案中，疾病是选自由以下组成的组的血液癌症：一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴性白血病(“B-ALL”)、T细胞急性淋巴性白血病(“T-ALL”)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其他血液学癌症或血液学病症，包括但不限于B细胞前淋巴细胞性白血病、母细胞浆细胞样树突细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞滤泡性淋巴瘤或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性病状、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、郁积型多发性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、浆细胞白血病、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合症、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、华氏巨球蛋白血症和“白血病前病”，它们是由骨髓血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液学病症的多样集合，以及与肿瘤相关抗原表达有关的疾病，包括但不限于表达肿瘤相关抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增生性疾病；及其组合。

在一些实施方案中，表达任何所述TFP分子的细胞与减轻与表达TFP分子的细胞的施用有关的一种或多种副作用的剂组合施用。在一些实施方案中，将表达任何所述TFP分子的细胞与治疗与肿瘤相关抗原有关的疾病的剂组合施用。

本文还提供了用作药物的任何所述的分离的核酸分子、任何所述的分离的多肽分子、任何所述的分离的TFP、任何所述的蛋白质复合物、任何所述的载体或任何所述的细胞。

1.定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

冠词“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即至少一个/种)的所述冠词的语法宾语。通过举例的方式，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。

如本文所用，“约”可以意指±小于1％或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％或大于30％，这取决于情况并且为本领域技术人员已知或可知的。

如本说明书所用，“受试者”或“个体”可包括但不限于哺乳动物，例如人或非人哺乳动物，例如驯养的动物、农业动物或野生的动物，以及鸟类和水生动物。“患者”是患有疾病、病症或病状或处于发展疾病、病症或病状风险下或在其他情况下需要本文提供的组合物和方法的受试者

如本文所用，“治疗(treating/treatment)”是指成功治疗或减轻疾病或病状的任何指征。治疗可以包括例如降低、延迟或减轻疾病或病状的一种或多种症状的严重性，或其可包括降低患者经历疾病、缺陷、病症或不良病状等的症状的频率。如本文所用，“治疗或预防”有时在本文中用于指导致疾病或病症的某种程度的治疗或减轻并且考虑针对该目的的一系列结果的方法，包括但不限于完全预防病状。

如本文所用，“预防”是指预防患者的疾病或病状，例如肿瘤形成。例如，如果用本发明的方法治疗处于发展肿瘤或其他形式的癌症风险下的个体并且以后不发展为肿瘤或其他形式的癌症，则已经在该个体中至少在一段时间内预防了所述疾病。

如本文所用，“治疗有效量”是足以向施用组合物的个体提供有益效果或以其他方式减少有害的非有益事件的组合物或其活性组分的量。本文中的“治疗有效剂量”是指对其施用产生一种或多种需要的或期望的(例如，有益的)效果的剂量，这种施用在给定的时间段内发生一次或多次。确切剂量将取决于治疗目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；和Pickar,Dosage Calculations(1999))。

如本文所用，“T细胞受体(TCR)融合蛋白”或“TFP”包括衍生自包含TCR的各种多肽的重组多肽，所述TCR通常能够i)结合靶细胞上的表面抗原并且ii)与完整TCR复合物的其他多肽组分相互作用，通常当共同位于T细胞中或表面上时。

如本文所用，术语“抗体”是指衍生自特异性结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆来源的完整免疫球蛋白或其片段，并且可以衍生自天然来源或重组来源。

术语“抗体片段”或“抗体结合结构域”是指抗体的至少一部分或其重组变体，其含有足以赋予抗体片段对靶标(例如抗原及其定义的表位)的识别和特异性结合的抗原结合结构域，即完整抗体的抗原决定性可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')

术语“scFv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链可变区和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单个多肽链，并且其中scFv保留了其所来源的完整抗体的特异性。

关于抗体的“重链可变区”或“V

除非说明，如本文所用，scFv可具有任一顺序的V

本发明的TFP组合物的包含抗体或其抗体片段的部分可以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)或重链抗体HCAb 242：423-426)。在一方面，本发明的TFP组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一方面，TFP包含抗体片段，所述抗体片段包括scFv或sdAb。

术语“抗体重链”是指以天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大多肽链，并且其通常确定抗体所属的类别。

术语“抗体轻链”是指以天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小多肽链。Kappa(“κ”)和lambda(“λ”)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。所述术语应被解释为意指一种抗体或指定所述抗体的氨基酸序列，所述抗体通过合成编码所述抗体的DNA分子来生成并且所述DNA分子表达抗体蛋白质，其中所述DNA或氨基酸序列使用本领域中可得到的且熟知的重组DNA或氨基酸序列技术来获得。

术语“抗原”或“Ag”是指能够被抗体特异性结合或另外激发免疫应答的分子。这种免疫反应可能涉及抗体产生，或者特定的免疫感受态细胞的活化，或者这两者。

本领域技术人员将理解包括实际上所有的蛋白质或肽在内的任何大分子均可以充当抗原。另外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，包含编码引出免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA均因此编码本文所使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以多种组合排列以编码引出期望的免疫应答的多肽。此外，本领域技术人员将理解，抗原根本不需要由一个“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成生成或者可以来源于生物样品，或者可以是除多肽之外的大分子。此种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。

术语“抗肿瘤效应”是指可以通过各种方式表现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数量的减少、转移瘤数量的减少、预期寿命的增加、肿瘤细胞增殖的减少、肿瘤细胞存活率的降低或与癌性病状有关的各种生理症状的减轻。“抗肿瘤效应”还可通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体最初预防肿瘤发生的能力表现出来。

术语“自体的”是指来源于同一个体且后来又再引入到所述个体中的任何材料。

术语“同种异体的”是指来源于与引入所述材料的个体相同物种的不同动物或不同患者的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被认为是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传学上充分不同以抗原性地相互作用。

术语“异种的”是指来源于不同物种的动物的移植物。

术语“癌症”是指其特征在于异常细胞的快速且不受控生长的疾病。癌细胞可以局部地扩散或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其他部分。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、不可切除的卵巢癌伴复发性或难治性疾病等。

术语“保守性序列修饰”是指不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。所述保守性修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术诸如定点诱变和PCR介导的诱变将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守性氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的TFP内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且改变的TFP可以使用本文所述的功能测定法进行测试。

术语“刺激”是指由刺激结构域或刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导的初级应答，从而介导信号转导事件，例如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的表达的改变和/或细胞骨架结构的重组等。

术语“刺激性分子”或“刺激性结构域”是指由T细胞表达的分子或其部分，其提供对于T细胞信号传导途径的至少一些方面以刺激方式调节TCR复合物的初级活化的一个或多个初级胞质信号传导序列。在一方面，初级信号由例如TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子的结合引发，并这导致T细胞应答的介导，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或“ITAM”的信号传导基序。在本发明中特别有用的含有初级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)和CD66d的那些。

术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指在其表面上展示出与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原的免疫系统细胞，例如辅助细胞(例如B细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将其呈递给T细胞。

如本文所用的术语“胞内信号传导结构域”是指分子的胞内部分。胞内信号传导结构域产生促进含有TFP的细胞(例如表达TFP的T细胞)的免疫效应子功能的信号。例如在表达TFP的T细胞中的免疫效应子功能的实例包括细胞溶解活性和T辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括衍生自负责初级刺激或抗原依赖性模拟的分子的那些结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些结构域。

初级胞内信号传导结构域可以包含ITAM(“基于免疫受体酪氨酸的活化基序”)。含有初级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d DAP10和DAP12的那些。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫应答所需的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC 1类分子、BTLA和Toll配体受体以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。共刺激胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的胞内部分。共刺激分子可表示为以下蛋白质家族：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和NK细胞活化受体。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3和特异性结合CD83的配体等。胞内信号传导结构域可包含其衍生分子的整个胞内部分或整个天然胞内信号传导结构域或其功能性片段。术语“4-1BB”是指具有以GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族成员，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基；并且“4-IBB共刺激结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基。

术语“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的核苷酸的特定序列充当在生物学过程中合成具有限定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因、cDNA或RNA的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生所述蛋白质，则所述基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常提供在序列表中)和非编码链(用作基因或cDNA的转录模板)两者均可称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

除非另外指明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并型式并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语核苷酸序列还可包含内含子，以达到编码蛋白质的核苷酸序列可在某一型式中含有一个或多个内含子的程度。

术语“有效量”或“治疗有效量”在本文可互换使用，并且是指有效实现特定生物学或治疗结果的如本文所述的化合物、制剂、材料或组合物的量。

术语“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。

术语“外源性的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何物质。

术语“表达”是指具体核苷酸序列由启动子驱动的转录和/或翻译。

术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送分离的核酸的物质组合物。多种载体为本领域中已知的，其包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲性化合物缔合的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还应解释为还包括有助于将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接到待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用表达元件；其他表达元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域中所有已知的表达载体，包括粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，所述表达载体并入有重组多核苷酸。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中在能够感染非分裂细胞方面是独特的；所述慢病毒可将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，所以它们是基因递送载体的最高效方法中的一种。HIV、SIV和FIV是慢病毒的所有实例。

术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)所提供的自身失活的慢病毒载体。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自Oxford BioMedica的LENTIVECTOR

术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子(例如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置处是同源或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，聚合物十个亚基长度中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个中的9个)是匹配或同源的，则两个序列是90％同源的。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)

“人”或“完全人”是指免疫球蛋白，例如抗体或抗体片段，其中整个分子是人类来源的或由与人形式的抗体或免疫球蛋白相同的氨基酸序列组成。

术语“分离的”意指从天然状态发生改变或去除。例如，在活动物体中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但部分地或完全地从其天然状态的共存物质分离出来的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以大体上纯化的形式存在，或者可存在于非天然环境(例如像宿主细胞)中。

在本发明的上下文中，使用普遍存在的核酸碱基的以下缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。

术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调节序列与异源核酸序列之间的引起所述异源核酸序列表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列以功能性关系放置时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接到编码序列。可操作地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如，在需要时在相同的阅读框中连接两个蛋白质编码区。

术语免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸类似的结合特性，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另外指明，否则具体核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代可通过产生序列来实现，在所述序列中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸并且对于可构成蛋白质的或肽的序列的氨基酸的最大数目没有设限。多肽包括含有通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指短链和长链，所述短链在本领域中还通常称为例如肽、寡肽和低聚物，所述长链在本领域中通常称为蛋白质，其中存在许多种类型。“多肽”包括例如生物活性片段、大体上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。

术语“启动子”是指由细胞的转录机构或引入的合成机构识别的、启动多核苷酸序列的特异性转录所需要的DNA序列。

术语“启动子/调节序列”是指表达可操作地连接到启动子/调节序列的基因产物所需要的核酸序列。在一些情况下，此序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，此序列还可包括增强子序列和表达基因产物所需要的其他调节元件。所述启动子/调节序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。

术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时引起基因产物在细胞的大多数或全部生理条件下在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时引起基因产物大体上仅在对应于启动子的诱导物在细胞中存在时在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“组织特异性”启动子是指当与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时引起基因产物大体上仅在细胞为对应于启动子的组织型细胞的情况下在细胞中产生的核苷酸序列。

如在scFv的上下文中使用的术语“接头”和“柔性多肽接头”是指由单独或组合使用的氨基酸诸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起的肽接头。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头，并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)

如本文所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前”端或5'端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由连接至第一转录核苷酸的末端基团组成。其存在对于由核糖体进行的识别和来自RNA酶的保护是关键的。加帽与转录偶联，并且共转录地发生，从而彼此影响。转录开始后不久，所合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。这种酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生化反应进行。可以修饰加帽部分以调节mRNA的功能性，例如其稳定性或翻译效率。

如本文所用，“体外转录的RNA”是指已经在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体生成。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。

如本文所用，“聚(A)”是通过聚腺苷酸化连接至mRNA的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施方案中，聚A为50-5000个，优选地大于64个，更优选地大于100个，最优选地大于300个或400个。聚(A)序列可以被化学或酶促修饰以调节mRNA功能，例如定位、稳定性或翻译效率。

如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酸基部分或其修饰变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾是通过酶多腺苷酸聚合酶的作用添加到前mRNA的长腺嘌呤核苷酸(通常为数百个)序列。在高等真核生物中，将聚(A)尾添加到含有特定序列聚腺苷酸化信号的转录物上。聚(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核输出以及翻译也是重要的。DNA转录为RNA后，聚腺苷酸化立即在细胞核中发生，但另外也可稍后在细胞质中发生。转录终止后，通过与RNA聚合酶缔合的核酸内切酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点的特征通常在于在切割位点附近存在碱基序列AAUAAA(SEQ IDNO:98)。在mRNA被切割后，将腺苷残基添加到切割位点的游离3'端。

如本文所用，“瞬时”是指非整合的转基因在数小时、数天或数周的时间段内表达，其中表达的时间段小于在整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内时基因表达的时间段。

术语“信号转导途径”是指在信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并跨细胞膜传输信号的分子和分子复合物。

术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人)。

术语“大体上纯化的”细胞是指基本上不含其他细胞类型的细胞。大体上纯化的细胞还是指与在天然存在状态中所述细胞通常与其缔合的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，大体上纯化的细胞的群体是指细胞的同源群体。在其他情况下，此术语简单地是指与在天然状态中所述细胞天然地与其缔合的细胞分离的细胞。在一些方面，细胞在体外进行培养。在其他方面，细胞不在体外进行培养。

如本文所用，术语“治疗”意指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态获得治疗效果。

如本文所用，术语“预防”是指对疾病或疾病状态的预防或保护性治疗。

在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增生性病症抗原”或“与过度增生性病症相关的抗原”是指特定过度增生性疾病共有的抗原。在某些方面，本发明的过度增生性病症抗原来源于癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、NHL、白血病、子宫癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌，例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、不可切除的卵巢癌伴复发性或难治性疾病。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入到宿主细胞中的方法。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代主题细胞和其后代。

术语“特异性结合”是指抗体、抗体片段或特异性配体识别并结合样品中存在的同源结合配偶体(例如，BCMA)，但不一定并基本上识别或结合样品中的其他分子。

范围：贯穿本公开，本发明的各个方面可以范围格式呈现。应理解，呈范围格式的描述仅为了方便和简洁起见，并且不应解释为对本发明的范围进行不可改变的限制。因此，对范围的描述应被认为已经确切地公开所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如，诸如1至6的范围描述应当被认为具有确切公开的子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等等，以及所述范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个实例，诸如95-99％同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的事物，并且包括例如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性的子范围。此在任何宽度范围的条件下均适用。

2.T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)

本发明涵盖编码TFP的重组DNA构建体，其中TFP包含与BCMA(例如人BCMA)特异性结合的抗体片段，其中所述抗体片段的序列与编码TCR亚基或其部分的核酸序列相邻并在同一阅读框中。本文提供的TFP能够与一个或多个内源性TCR亚基(或可替代地，一个或多个外源性亚基、或内源性亚基和外源性亚基的组合)缔合，以形成功能性TCR复合物。

在一个方面，本发明的TFP包含靶特异性结合元件，其另外地称为抗原结合结构域。所述部分的选择取决于限定靶细胞表面的靶抗原的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别充当与特定疾病状态有关的靶细胞上的细胞表面标记的靶抗原。因此，可充当本发明的TFP中的抗原结合结构域的靶抗原的细胞表面标记的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染；自身免疫性疾病；和癌性疾病(例如恶性疾病)有关的那些实例。

在一方面，TFP介导的T细胞应答可通过将抗原结合结构域工程化到特异性结合所需抗原的TFP中而针对感兴趣抗原。

在一方面，TFP的包含抗原结合结构域的部分包含靶向BCMA的抗原结合结构域。在一方面，抗原结合结构域靶向人BCMA。

抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体，例如骆驼衍生的纳米抗体的重链可变结构域(V

因此，一方面，抗原结合结构域包含人源化或人抗体或抗体片段、或鼠抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人源化或人抗BCMA结合结构域包含本文所述的人源化或人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文所述的人源化或人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如包含一个或多个(例如全部三个)LC CDR和一个或多个(例如全部三个)HC CDR的人源化或人抗BCMA结合结构域。在一个实施方案中，人源化或人抗BCMA结合结构域包含本文所述的人源化或人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如人源化或人抗肿瘤相关抗原结合结构域具有两个可变重链区，每个均包含本文所述的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一个实施方案中，人源化或人抗肿瘤相关抗原结合结构域包含本文所述的人源化或人轻链可变区和/或本文所述的人源化或人重链可变区。在一个实施方案中，人源化或人抗肿瘤相关抗原结合结构域包含本文所述的人源化重链可变区，例如至少两个本文所述的人源化或人重链可变区。在一个实施方案中，抗肿瘤相关抗原结合结构域是包含本文提供的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，抗肿瘤相关抗原结合结构域(例如scFv或V

在一些方面，非人抗体是人源化抗体，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与在人中天然产生的抗体或其片段的相似性。在一方面，抗原结合结构域是人源化结构域。

可以使用本领域已知的多种技术来产生人源化抗体，所述技术包括但不限于CDR移植(参见例如欧洲专利号EP 239,400；国际公布号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其各自以引用的方式整体并入本文中)、镶面或表面重整(参见例如欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguska等人,1994,PNAS,91:969-973，其各自以引用的方式整体并入本文中)、链改组(参见例如美国专利号5,565,332，其以引用的方式整体并入本文中)以及在例如美国专利申请公布号US2005/0042664；美国专利申请公布号US2005/0048617；美国专利号6,407,213；美国专利号5,766,886；国际公布号WO 9317105；Tan等人,I.Immunol.,169:1119-25(2002)；Caldas等人,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)；Morea等人,Methods,20(3):267-79(2000)；Baca等人,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)；Roguska等人,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)；Couto等人,Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995)；Couto等人,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)；Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)；以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)公布的技术，所述文献各自以引用的方式整体并入本文中。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变(例如改善)抗原结合。这些框架取代可通过本领域中熟知的方法进行鉴别，例如通过对CDR与框架残基的相互作用进行建模来鉴别对于抗原结合来说重要的框架残基并通过进行序列比较来鉴别特定位置的稀有框架残基(参见例如Queen等人,美国专利号5,585,089；和Riechmann等人,1988,Nature,332:323，其全部内容以引用的方式并入本文。)

人源化抗体或抗体片段具有从非人来源保留在其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。如本文提供的，人源化抗体或抗体片段包含一个或多个来自非人免疫球蛋白分子的CDR以及框架区，其中构成框架的氨基酸残基完全或大部分来源于人种系。用于使抗体或抗体片段人源化的多种技术是本领域熟知的，并且基本上可以按照Winter及其同事的方法(Jones等,Nature，321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature，332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science，239:1534-1536(1988))，通过用人抗体的对应序列取代啮齿动物CDR或CDR序列(即CDR移植)(EP239,400；PCT公布号WO 91/09967；以及美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640；其内容以引用的方式整体并入本文中)进行。在此类人源化抗体和抗体片段中，大体上小于完整的人可变结构域已被来自非人物种的对应序列取代。人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。抗体和抗体片段的人源化还可以通过镶面或表面重整(EP592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；和Roguska等,PNAS，91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)来实现，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文中。

用于制备人源化抗体的人可变结构域轻链和重链的选择是降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受与啮齿动物的序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容以引用的方式整体并入本文中)。另一种方法使用源自特定亚组的轻链或重链的全部人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于若干不同的人源化抗体(参见例如Nicholson等人Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993)，其内容以引用的方式整体并入本文中)。在一些实施方案中，重链可变区的框架区(例如所有四个框架区)均衍生自V

在一些方面，本发明的TFP组合物的包含抗体片段的部分是人源化的，其中保留了对靶抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。根据本发明的一方面，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体和抗体片段。三维免疫球蛋白模型通常是可用的并且是本领域技术人员熟悉的。示出并展示出所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可用的。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以这种方式，可从受体序列和输入序列中选择并合并FR残基，从而实现所需的抗体或抗体片段特征，诸如增加的对靶抗原的亲和力。通常，CDR残基直接并且最基本地参与影响抗原结合。

在一方面，抗肿瘤相关抗原结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)或骆驼重链(V

本文还提供了用于获得对靶抗原(例如，BCMA或融合部分结合结构域的靶标的本文其他地方描述的任何靶抗原)具有特异性的抗体抗原结合结构域的方法，所述方法包括通过在本文列出的V

在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备V

scFv可在其V

3.稳定性和突变

抗肿瘤相关抗原结合结构域例如scFv分子(例如可溶性scFv)的稳定性可以参照常规对照scFv分子或全长抗体的生物物理特性(例如热稳定性)来评价。在一个实施方案中，在所述测定中人源化或人scFv的热稳定性比亲本scFv大约0.1、约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃或约15℃。

抗肿瘤相关抗原结合结构域(例如scFv)的改善的热稳定性随后被赋予整个肿瘤相关性抗原-TFP构建体，从而导致抗肿瘤相关抗原TFP构建体的治疗特性得到改善。与常规抗体相比，抗肿瘤相关抗原结合结构域(例如scFv)的热稳定性可以提高至少约2℃或3℃。在一个实施方案中，与常规抗体相比，抗肿瘤相关抗原结合结构域(例如scFv)具有提高1℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与常规抗体相比，抗肿瘤相关抗原结合结构域(例如scFv)具有提高2℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与常规抗体相比，scFv具有提高4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃的热稳定性。例如，可以在本文公开的scFv分子和scFv V

scFv中的突变(通过可溶性scFv的人源化或诱变而产生)改变了scFv的稳定性，并改善了scFv和抗肿瘤相关抗原TFP构建体的总体稳定性。使用诸如T

在一方面，TFP的抗原结合结构域包含与本文描述的抗原结合结构域氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且抗原结合结构域保留本文所述的抗肿瘤相关抗原抗体片段的所需功能特性。在一个特定方面，本发明的TFP组合物包含抗体片段。在另一方面，该抗体片段包含scFv。

在各个方面，通过修饰一个或两个可变区(例如V

本领域普通技术人员将理解，可以进一步修饰本发明的抗体或抗体片段，使得它们的氨基酸序列(例如，来自野生型)发生变化，但是所需活性不变化。例如，可以对蛋白质进行额外核苷酸取代，从而产生在“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代。例如，分子中的非必需氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以被在侧链家族成员的顺序和/或组成方面不同的结构上相似的串置换，例如可以进行保守性取代，其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换。

具有类似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中进行了定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

同一性百分比在两种或更多种核酸或多肽序列的情形中是指两个或更多个序列是相同的。当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时，如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和视觉检查所测量的，如果两个序列具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域上或当未指定时在整个序列上60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。

为了进行序列比较，通常，一个序列充当参考序列，以与测试序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算出测试序列相对于参比序列的序列相同百分比。比对用于比较的序列的方法为本领域熟知的。用于比较的最佳序列比对可以例如通过Smith和Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法；通过Pearson和Lipman,(1988)Proc Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的搜索相似性方法；通过这些算法的计算机化实现(威斯康星州麦迪逊市科学博士575遗传计算机组威斯康星遗传学软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或通过手动比对和视觉检查(参见例如Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)来进行。适用于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中描述。用于执行BLAST分析的软件通过National Center for Biotechnology Information公开可用。

在一方面，本发明考虑了产生功能上等同的分子的起始抗体或片段(例如，scFv)氨基酸序列的修饰。例如，可以对包含在TFP中的抗肿瘤相关抗原结合结构域(例如scFv)的V

4.胞外结构域

胞外结构域可以源自天然来源或重组来源。在来源是天然来源的情况下，所述结构域可以衍生自任何蛋白质，但特别衍生自膜结合或跨膜蛋白质。一方面，胞外结构域能够与跨膜结构域结合。在本发明中特别有用的胞外结构域可以至少包含例如T细胞受体的α、β或ζ链，或CD3ε、CD3γ或CD3δ，或在替代实施方案中，CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的一个或多个胞外区域。

5.跨膜结构域

通常，TFP序列含有由单个基因组序列编码的胞外结构域和跨膜结构域。在替代性实施方案中，可以将TFP设计为包含与TFP的胞外结构域异源的跨膜结构域。跨膜结构域可包含与跨膜区相邻的一个或多个额外氨基酸，例如与跨膜蛋白所衍生的蛋白质的胞外区有关的一个或多个氨基酸(例如，胞外区的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或多个氨基酸)和/或与跨膜蛋白所衍生的蛋白质的胞内区有关的一个或多个额外氨基酸(例如，胞内区的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或多个氨基酸)。在某些情况下，跨膜结构域可包含胞外区的至少30、35、40、45、50、55、60或更多个氨基酸。在某些情况下，跨膜结构域可包含胞内区的至少30、35、40、45、50、55、60或更多个氨基酸。在一方面，跨膜结构域是与TFP的其他结构域中的一个缔合使用的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以便使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。在一方面，跨膜结构域能够与TFP T细胞表面上的另一TFP同源二聚化。在不同的方面，可以修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列，以使与存在于同一TFP中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。

跨膜结构域可以源自天然来源或重组来源。在来源是天然来源的情况下，所述结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一方面，每当TFP已经结合至靶标时，跨膜结构域就能够向一个或多个胞内结构域发信号。在本发明中特别有用的跨膜结构域可以至少包含例如T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜区。

在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白的铰链)连接到TFP的胞外区(例如TFP的抗原结合结构域)。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链或CD8a铰链。

6.接头

任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短寡肽或多肽可以在TFP的跨膜结构域与胞质区之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。例如，在一方面，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS。在一些实施方案中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC的核苷酸序列编码。

7.胞质结构域

如果TFP含有CD3γ、δ或ε多肽，则TFP的胞质结构域可包含胞内信号传导结构域；TCRα和TCRβ亚基通常缺乏信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责活化已引入TFP的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的专门功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指蛋白质的转导效应子功能信号并指导细胞执行专门功能的部分。虽然通常可以采用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下，不需要使用整条链。在使用胞内信号传导结构域的截短部分的程度下，可以使用此截短部分代替完整的链，只要所述截短部分转导效应子功能信号即可。因此，术语胞内信号传导结构域意在包含胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。

用于本发明的TFP中的胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的配合作用来在抗原受体接合之后启动信号转导的胞质序列以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。

已知，通过TCR单独生成的信号不足以完全活化初始T细胞，并且需要次级信号和/或共刺激信号。因此，可以说初始T细胞活化是由两个不同类别的胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用来提供次级信号或共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域，例如共刺激结构域)。

初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞内信号传导结构域可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。

在本发明中具有特定用途的含有ITAM的初级胞内信号传导结构域的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d的那些结构域。在一个实施方案中，本发明的TFP包含胞内信号传导结构域，例如CD3-ε的初级信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包括修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变(例如，增加或减少)的活性的突变的ITAM结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包括修饰的含有ITAM的初级胞内信号传导结构域，例如优化和/或截短的含有ITAM的初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。

TFP的胞内信号传导结构域可包含CD3ζ信号传导结构域本身，或者其可与可用于本发明的TFP的上下文中的一个或多个任何其他所需胞内信号传导结构域组合。例如，TFP的胞内信号传导结构域可以包含CD3ε链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指TFP的包含共刺激分子的胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原有效应答所需要的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性地结合的配体等。例如，CD27共刺激已被证明在体外增强人TFP-T细胞的扩增、效应子功能和存活，并在体内增强人T细胞的持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.2012；119(3):696-706)。

本发明的TFP的胞质部分内的胞内信号传导序列可以随机或指定顺序彼此连接。任选地，长度为例如2-10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的短寡肽或多肽接头可在胞内信号传导序列之间形成连接。

在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸可以用作合适的接头。

在一方面，本文所述的表达TFP的细胞可以还包含第二TFP，例如包含不同抗原结合结构域的第二TFP，例如针对相同靶标(例如，MUC16或MSLN)或不同靶标(例如，MUC16或MSLN)的第二TFP。在一个实施方案中，当表达TFP的细胞包含两种或更多种不同的TFP时，不同TFP的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域彼此不相互作用。例如，表达第一和第二TFP的细胞可以具有第一TFP的抗原结合结构域，例如作为片段，例如scFv，其不与第二TFP的抗原结合结构域缔合，例如第二TFP的抗原结合结构域是V

在另一方面，本文所述的表达TFP的细胞可以进一步表达另一种剂，例如增强表达TFP的细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，所述剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子(例如PD1)可以降低表达TFP的细胞引起免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包括与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文所述的胞内信号传导结构域)缔合的第一多肽(例如抑制性分子)。在一个实施方案中，所述剂包含第一多肽，例如抑制性分子如PD1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4和TIGIT的第一多肽，或任何这些多肽的片段(例如，任何这些多肽的胞外结构域的至少一部分)，和第二多肽，所述第二多肽是本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，4-1BB、CD27或CD28，例如，如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，所述剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)和本文所述的胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。PD1是CD28受体家族的抑制性成员，所述受体家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Agata等人1996Int.Immunol 8:765-75)。PD1的两种配体PD-L1和PD-L2已显示在与PD1结合后下调T细胞活化(Freeman等人2000JExpMed 192:1027-34；Latchman等人2001Nat Immunol 2:261-8；Carter等人2002Eur JImmunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中含量很高(Dong等人2003J Mol Med 81:281-7；Blank等人2005Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人2004Clin CancerRes10:5094)。免疫抑制可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用来逆转。

在一个实施方案中，所述剂包含抑制性分子的胞外结构域(ECD)，例如程序性死亡1(PD1)可与跨膜结构域和任选地胞内信号传导结构域诸如41BB和CD3ζ融合(本文也称为PD1 TFP)。在一个实施方案中，当与本文所述的抗肿瘤抗原TFP组合使用时，PD1 TFP改善了T细胞的持久性。在一个实施方案中，TFP是包含PD 1的胞外结构域的PD1 TFP。或者，提供了含有特异性结合程序性死亡配体1(PD-L1)或程序性死亡配体2(PD-L2)的抗体或抗体片段诸如scFv的TFP。

在另一方面，本发明提供了表达TFP的T细胞(例如TFP-T细胞)群体。在一些实施方案中，表达TFP的T细胞群体包含表达不同TFP的细胞混合物。例如，在一个实施方案中，TFP-T细胞群体可以包括表达具有本文所述的抗肿瘤相关抗原结合结构域的TFP的第一细胞和表达具有不同的抗肿瘤相关抗原结合结构域(例如与第一细胞表达的TFP中的抗肿瘤相关抗原结合结构域不同的本文所述的抗肿瘤相关抗原结合结构域)的TFP的第二细胞。作为另一个实例，表达TFP的细胞群体可以包括表达包含例如本文所述的抗肿瘤相关抗原结合结构域的TFP的第一细胞和表达包含针对肿瘤相关抗原以外的靶标(例如，另一种肿瘤相关抗原)的抗原结合结构域的TFP的第二细胞。

在另一方面，本发明提供了细胞群体，其中所述群体中的至少一种细胞表达具有本文所述的抗肿瘤相关抗原结构域的TFP和表达另一种剂(例如增强TFP表达细胞活性的剂)的第二细胞。例如，在一个实施方案中，所述剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如可以降低表达TFP的细胞引起免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD 160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包括与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文所述的胞内信号传导结构域)缔合的第一多肽(例如抑制性分子)。

本文公开了用于产生编码TFP的体外转录的RNA的方法。本发明还包括可以直接转染到细胞中的编码TFP的RNA构建体。用于产生用于转染的mRNA的方法可以包括使用专门设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，然后添加聚A，以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和聚A尾的构建体，其长度通常为50-2000个碱基。这样产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一方面，模板包含TFP的序列。

在一方面，抗肿瘤相关抗原TFP由信使RNA(mRNA)编码。在一方面，将编码抗肿瘤相关抗原TFP的mRNA引入T细胞中以产生TFP-T细胞。在一个实施方案中，可以将体外转录的RNA TFP以瞬时转染的形式引入细胞中。所述RNA通过使用聚合酶链反应(PCR)生成的模板在体外转录产生。来自任何来源的感兴趣DNA可通过PCR直接转变为用于使用适当的引物和RNA聚合酶进行体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他适当的DNA来源。体外转录所需的模板是本发明的TFP。在一个实施方案中，用于进行PCR的DNA含有开放阅读框。所述DNA可从来自生物体基因组的天然存在的DNA序列获取。在一个实施方案中，所述核酸可包含5'和/或3'未翻译区域(UTR)中的一些或全部。所述核酸可包含外显子和内含子。在一个实施方案中，用于进行PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施方案中，用于进行PCR的DNA是包含5'和3'UTR的人核酸序列。所述DNA可替代地可以是通常不在天然存在的生物体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因的连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的部分的DNA序列。DNA的连接在一起的部分可来自单种生物体或来自多于一种生物体。

PCR用于生成用于对用于转染的mRNA进行体外转录的模板。用于进行PCR的方法是本领域中熟知的。用于PCR中的引物被设计来具有与待用作进行PCR的模板的DNA的区域大体上互补的区域。如本文所用,“大体上互补”是指引物序列中大部分或所有碱基是互补的或者一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸序列。大体上互补的序列能够在用于进行PCR的退火条件下与预期的DNA靶标进行退火或杂交。所述引物可被设计成与DNA模板的任何部分大体上互补。例如，所述引物可被设计来扩增核酸的在细胞中正常转录的部分(开放阅读框)(包括5'和3'UTR)。所述引物还可被设计来扩增核酸的编码特定感兴趣结构域的部分。在一个实施方案中，所述引物被设计来扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的所有部分或一部分。可用于进行PCR的引物可通过本领域中熟知的合成方法来生成。“正向引物”是含有与DNA模板上的在待扩增的DNA序列上游的核苷酸大体上互补的核苷酸区域的引物。“上游”在本文中用于是指待扩增的DNA序列的相对于编码链的位置5。“反向引物”是含有与在待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板大体上互补的核苷酸区域的引物。“下游”在本文中用于指待扩增的DNA序列的相对于编码链的3'位置。

可用于进行PCR的任何DNA聚合酶可在本文所公开的方法中使用。试剂和聚合酶可从多种来源商购获得。

也可使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选地具有5'和3'UTR。在一个实施方案中，5’UTR的长度是1与3,000个核苷酸之间。待添加到编码区的5’和3’UTR序列的长度可通过不同的方法来改变，所述方法包括但不限于设计用于进行PCR的退火到不同的UTR区域的引物。使用这种方法，本领域的普通技术人员可在转染转录的RNA之后修改实现最佳翻译效率所需的5’和3’UTR长度。

5'和3'UTR可以是感兴趣核酸的天然存在的内源性5'和3'UTR。或者，对于感兴趣核酸不是内源性的UTR序列可通过将UTR序列并入到正向引物和反向引物中或通过对模板进行任何其他修饰来添加。使用对于感兴趣核酸不是内源性的UTR序列可用于修改RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3’UTR序列中的富含AU的元件可降低mRNA的稳定性。因此，基于本领域中熟知的UTR的特性，3’UTR可被选择或设计来增加转录的RNA的稳定性。

在一个实施方案中，5'UTR可含有内源性核酸的Kozak序列。或者，当对于感兴趣核酸不是内源性的5'UTR通过如上所述的PCR进行添加时，共有Kozak序列可通过添加5'UTR序列来重新设计。Kozak序列可增加一些RNA转录物的翻译效率，但是似乎对于实现高效翻译并非为所有RNA均需要。对于许多mRNA而言需要Kozak序列是本领域中已知的。在其他实施方案中，5’UTR可以是RNA病毒的5’UTR，所述病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施方案中，各种核苷酸类似物可用于3'或5'UTR中以阻止mRNA的外切核酸酶降解。

为了实现从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，应将转录的启动子连接到待转录的序列上游的DNA模板。当充当RNA聚合酶的启动子的序列被添加到正向引物的5’端时，RNA聚合酶启动子被并入到待转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个优选的实施方案中，所述启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他可用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域中已知的。

在一个优选的实施方案中，mRNA具有在5'端上的帽和3'聚(A)尾部，其决定核蛋白体结合、翻译的启动和细胞中mRNA的稳定性。例如，在环状DNA模板上，质粒DNA、RNA聚合酶产生不适于在真核细胞中表达的长多联产物。在3’UTR的端部处线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其在真核转染中并不有效的，即使其在转录后被聚腺苷酸化。

在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可使转录物的3'端延长超过模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。

将聚A/T片段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚A/T序列可导致质粒不稳定性，这就是从细菌细胞获得的质粒DNA模板常常高度混杂有缺失和其他畸变的原因。这使得克隆程序不仅是费力且耗时的，而且常常也是不可靠的。这就是允许构建具有聚A/T 3’片段的DNA模板而没有克隆的方法受到高度期望的原因。

转录DNA模板的聚A/T区段可在PCR期间通过使用含有聚T尾部(诸如100T尾部)的反向引物(大小可以是50-5000T)或者在PCR之后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)产生。聚(A)尾部还为RNA提供稳定性并且减少其降解。通常，聚(A)尾部的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，聚(A)尾部是100与5000个腺苷之间。

RNA的聚(A)尾部可使用聚(A)聚合酶(诸如大肠杆菌聚A聚合酶(E-PAP))在体外转录之后进一步延长。在一个实施方案中，将聚(A)尾部的长度从100个腺苷增加至300与400个腺苷之间引起RNA的翻译效率增加两倍。另外，将不同化学基团连接到3’端可增加mRNA稳定性。此连接可含有修饰的/人工的核苷酸、适体和其他化合物。例如，ATP类似物可使用聚(A)聚合酶并入到聚(A)尾部中。ATP类似物可进一步增加RNA的稳定性。

5'帽也为RNA分子提供稳定性。在一个优选的实施方案中，通过本文所公开的方法产生的RNA包含5’帽。使用本领域已知的和本文描述的技术提供5'帽(Cougot等人,Trendsin Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)，Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。

通过本文所公开的方法产生的RNA也可含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒的、染色体的或人工设计的序列，其启动对mRNA的帽独立性核糖体结合并且有利于翻译的启动。可包括适用于细胞电穿孔的任何溶质，所述溶质可含有促进细胞渗透性和活力的因子，诸如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂以及表面活性剂。

RNA可使用多种不同方法中的任一种来引入到靶细胞中，所述不同的方法例如是可商购获得的方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，Cologne，Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，Mass.)或GenePulser II(BioRad，Denver，Colo.)、Multiporator(Eppendort，Hamburg Germany)、使用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染或生物弹颗粒递送系统(诸如“基因枪”)(参见例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。

8.编码TFP的核酸构建体

本发明还提供了编码一种或多种本文所述的TFP构建体的核酸分子。在一方面，核酸分子作为信使RNA转录物提供。在一方面，核酸分子作为DNA构建体提供。

编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如像通过筛选来自表达所述基因的细胞的文库、通过从已知包含所述基因的载体得到所述基因、或通过使用标准技术直接从含有所述基因的细胞和组织分离来获得。或者，感兴趣的基因可合成产生而并非克隆。

本发明还提供插入了本发明的DNA的载体。来源于逆转录病毒(诸如慢病毒)的载体是适用于实现长期基因转移的工具，因为它们允许转基因及其子代长期稳定地整合在子细胞中。慢病毒载体与来源于致癌逆转录病毒(诸如鼠白血病病毒)的载体相比具有额外的优点，因为它们可以转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优点。

在另一个实施方案中，包含编码本发明的所需TFP的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，编码TFP的核酸的表达可以使用转座子来实现，所述转座子例如睡美人、保鲜盒、CAS9和锌指核酸酶(参见June等人2009Nature ReviewsImmunol.9.10:704-716，其以引用的方式并入本文中)。

本发明的载体还可使用标准基因递送方案用于核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域中已知的(参见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，其以引用的方式整体并入本文)。在另一个实施方案中，本发明提供一种基因治疗载体。

所述核酸可以被克隆到许多类型的载体中。例如，所述核酸可被克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

另外，表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的并且描述于例如Sambrook等人,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)和其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来讲，合适的载体含有在至少一种生物体中发挥功能的复制起点、启动子序列、便利的限制核酸内切酶位点以及一个或多个选择标记(例如WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利号6,326,193)。

多种基于病毒的系统已经被开发用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。所选基因可使用本领域中已知的技术插入到载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。重组病毒然后可被分离并且在体内或离体递送到受试者的细胞。多种逆转录病毒系统是本领域中已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。多种腺病毒载体是本领域中已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。

另外的启动子元件(例如，增强子)调节转录引发的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp区域中，但是许多启动子已被证明也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，使得当元件相对于彼此反转或移动时保存启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可增加到相隔50bp。根据启动子，似乎个别元件可协同或独立地起作用来活化转录。

能够在哺乳动物T细胞中表达TFP转基因的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延长因子-1复合物的α亚基的表达，其负责将氨酰基tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已广泛用于哺乳动物表达质粒中，并已显示可有效地驱动从克隆到慢病毒载体中的转基因表达TFP(参见例如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009))。启动子的另一个实例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这种启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即刻早期启动子、劳氏(Rous)肉瘤病毒启动子以及人基因启动子(诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延长因子-1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子)。此外，本发明不应被局限于使用组成型启动子。诱导型启动子也可考虑作为本发明的一部分。使用诱导型启动子提供了一种分子开关，所述分子开关能够在需要这种表达时开启与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时关闭所述表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、黄体酮启动子以及四环素调节的启动子。

为了评估TFP多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有选择标记基因或报告基因或两者，以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，所述选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序中。选择标记和报告基因两者都可以侧接适当的调节序列，以能够在宿主细胞中表达。可用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。

报告基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。一般来讲，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由所述受体生物体或组织表达的基因，它编码通过一些可容易地检测的特性(例如，酶活性)证明其表达的多肽。在DNA已被引入接受体细胞中之后合适的时间，测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei等,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可使用已知的技术来制备或商购获得。通常，具有显示报告基因的最高表达水平的最小5’侧接区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可连接到报告基因，并且用于评价剂调节启动子驱动的转录的能力。

将基因引入到细胞中并表达基因的方法是本领域中已知的。在表达载体的情况下，所述载体可容易地通过本领域的任何方法引入宿主细胞(例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞)中。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域中熟知的(参见例如Sambrook等人,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)。用于将多核苷酸引入宿主细胞中的方法是磷酸钙转染。

用于将感兴趣多核苷酸引入宿主细胞中的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入哺乳动物(例如，人类细胞)中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等(参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，其包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。现有技术的其他靶向递送核酸的方法是可用的，例如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米尺寸递送系统递送多核苷酸。

在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂以将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一方面，所述核酸可与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子连接到脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、以悬浮液形式包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合、或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可存在于双层结构中、以胶束形式存在、或具有“塌陷的”结构。它们也可仅散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质是脂肪物质，它们可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物的化合物类别，诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。

适用于使用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,Mo.获得；磷酸双十六烷基酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview，N.Y.)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham，Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。使用氯仿作为唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其涵盖各种单一和多层的脂质媒介物，所述脂质媒介物通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成。脂质体可被表征为具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前进行自我重排，并且将水和溶解的溶质包埋在脂质双层之间(Ghosh等人，1991Glycobiology 5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅仅以非均一脂质分子聚集体形式存在。还考虑脂质体(lipofectamine)-核酸复合物。

不管使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞中或者以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，为了确认重组DNA序列存在于宿主细胞中，可进行各种测定。此类测定包括例如本领域的技术人员熟知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生化”测定，诸如检测具体多肽存在或不存在，所述测定例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹法)或通过本文所述的识别落在本发明范围内的剂的测定来进行。

本发明还提供了包含编码TFP的核酸分子的载体。在一方面，可以将TFP载体直接转导到细胞(例如T细胞)中。在一方面，载体是克隆或表达载体，例如包括但不限于一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、小圆圈、小载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。在一方面，载体能够在哺乳动物T细胞中表达TFP构建体。在一方面，哺乳动物T细胞是人T细胞。

9.T细胞的来源

在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞的来源。术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些方面，可使用本领域可获得的任意数量的T细胞系。在本发明的某些方面，T细胞可使用技术人员已知的任意数量的技术(诸如Ficoll

在一方面，通过裂解红细胞并且排除单核细胞(例如通过PERCOLL

另外，通过增加或降低珠粒或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可在培养启动时或在其他所需时间点优先地选择或抵制T细胞的亚群。本领域的技术人员将认识到，在本发明的上下文中还可使用多轮选择。在某些方面，可能期望在活化和扩增过程中进行选择程序并且使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可经受另外几轮选择。

通过阴性选择进行的T细胞群体的富集可使用涉及对于阴性选择的细胞所特有的表面标记的抗体的组合来实现。一种方法是通过阴性磁性免疫细胞粘连或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，所述流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些方面，可能期望富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、以及FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些方面，T调节性细胞通过抗CD25缀合的珠粒或其他类似的选择方法来消化。

在一个实施方案中，可以选择表达IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B和穿孔素或其他合适分子(例如其他细胞因子)中的一种或多种的T细胞群体。用于筛选细胞表达的方法可以例如通过PCT公布号WO2013/126712中描述的方法确定。

对于通过阳性或阴性选择分离所需细胞群体，细胞和表面(例如，颗粒，诸如珠粒)的浓度可变化。在某些方面，可能期望显著降低珠粒和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，在一方面，使用20亿个细胞/mL的浓度。在一方面，使用10亿个细胞/mL的浓度。在另一方面，使用大于100百万个细胞/mL。在另一方面，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百万个细胞/mL的细胞浓度。在又一方面，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/mL的细胞浓度。在另外的方面，可使用125或150百万个细胞/mL的浓度。使用高浓度可引起细胞产率、细胞活化和细胞扩增增加。此外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(诸如CD28阴性T细胞)或从存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病血液、肿瘤组织等)更高效地捕获所述细胞。此类细胞群体可具有治疗性价值并且是期望获得的。例如，使用高细胞浓度允许更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+ T细胞。

在一个相关方面，可能期望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面(例如颗粒，诸如珠粒)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择表达大量的待结合到颗粒的所需抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+ T细胞更高效地被捕获。在一方面，所使用的细胞浓度是5x10

用于刺激的T细胞还可在洗涤步骤之后进行冷冻。不希望受到理论的束缚，冷冻和后续解冻步骤通过在细胞群体中去除粒细胞并且在一定程度上去除单核细胞来提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，所述细胞可悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域中已知的并且可用于此上下文中，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人类血清白蛋白的PBS或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人类血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人类血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基、或含有例如

本发明的上下文中还考虑在可能需要如本文所述的扩增细胞之前一段时间从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。由此，可在所需要的任何时间点收集待扩增的细胞的来源，并且分离并冷冻所需细胞(诸如T细胞)以稍后用于针对将从其获益的任何数量的疾病或病状(诸如本文所述的那些)的T细胞治疗。在一方面，血液样品或单采血液成分术从大体上健康的受试者获取。在某些方面，血液样品或单采血液成分术从处于发展疾病的风险下但尚未发展疾病的大体上健康的受试者获取，并且分离并冷冻感兴趣的细胞以用于稍后使用。在某些方面，T细胞可扩增、冷冻并在稍后的时间使用。在某些方面，样品从诊断患有如本文所述的具体疾病后不久但是在进行任何治疗之前的患者收集。在另一个方面，所述细胞从来自进行任意数量的相关治疗形式之前的受试者的血液样品或单采血液成分术分离，所述治疗形式包括但不限于使用剂(诸如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂)、化学疗法、放射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和他克莫司(FK506))、抗体或其他免疫清除剂(诸如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、罗米地辛(以前称为FR901228))以及辐射的治疗。

在本发明的另一方面，在治疗后直接从患者获得T细胞，所述治疗使受试者具有功能性T细胞。在这方面，已观察到在某些癌症治疗(具体地是使用损害免疫系统的治疗)之后，在患者通常从治疗恢复的时间段期间的治疗后不久，所获得的T细胞的质量对于其在离体扩增的能力可以是最佳的或得到提高。同样，在使用本文所述的方法进行的离体操纵之后，这些细胞可处于对于增强移入和体内扩增而言是优选的状态中。因此，在本发明的上下文内考虑在此恢复阶段期间收集血液细胞，包括T细胞、树突细胞或造血细胞系的其他细胞。此外，在某些方面，可使用动员(例如，使用GM-CSF的动员)和调理疗法以在受试者中产生尤其是在治疗之后的限定的窗口期期间有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增的条件。例示性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞、以及免疫系统的其他细胞。

10.T细胞的活化和扩增

T细胞通常可以使用例如在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公布号20060121005中描述的方法来活化和扩增。

通常，本发明的T细胞可通过与刺激CD3/TCR复合物相关信号的剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体连接到其的表面接触来扩增。具体地，T细胞群体可如本文所述来进行刺激，诸如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触或通过与蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)连同钙离子载体接触来进行刺激。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群体可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，接触抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，France)，也可以使用本领域中通常已知的其他方法(Berg等人,TransplantProc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)。

暴露于变化的刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采血液成分术的外周血单核细胞产物的辅助T细胞群体(TH、CD4+)大于细胞毒性或抑制性T细胞群体(TC、CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体进行T细胞离体扩增，产生T细胞群体，所述T细胞群体在第约8-9天前主要由TH细胞组成，而在第约8-9天后，T细胞群体包含越来越多的TC细胞群体。因此，根据治疗的目的，使用主要包含TH细胞的T细胞群体输注受试者可以是有利的。类似地，如果分离出抗原特异性TC细胞亚群，则使此亚群扩增至更大的程度可能是有益的。

此外，除CD4和CD8标记之外，其他表型标记显著地变化，但是大部分在细胞扩增过程中可重复地变化。因此，此可重复性实现针对特定目的定制活化的T细胞产物的能力。

一旦构建了抗肿瘤相关抗原TFP，就可以使用各种测定来评价分子的活性，例如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞的能力、在没有再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。下文进一步详细描述了评价抗肿瘤相关抗原TFP的作用的测定。

原代T细胞中TFP表达的蛋白质印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在(参见例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。简言之，将表达TFP的T细胞(CD4

抗原刺激后，TFP

还可以测量在不存在再刺激的情况下的持续TFP+T细胞扩增(参见例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。简言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激并在第1天用指定的TFP转导后，在培养第8天使用Coulter Multisizer III颗粒计数器测量平均T细胞体积(f1)。

动物模型也可用于测量TFP-T活性。例如，使用人BCMA特异性TFP+ T细胞在免疫缺陷型小鼠中治疗癌症的异种移植模型(参见例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。很简单地说，在癌症建立后，将小鼠随机分为治疗组。将不同数量的工程化T细胞以1:1比率共注射到NOD/SCID/γ-/-荷瘤小鼠中。在T细胞注射后的不同时间评价小鼠脾DNA中每种载体的拷贝数。以每周间隔评估动物的癌症。在注射α肿瘤相关抗原-ζTFP+T细胞或模拟转导的T细胞的小鼠中测量外周血肿瘤相关抗原+癌细胞计数。使用对数秩检验比较各组的存活曲线。此外，还可以分析在NOD/SCID/γ-/-小鼠中注射T细胞后4周的绝对外周血CD4+和CD8+ T细胞计数。向小鼠注射癌细胞，并在3周后注射通过双顺反子慢病毒载体工程化为表达TFP的T细胞，所述载体编码与eGFP连接的TFP。通过在注射前与模拟转导的细胞混合，将T细胞归一化为45-50％输入GFP+ T细胞，并通过流式细胞术证实。以1周间隔评估动物的癌症。使用对数秩检验比较TFP+T细胞组的存活曲线。

可以评价剂量依赖性TFP治疗应答(参见例如Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。例如，在第21天注射TFP T细胞、等量的模拟转导的T细胞或未注射T细胞的小鼠中建立癌症后35-70天获得外周血。将各组的小鼠随机抽血以测定外周血+癌细胞计数，然后在第35和49天处死。在第57和70天对其余动物进行评价。

先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如Milone等人,MolecularTherapy 17(8):1453-1464(2009)。简言之，通过将洗涤的T细胞与表达BCMA或CD32和CD137的细胞(KT32-BBL)混合，获得2:1的最终T细胞:表达BCMA的细胞的比率来在微量滴定板中进行TFP介导的增殖的评估。在使用前，用γ射线照射表达BCMA细胞的细胞。将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加到具有KT32-BBL细胞的培养物中，以作为刺激T细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持长期离体CD8+T细胞扩增。如制造商所述，使用CountBright

细胞毒性可通过标准

成像技术可用于评价荷瘤动物模型中TFP的特异性运输和增殖。此类测定已描述于例如Barrett等人,Human Gene Therapy 22:1575-1586(2011)中。简言之，用癌细胞IV注射NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠，7天后用TFP构建体电穿孔后4小时用T细胞注射。用慢病毒构建体稳定转染T细胞以表达萤火虫荧光素酶，并对小鼠进行生物发光成像。或者，可如下测量癌症异种移植模型中单次注射TFP+ T细胞的治疗功效和特异性：向NSG小鼠注射被转导以稳定表达萤火虫荧光素酶的癌细胞，然后在7天后单次尾静脉注射用BCMA TFP电穿孔的T细胞。在注射后的不同时间点对动物成像。例如，可以在第5天(治疗前2天)和第8天(TFP+PBL后24小时)在代表性小鼠中产生萤火虫荧光素酶阳性癌症的光子密度热图。

其他测定法，包括本文实施例部分所述的那些以及本领域已知的那些也可用于评价本发明的抗BCMA TFP构建体。

11.治疗应用

肿瘤抗原相关疾病或病症

用针对肿瘤细胞上的一个靶标(例如BCMA、CD19、CD20、CD22、CD123、MUC16、MSLN等)的癌症治疗剂治疗的许多患者随时间而变得耐药，因为逃逸机制如交替的信号传导途径和反馈回路被活化。双特异性治疗剂试图通过组合经常作为逃避途径彼此替代的靶标来解决此问题。具有对超过一种肿瘤相关抗原具有特异性的TCR的治疗性T细胞群体是有前途的组合治疗剂。在一些实施方案中，双特异性TFP T细胞与额外抗癌剂一起施用；在一些实施方案中，抗癌剂是抗体或其片段、另一种TFP T细胞、CAR T细胞或小分子。示例性肿瘤相关抗原包括但不限于癌胚抗原(例如在胎儿组织和癌性体细胞中表达的那些)、癌病毒抗原(例如由致瘤性转化病毒编码的那些)、过表达/积累的抗原(例如由正常和肿瘤组织表达的那些，在瘤形成中的表达水平高度升高)、癌-睾丸抗原(例如仅由癌细胞和成年生殖组织(例如睾丸和胎盘)表达的那些)、谱系限制性抗原(例如主要由单一癌症组织型表达的那些)、突变的抗原(例如由于基因突变或转录改变而由癌症表达的那些)、翻译后改变的抗原(例如糖基化中的那些肿瘤相关改变等)以及独特型抗原(例如来自高度多态性基因的那些，其中肿瘤细胞表达特定克隆型，例如由克隆异常导致的B细胞、T细胞淋巴瘤/白血病)。示例性肿瘤相关抗原包括但不限于以下抗原：α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、α甲胎蛋白(AFP)、BCR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDK12、CDKN2A、CLPP、COA-1、CSNK1A1、CD79、CD79B、dek-can融合蛋白、EFTUD2、延长因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FNDC3B、FN1、GAS7、GPNMB、HAUS3、HSDL1、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2d、HLA-A11d、hsp70-2、MART2、MATN、ME1、MUM-1f、MUM-2、MUM-3、neo-PAP、肌球蛋白I类、NFYC、OGT、OS-9、p53、pml-RARα融合蛋白、PPP1R3B、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1或SYT-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、磷酸丙糖异构酶、BAGE-1、D393-CD20n、细胞周期蛋白-A1、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、LY6K、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12 m、MAGE-C1、MAGE-C2、mucink、NA88-A、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b/GAGED2a、基因/蛋白质、CEA、gp100/Pmel17、乳腺珠蛋白-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、PAP、PSA、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、酪氨酸酶、脂肪分化相关蛋白、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BING-4、CALCA、CD45、CD274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH(hMena)、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、HLA-DOB、Hepsin、IDO1、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧基酯酶、α甲胎蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、分离蛋白1、SOX10、STEAP1、存活蛋白、端粒酶、TPBG、VEGF和WT1。

在一方面，本发明提供了用于治疗与至少一种肿瘤相关抗原表达相关的疾病的方法。在一方面，本发明提供了用于治疗疾病的方法，其中肿瘤的一部分对肿瘤相关抗原呈阴性，并且肿瘤的一部分对肿瘤相关抗原呈阳性。例如，本发明的抗体或TFP可用于治疗已接受与所述肿瘤抗原表达升高有关的疾病的治疗的受试者，其中已接受肿瘤相关抗原水平升高的治疗的受试者表现出与肿瘤相关抗原水平升高有关的疾病。

在一方面，本发明涉及一种载体，其包含可操作地连接至启动子以在哺乳动物T细胞中表达的抗肿瘤相关抗原抗体或TFP。在一方面，本发明提供了一种表达肿瘤相关抗原TFP的重组T细胞，其用于治疗表达肿瘤相关抗原的肿瘤，其中表达肿瘤相关抗原TFP的重组T细胞被称为肿瘤相关抗原TFP-T。在一方面，本发明的肿瘤相关抗原TFP-T能够使肿瘤细胞与在其表面上表达的至少一种本发明的肿瘤相关抗原TFP接触，使得TFP-T靶向肿瘤细胞并且抑制肿瘤的生长。

在一个方面，本发明涉及一种抑制表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞生长的方法，其包括使肿瘤细胞与本发明的肿瘤相关抗原抗体或TFP T细胞接触，使得TFP-T响应于抗原而被活化并靶向癌细胞，其中肿瘤的生长被抑制。

在一方面，本发明涉及一种治疗受试者的癌症的方法。所述方法包括向受试者施用本发明的肿瘤相关抗原抗体、双特异性抗体或TFP T细胞，从而在受试者中治疗癌症。可通过本发明的肿瘤相关抗原TFP T细胞治疗的癌症的实例是与肿瘤相关抗原表达有关的癌症。在一方面，癌症是骨髓瘤。在一方面，癌症是淋巴瘤。在一方面，癌症是结肠癌。

在一些实施方案中，肿瘤相关抗原抗体或TFP疗法可与一种或多种额外疗法组合使用。在一些情况下，此类额外疗法包括化学治疗剂，例如环磷酰胺。在一些情况下，此类额外疗法包括手术切除或放射治疗。

在一方面，本文公开了一种细胞疗法的方法，其中T细胞被遗传修饰以表达TFP，并且表达TFP的T细胞被输注给有需要的接受者。输注的细胞能够杀死接受者中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，表达TFP的T细胞能够在体内复制，从而导致可导致持续肿瘤控制的长期持久性。在各个方面，向患者施用的T细胞或其后代在向患者施用T细胞后持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。

在一些情况下，本文公开了一种细胞疗法，其中例如通过体外转录的RNA修饰T细胞以瞬时表达TFP，并将表达TFP的T细胞输注给有需要的接受者。输注的细胞能够杀死接受者中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，向患者施用的T细胞在向患者施用T细胞后存在少于一个月，例如三周、两周或一周。

不希望受任何特定理论的束缚，由表达TFP的T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可能是主动免疫应答或被动免疫应答，或者可能是由于直接免疫应答与间接免疫应答。在一方面，TFP转导的T细胞响应于表达肿瘤相关抗原的人癌细胞而表现出特异性促炎性细胞因子分泌和有效的细胞溶解活性，抵抗可溶性肿瘤相关抗原抑制，介导旁观者杀伤和/或介导已建立的人肿瘤的消退。例如，在表达肿瘤相关抗原的肿瘤的异质区内无抗原肿瘤细胞可能易于被先前与邻近抗原阳性癌细胞反应的肿瘤相关抗原重定向的T细胞间接破坏。

在一方面，本发明的人TFP修饰的T细胞可以是一种类型的用于哺乳动物的离体免疫和/或体内治疗的疫苗。在一方面，哺乳动物是人。

关于离体免疫，在将细胞施用于哺乳动物前，在体外发生以下至少一种：i)使细胞扩增、ii)将编码TFP的核酸引入细胞中或iii)将细胞冷冻保存。

离体程序是本领域熟知的，并且在下文进行更充分的讨论。简言之，从哺乳动物(例如人)分离细胞，并用表达本文公开的TFP的载体遗传修饰(即体外转导或转染)。可以将TFP修饰的细胞施用给哺乳动物接受者以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人类，并且TFP修饰的细胞相对于接受者可以是自体的。或者，相对于接受者，细胞可以是同种异体的、同基因的或异种的。

造血干细胞和祖细胞的离体扩增程序描述于例如美国专利号5,199,942(以引用的方式并入本文)中并可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简言之，T细胞的离体培养和扩增包括：(1)从哺乳动物外周血收获物或骨髓外植体收集CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增这类细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子以外，其他因子例如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体可用于培养和扩增细胞。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供了用于体内免疫以在患者中引发针对抗原的免疫应答的组合物和方法。

通常，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防免疫受损的个体中发生的疾病。特别地，本发明的TFP修饰的T细胞用于治疗与肿瘤相关抗原表达有关的疾病、病症和病状。在某些方面，本发明的细胞用于治疗处于发展与肿瘤相关抗原表达有关的疾病、病症和病状的风险下的患者。因此，本发明提供了用于治疗或预防与肿瘤相关抗原表达有关的疾病、病症和病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的TFP修饰的T细胞。

在一方面，本发明的抗体或TFP-T细胞可以用于治疗增生性疾病例如癌症或恶性肿瘤或癌前病状。在一方面，癌症是骨髓瘤。在一方面，癌症是淋巴瘤。在一方面，癌症是结肠癌。此外，与肿瘤相关抗原表达有关的疾病包括但不限于表达肿瘤相关抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增生性疾病。与肿瘤相关抗原表达有关的非癌症相关适应症根据抗原而变化，但不限于例如感染性疾病、自身免疫性疾病(例如狼疮)、炎性病症(过敏和哮喘)和移植。

本发明的抗体或TFP修饰的T细胞可单独施用，或作为与稀释剂和/或与其他组分(例如IL-2或IL-12或其他细胞因子或细胞群体)组合的药物组合物施用。

本发明还提供了用于抑制表达肿瘤相关抗原的细胞群体增殖或减少表达肿瘤相关抗原的细胞群体的方法，所述方法包括使包含表达肿瘤相关抗原的细胞的细胞群体与结合表达肿瘤相关抗原的细胞的本发明的抗肿瘤相关抗原TFP-T细胞接触。在一个具体方面，本发明提供了用于抑制表达肿瘤相关抗原的癌细胞群体增殖或减少表达肿瘤相关抗原的癌细胞群体的方法，所述方法包括使表达肿瘤相关抗原的癌细胞群体与结合表达肿瘤相关抗原的细胞的本发明的抗肿瘤相关抗原TFP-T细胞接触。在一方面，本发明提供了用于抑制表达肿瘤相关抗原的癌细胞群体增殖或减少表达肿瘤相关抗原的癌细胞群体的方法，所述方法包括使表达肿瘤相关抗原的癌细胞群体与结合表达肿瘤相关抗原的细胞的本发明的抗肿瘤相关抗原抗体或TFP-T细胞接触。在某些方面，相对于阴性对照，本发明的抗肿瘤相关抗原抗体或TFP-T细胞在患有多发性骨髓瘤或与表达肿瘤相关抗原的细胞相关的另一种癌症的受试者或所述疾病的动物模型中使细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一方面，受试者是人。

本发明还提供了用于预防、治疗和/或管理与表达肿瘤相关抗原的细胞有关的疾病(例如表达肿瘤相关抗原的癌症)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用结合表达肿瘤相关抗原的细胞的本发明的抗肿瘤相关抗原抗体或TFP-T细胞。在一方面，受试者是人。与表达肿瘤相关抗原的细胞有关的病症的非限制性实例包括自身免疫性疾病(例如狼疮)、炎性病症(例如过敏和哮喘)和癌症(例如血液癌症或表达肿瘤相关抗原的非典型癌症)。

本发明还提供了用于预防、治疗和/或管理与表达肿瘤相关抗原的细胞有关的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用结合表达肿瘤相关抗原的细胞的本发明的抗肿瘤相关抗原抗体或TFP-T细胞。在一方面，受试者是人。

本发明提供了用于预防与表达肿瘤相关抗原的细胞有关的癌症复发的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用结合表达肿瘤相关抗原的细胞的本发明的抗肿瘤相关抗原抗体或TFP-T细胞。在一方面，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的结合表达肿瘤相关抗原的细胞的本文所述的抗肿瘤相关抗原抗体或TFP-T细胞以及有效量的另一种疗法。

12.组合疗法

本文所述的抗体或表达TFP的细胞可以与其他已知剂和疗法组合使用。如本文所用，“组合”施用意指在受试者罹患病症期间将两种(或更多种)不同的治疗递送于所述受试者，例如在所述受试者被诊断为罹患所述病症之后并在所述病症被治愈或消除或者由于其他原因终止治疗之前递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当第二治疗的递送开始时，第一治疗的递送仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这在本文中有时被称作“同时递送”或“合并递送(concurrent delivery)”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。在每一种情况的一些实施方案中，由于是组合施用，所以治疗更有效。例如，与不存在第一治疗的条件下施用第二治疗所观察到的结果相比，第二治疗更有效，例如使用更少的第二治疗观察到等同的作用，或者第二治疗在更大的程度上减少症状，或者用第一治疗观察到相似的情况。在一些实施方案中，与不存在另一种治疗的条件下递送一种治疗所观察到的结果相比，所述递送使得症状或与病症相关的其他参数减少更多。两种治疗的作用可部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可使得当递送第二治疗时，所递送的第一治疗的作用仍然是可检测的。

在一些实施方案中，“至少一种额外治疗剂”包括表达TFP的细胞。还提供了表达多种TFP的T细胞，所得TFP结合相同或不同的靶抗原或相同靶抗原上的相同或不同的表位。还提供了T细胞群体，其中第一T细胞亚群表达第一TFP并且第二T细胞亚群表达第二TFP。

本文所述的表达TFP的细胞和至少一种额外治疗剂可以同时、在相同或分开的组合物中或依次施用。对于依次施用，可以首先施用本文所述的表达TFP的细胞，并且然后可以施用额外剂，或者可以颠倒施用顺序。

在其他方面，本文所述的表达TFP的细胞可用于与以下组合的治疗方案中：手术、化学疗法、放射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和他克莫司)、抗体或其他免疫消融剂(诸如阿仑单抗、抗CD3抗体或其他抗体疗法)、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、罗米地辛、细胞因子、以及辐射、肽疫苗，例如Izumoto等人2008J Neurosurg 108:963-971中所述的。

在一个实施方案中，可以向受试者施用降低或减轻与施用表达TFP的细胞有关的副作用的剂。与施用表达TFP的细胞有关的副作用包括但不限于细胞因子释放综合征(CRS)和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)，也称为巨噬细胞活化综合征(MAS)。CRS的症状包括高烧、恶心、短暂性低血压、缺氧等。因此，本文所述的方法可包括向受试者施用本文所述的表达TFP的细胞，并进一步施用剂以管理由表达TFP的细胞治疗导致的可溶性因子水平升高。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6中的一种或多种。因此，微为了治疗此副作用而施用的剂可以是中和这些可溶性因子中的一种或多种的剂。此类剂包括但不限于类固醇、TNFα抑制剂和IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的实例是依那西普(以名称

在一个实施方案中，可以向受试者施用增强表达TFP的细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，所述剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子(例如程序性死亡1(PD1))可以降低表达TFP的细胞引起免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。抑制性分子的抑制(例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平下的抑制)可以优化表达TFP的细胞性能。在实施方案中，抑制性核酸(例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)可用于抑制表达TFP的细胞中抑制性分子的表达。在一个实施方案中，抑制剂是shRNA。在一个实施方案中，抑制性分子在表达TFP的细胞内受到抑制。在这些实施方案中，将抑制抑制性分子的表达的dsRNA分子连接至编码TFP的组分(例如所有组分)的核酸。在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以是例如结合抑制性分子的抗体或抗体片段。例如，所述剂可以是结合PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(也称为MDX-010和MDX-101，并且以商品名

在一些实施方案中，增强表达TFP的细胞的活性的剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，并且第二结构域是与阳性信号缔合的多肽，例如包含如本文所述的胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与阳性信号缔合的多肽可包含CD28、CD27、ICOS的共刺激结构域，例如CD28、CD27和/或ICOS的胞内信号传导结构域，和/或初级信号传导结构域，例如本文所述的CD3ζ的初级信号传导结构域。在一个实施方案中，融合蛋白由表达TFP的同一细胞表达。在另一个实施方案中，融合蛋白由细胞表达，例如不表达抗肿瘤相关抗原TFP的T细胞。

13.药物组合物

本发明的药物组合物可以包含如本文所述的表达TFP的细胞(例如多个表达TFP的细胞)与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。此类组合物可包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以适于待治疗(或预防)的疾病的方式来施用。施用的量和频率将由诸如患者的病状、患者疾病的类型和严重程度来确定，但是适当的剂量可通过临床试验来确定。

在一个实施方案中，药物组合物基本上不含污染物，例如没有可检测水平的污染物，所述污染物例如选自由以下组成的组：内毒素、支原体、复制能力慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠粒、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施方案中，细菌是选自由以下组成的组的至少一种细菌：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌A组。

当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明的组合物的精确量可由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移的程度、以及病状的个体差异来确定。一般说来，包含如本文所述的T细胞的药物组合物可以10

在某些方面，可能期望向受试者施用活化的T细胞，随后再次抽血(或进行单采血液成分术)，根据本发明由其活化T细胞，并向患者再输注这些活化和扩增的T细胞。此过程每几周可以执行多次。在某些方面，可以从10cc至400cc的血液抽取中活化T细胞。在某些方面，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取中活化T细胞。

受试者组合物的施用可以任何便利的方式进行，包括通过气雾剂吸入、注射、摄取、输液、植入或移植。本文所述的组合物可经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内向患者施用。在一个方面，本发明的T细胞组合物通过真皮内或皮下注射向患者施用。在一个方面，本发明的T细胞组合物通过i.v.注射来施用。T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。

在特定的示例性方面，受试者可以经历白细胞去除术，其中离体收集、富集或耗尽白细胞以选择和/或分离感兴趣细胞，例如T细胞。这些T细胞分离物可以通过本领域已知的方法扩增并处理，使得可以引入本发明的一种或多种TFP构建体，从而产生本发明的表达TFP的T细胞。有需要的受试者随后可以用高剂量化学疗法进行标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或同时，受试者接受本发明的扩增的TFP T细胞的输注。在另一方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

待向患者施用的以上治疗的剂量将随着所治疗的病状的精确特征和治疗的接受者而变化。人类施用的剂量比例换算可根据本领域接受的实践来进行。例如，对于成年患者，阿仑单抗

在一个实施方案中，例如使用体外转录，将TFP引入T细胞中，并且受试者(例如，人)接受本发明的TFP T细胞的初次施用以及本发明的TFP T细胞的一次或多次后续施用，其中所述一次或多次后续施用在先前施用后少于15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。在一个实施方案中，每周向受试者(例如人)施用多于一次本发明的TFP T细胞，例如每周施用2、3或4次本发明的TFP T细胞。在一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)每周施用多于一次的TFP T细胞(例如，每周2、3或4次施用)(在本文中也称为周期)，随后一周不施用TFP T细胞，并且然后向受试者另外施用一次或多次TFP T细胞(例如，每周施用多于一次TFP T细胞)。在另一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)接受多于一个周期的TFP T细胞，并且每个周期之间的时间少于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用TFP T细胞，每周施用3次。在一个实施方案中，本发明的TFP T细胞施用至少两、三、四、五、六、七、八或更多周。

在一方面，使用慢病毒载体(例如慢病毒)生成肿瘤相关抗原TFP T细胞。以这种方式产生的TFP-T细胞将具有稳定的TFP表达。

在一方面，TFP T细胞在转导后4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天瞬时表达TFP载体。TFP的瞬时表达可以通过RNA TFP载体递送来实现。在一方面，通过电穿孔将TFP RNA转导到T细胞中。

在使用瞬时表达的TFP T细胞(特别是携带鼠scFv的TFP T细胞)治疗的患者中可能出现的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。

不受此理论的束缚，据信这种过敏反应可能是由患者产生体液抗TFP应答(即具有抗IgE同种型的抗TFP抗体)而引起。人们认为，当中断暴露于抗原十至十四天时，患者的抗体产生细胞经历从IgG同种型(不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。

如果患者在瞬时TFP治疗(例如通过RNA转导产生的那些)期间处于产生抗TFP抗体应答的高风险下，则TFP T细胞输注中断不应持续超过十至十四天。

实施例

参考以下实验实施例对本发明进行进一步详述。这些实施例仅出于说明目的而提供且并非旨在进行限制，除非另外指明。因此，本发明不应以任何方式被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖因本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。无需进一步说明，相信本领域普通技术人员可以使用前述的说明和下列说明性实施例，制备和利用本发明的化合物并且实践所要求保护的方法。以下工作实施例特别指出本发明的各种方面，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

以下实施例描述了对癌细胞上的超过一种靶抗原具有特异性的工程化T细胞受体；另外，描述了在同一细胞或细胞组合中产生具有对超过一种抗原具有特异性的TCR的T细胞群体的方法。在一个实施方案中，制备了在单个TCR亚基上具有串联的两个结合结构域(例如，scFv、sdAb等)的TFP构建体。在一个实施方案中，制备在单个TCR中具有两个结合结构域的TFP构建体，在两个TCR亚基(例如两个ε亚基、ε和γ亚基等)中的每一个上具有一个结合结构域。在另一个实施方案中，在单独的慢病毒载体中单独制备TFP构建体，并用两种病毒转导靶T细胞群体。实施例公开了抗MSLN TFP和抗MUC16 TFP的组合，和/或对抗MSLN和MUC16均具有特异性的TFP，和/或混合的T细胞群体，其中T细胞是用抗MSLN TFP转导的T细胞和用抗MUC16 TFP转导的T细胞的混合物。如上文所述，本文公开的抗MSLN和抗MUC16构建体仅是示例性的，并不意味着被解释为限制性的。在本发明的方法中考虑了具有多种抗肿瘤抗原抗体组合的构建体。

抗间皮素TFP构建体通过将通过编码具有序列(G

产生的抗间皮素TFP构建体是p510_抗间皮素_TCRα(抗间皮素-接头-人全长T细胞受体α链)、p510_抗间皮素_TCRαC(抗间皮素接头-人T细胞受体α恒定结构域链)、p510_抗间皮素TCRβ(抗间皮素-接头-人全长T细胞受体β链)、p510抗间皮素TCRβC(抗间皮素-接头-人T细胞受体β恒定结构域链)、p510_抗间皮素_TCRγ(抗间皮素-接头-人全长T细胞受体γ链)、p510_抗间皮素_TCRγC(抗间皮素接头-人T细胞受体γ恒定结构域链)、p510抗间皮素TCRδ(抗间皮素-接头-人全长T细胞受体δ链)、p510_抗间皮素_TCRδC(抗间皮素-接头-人T细胞受体β恒定结构域链)、p510抗间皮素CD3γ(抗间皮素-接头-人CD3γ链)、p510_抗间皮素_CD3δ(抗间皮素-接头-人CD3δ链)和p510_抗间皮素CD3ε(抗间皮素-接头-人CD3ε链)。

在一些实施方案中，抗间皮素CAR构建体p510_抗间皮素_28ζ通过将编码抗间皮素、部分CD28胞外结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域和CD3ζ的合成的DNA克隆到p510载体的XbaI和EcoR1位点中而产生。在其他实施方案中，使用4-1BBζ结构域生成抗间皮素CAR构建体。

抗MUC16 TFP构建体可通过将通过编码具有序列(G4S)n(其中n＝1-4)的接头的DNA序列连接到CD3或TCR DNA片段的抗MUC16结合结构域(例如sdAb、scFv或其片段)DNA片段克隆到例如p510载体((System

抗MUC16 TFP构建体的实例包括p510_抗MUC16_TCRα(抗MUC16-接头-人全长T细胞受体α链)、p510_抗MUC16_TCRαC(抗MUC16-接头-人T细胞受体α恒定结构域链)、p510_抗MUC16_TCRβ(抗MUC16-接头-人全长T细胞受体β链)、p510_抗MUC16_TCRβC(抗MUC16-接头-人T细胞受体β恒定结构域链)、p510抗MUC16 TCRγ(抗MUC16–接头-人全长T细胞受体γ链)、p510_抗MUC16_TCRγC(抗MUC16-接头-人T细胞受体γ恒定结构域链)、p510_抗MUC16_TCRδ(抗MUC16-接头-人全长T细胞受体δ链)、p510_抗MUC16_TCRδC(抗MUC16-接头-人T细胞受体β恒定结构域链)、p510_抗muc16_CD3γ(抗MUC16-接头-人CD3γ链)、p510_抗MUC16_CD3δ(抗MUC16-接头-人CD3δ链)和p510_抗MUC16_CD3ε(抗MUC16-接头-人CD3ε链)。本文使用的抗MUC16可以是人MUC16特异性scFv，例如4H11。

抗MUC16 CAR构建体的实例p510_抗MUC16_28ζ可通过将编码抗MUC16、部分CD28胞外结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域和CD3ζ的合成DNA克隆到p510载体的XbaI和EcoR1位点处来产生。在其他实施方案中，使用4-1BBζ结构域生成抗MUC16CAR构建体。

由TCR结构域和结合结构域产生TFP

MUC16结合结构域(例如，单结构域抗体、scFv或其片段)可以使用接头序列诸如G

TFP表达载体

提供的表达载体包含：启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、实现分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许游离型复制和在原核生物中复制的元件(例如，SV40起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和zeocin标记)。

优选地，将编码TFP的核酸构建体克隆到慢病毒表达载体中，并且基于抗MUC16-TFP转导的T细胞响应于MUC16+靶细胞的效应T细胞应答的数量和质量来验证表达。效应T细胞应答包括但不限于细胞扩增、增殖、倍增、细胞因子产生和靶细胞裂解或细胞裂解活性(即脱粒)。

TFP.MUC16慢病毒转移载体可以用于产生包装到VSV-G假型慢病毒颗粒中的基因组材料。将慢病毒转移载体DNA与VSV-G、gag/pol和rev的三种包装组分以及

在一些实施方案中，通过用多个病毒载体转导T细胞来引入多个TFP。

评价人源化TFP重定向的T细胞的细胞裂解活性、增殖能力和细胞因子分泌

可以使用本领域已知的测定来测定TFP.MUC16 T细胞产生细胞表面表达的TFP以及杀死靶肿瘤细胞、增殖并分泌细胞因子的功能能力。

将人外周血单核细胞(PBMC，例如来自正常单采血供体的血液，其初始T细胞可通过对T细胞、CD4+和CD8+淋巴细胞进行阴性选择而获得)用人白介素-2(IL-2)处理，然后在37℃、5％CO

TCR亚基的来源

人T细胞受体(TCR)复合物的亚基均含有胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。人TCR复合物含有CD3-ε多肽、CD3-γ多肽、CD3-δ多肽、CD3-ζ多肽、TCRα链多肽和TCRβ链多肽。人CD3-ε多肽规范序列是UniProt登录号P07766。人CD3-γ多肽规范序列是UniProt登录号P09693。人CD3-δ多肽规范序列是UniProt登录号P043234。人CD3-ζ多肽规范序列是UniProt登录号P20963。人TCRα链规范序列是UniProt登录号Q6ISU1。人TCRβ链C区规范序列是UniProt登录号P01850，人TCRβ链V区序列是P04435。

由TCR结构域和scFv产生TFP

间皮素scFv使用接头序列诸如G

TFP表达载体

提供的表达载体包含：启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、实现分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许游离型复制和在原核生物中复制的元件(例如，SV40起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和zeocin标记)。

优选地，将编码TFP的核酸构建体克隆到慢病毒表达载体中，并基于抗MSLN TFP T细胞响应于间皮素+靶细胞的效应T细胞应答的数量和质量来验证表达。效应T细胞应答包括但不限于细胞扩增、增殖、倍增、细胞因子产生和靶细胞裂解或细胞裂解活性(即脱粒)。

TFP.间皮素慢病毒转移载体用于产生包装到VSV-G假型慢病毒颗粒中的基因组材料。将慢病毒转移载体DNA与VSV-G、gag/pol和rev的三种包装组分以及

在一些实施方案中，通过用多个病毒载体转导T细胞来引入多个TFP。

评价TFP重定向的T细胞的细胞裂解活性、增殖能力和细胞因子分泌

使用本领域已知的测定来测定抗MSLN TFP T细胞产生细胞表面表达的TFP以及杀死靶肿瘤细胞、增殖并分泌细胞因子的功能能力。

将人外周血单核细胞(PBMC，例如来自正常单采血供体的血液，其初始T细胞可通过对T细胞、CD4+和CD8+淋巴细胞进行阴性选择而获得)用人白介素-2(IL-2)处理，然后在37℃、5％CO

抗体序列的产生

人间皮素多肽规范序列是UniProt登录号Q13421(或Q13421-1)。提供了能够特异性结合人间皮素多肽的抗体多肽及其片段或结构域。可以使用多种技术来生成抗间皮素抗体(参见例如(Nicholson等人，1997)。当在小鼠、骆驼或其他物种中制备的抗间皮素抗体用作起始材料时，进行人源化。例如，在临床情况下需要鼠抗间皮素抗体的人源化，其中小鼠特异性残基可以在接受T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)治疗(即用抗MSLN/抗MUC16 TFP构建体转导的T细胞进行治疗)的受试者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA)应答。通过将来自非人抗间皮素抗体的CDR区移植到适当的人种系受体框架上来实现人源化，任选地包括对CDR和框架区的其他修饰。如本文所提供的，抗体和抗体片段残基编号遵循Kabat(Kabat E.A.等人,1991；Chothia等人,1987)。

scFv的产生

人或人源化抗间皮素IgG用于产生TFP构建体的scFv序列。获得编码人或人源化V

示例性抗间皮素V

在一些实施方案中，使用如SEQ ID NO 52-54(分别为SD1、SD4和SD6)中所示的单结构域(V

人或人源化抗MUC16 IgG可以用于产生TFP构建体的scFv序列。获得编码人或人源化V

可与本文所述的组合物和方法一起使用的抗MUC16结合结构域(包括V

人MUG 16多肽规范序列对应于UniProt登录号Q8WXI7。提供了能够特异性结合人MUC16多肽的抗体多肽及其片段或结构域。可以使用多种技术来生成抗MUC16抗体(参见例如(Nicholson等人，1997)。当鼠抗MUC16抗体用作起始材料时，在临床情况下需要鼠抗MUC16抗体的人源化，其中小鼠特异性残基可以在接受T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)治疗(即用TFP.MUC16构建体转导的T细胞进行治疗)的受试者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA)应答。通过将来自鼠抗MUC16抗体的CDR区移植到适当的人种系受体框架上实现人源化，任选地包括对CDR和/或框架区的其他修饰。如本文所提供的，抗体和抗体片段残基编号遵循Kabat(Kabat E.A.等人,1991；Chothia等人,1987)。

单结构域结合剂

骆驼或其他单结构域抗体也可用于产生抗MUC16 TFP构建体。V

由TCR结构域和scFv产生TFP

MUC16 scFv可以使用接头序列诸如G

TFP表达载体

提供的表达载体包含：启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、实现分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许游离型复制和在原核生物中复制的元件(例如，SV40起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和zeocin标记)。

优选地，将编码TFP的核酸构建体克隆到慢病毒表达载体中，并基于TFP.MUC16转导的T细胞(“MUC16.TFP”或“MUC16.TFP T细胞”或“TFP.MUC16”或“TFP.MUC16 T细胞”)响应于MUC16+靶细胞的效应T细胞应答的数量和质量来验证表达。效应T细胞应答包括但不限于细胞扩增、增殖、倍增、细胞因子产生和靶细胞裂解或细胞裂解活性(即脱粒)。

TFP.MUC16慢病毒转移载体可以用于产生包装到VSV-G假型慢病毒颗粒中的基因组材料。将慢病毒转移载体DNA与VSV-G、gag/pol和rev的三种包装组分以及

在一些实施方案中，通过用多个病毒载体转导T细胞来引入多个TFP。

评价人源化TFP重定向的T细胞的细胞裂解活性、增殖能力和细胞因子分泌

可以使用本领域已知的测定来测定TFP.MUC16 T细胞产生细胞表面表达的TFP以及杀死靶肿瘤细胞、增殖并分泌细胞因子的功能能力。

将人外周血单核细胞(PBMC，例如来自正常单采血供体的血液，其初始T细胞可通过对T细胞、CD4+和CD8+淋巴细胞进行阴性选择而获得)用人白介素-2(IL-2)处理，然后在37℃、5％CO

TCR亚基的来源

人T细胞受体(TCR)复合物的亚基均含有胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。人TCR复合物含有CD3-ε多肽、CD3-γ多肽、CD3-δ多肽、CD3-ζ多肽、TCRα链多肽和TCRβ链多肽。人CD3-ε多肽规范序列是UniProt登录号P07766。人CD3-γ多肽规范序列是UniProt登录号P09693。人CD3-δ多肽规范序列是UniProt登录号P043234。人CD3-ζ多肽规范序列是UniProt登录号P20963。人TCRα链规范序列是UniProt登录号Q6ISU1。人TCRβ链C区规范序列是UniProt登录号P01850，人TCRβ链V区序列是P04435。

由TCR结构域和scFv产生TFP

间皮素scFv使用接头序列诸如G

TFP表达载体

提供的表达载体包含：启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、实现分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许游离型复制和在原核生物中复制的元件(例如，SV40起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和zeocin标记)。

优选地，将编码TFP的核酸构建体克隆到慢病毒表达载体中，并基于抗MSLN TFP T细胞响应于间皮素+靶细胞的效应T细胞应答的数量和质量来验证表达。效应T细胞应答包括但不限于细胞扩增、增殖、倍增、细胞因子产生和靶细胞裂解或细胞裂解活性(即脱粒)。

TFP.间皮素慢病毒转移载体用于产生包装到VSV-G假型慢病毒颗粒中的基因组材料。将慢病毒转移载体DNA与VSV-G、gag/pol和rev的三种包装组分以及

在一些实施方案中，通过用多个病毒载体转导T细胞来引入多个TFP。

评价TFP重定向的T细胞的细胞裂解活性、增殖能力和细胞因子分泌

使用本领域已知的测定来测定抗MSLN TFP T细胞产生细胞表面表达的TFP以及杀死靶肿瘤细胞、增殖并分泌细胞因子的功能能力。

将人外周血单核细胞(PBMC，例如来自正常单采血供体的血液，其初始T细胞可通过对T细胞、CD4+和CD8+淋巴细胞进行阴性选择而获得)用人白介素-2(IL-2)处理，然后在37℃、5％CO

本文提供的TFP多肽能够与内源性TCR亚基多肽功能性结合以形成功能性TCR复合物。此处，慢病毒载体中的多个TFP用于转导T细胞，以创建功能性多重重组TCR复合物。例如，提供了一种T细胞，其含有i)第一TFP，所述第一TFP具有来自例如CD3-ε多肽和间皮素特异性scFv抗体片段的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，和ii)第二TFP，所述第二TFP具有来自CD3-γ多肽和间皮素特异性抗体片段的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。第一TFP和第二TFP能够彼此相互作用并与内源性TCR亚基多肽相互作用，从而形成功能性TCR复合物。

可以在实体瘤中证明这些多重人源化抗MSLN、抗MUC16 TFP T细胞的用途。

慢病毒产生

如下制备编码适当构建体的慢病毒。将5x10

PBMC分离

从全血或血沉棕黄层制备外周血单核细胞(PBMC)。将全血收集在10mL肝素真空采血管中，并立即进行处理或在4℃下储存过夜。在50mL锥形离心管(PBS，pH 7.4，不含Ca

血沉棕黄层购自Research Blood Components(马萨诸塞州波士顿)。通过添加15mL

T细胞活化

在病毒转导之前，用抗人CD28和CD3抗体缀合的磁珠刺激由全血或血沉棕黄层制备的PBMC持续24小时。将新鲜分离的PBMC在不含huIL-2的CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)，具有5％AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(Gemini Bio-products)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中洗涤一次，然后以1x10

在活化前，将抗人CD28和CD3抗体缀合的磁珠(例如，购自Invitrogen，LifeTechnologies)用1mL无菌1xPBS(pH 7.4)洗涤三次，使用磁架从溶液中分离珠粒，然后将其重悬于含有300IU/mL人IL-2的CAR-T培养基中，最终浓度为4x10

T细胞转导/转染和扩增

PBMC活化后，将细胞在37℃、5％CO

在一些情况下，将活化的PBMC用体外转录(IVT)的mRNA电穿孔。在一个实施方案中，在300IU/mL重组人IL-2(R&D Systems)(可以使用其他刺激试剂，诸如来自MilyeniBiotec的

通过细胞染色验证TFP表达

在慢病毒转导或mRNA电穿孔后，使用抗小鼠Fab抗体检测鼠抗间皮素或MUC16，通过流式细胞术证实抗间皮素或MUC16 TFP的表达。将T细胞在3mL染色缓冲液(PBS，4％BSA)中洗涤三次，然后以1x10

用荧光染料羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记对于间皮素或MUC16呈阳性或阴性的靶细胞。将这些靶细胞与未转导的、用对照CAR-T构建体转导的或用TFP转导的效应T细胞混合。在指定的孵育期后，通过流式细胞术测定每种效应细胞/靶细胞培养物的CFSE标记的死的与活的靶细胞和阴性对照靶细胞的百分比。相对于仅含有靶细胞的孔计算每种T细胞阳性靶细胞培养物中靶细胞的存活百分比。

通过在共孵育效应细胞和靶细胞之后使用流式细胞术比较没有或具有效应T细胞的靶细胞中存活的靶细胞的数目来测量效应T细胞的细胞毒性活性。在间皮素MUC16 TFP或CAR-T细胞实验中，靶细胞是间皮素或MUC16阳性细胞，而用作阴性对照的细胞是间皮素或MUC16阴性细胞。

将靶细胞洗涤一次并以1x10

将连同用TFP构建体转导的效应T细胞作为阴性对照的非转导T细胞洗涤，并以2x10

通过将具有效应T细胞和靶细胞的样品中的活靶细胞(CFSE+7-AAD-)数目除以仅具有靶细胞的样品中的活(CFSE+7-AAD-)细胞数目来计算靶细胞的存活百分比。将效应细胞的细胞毒性计算为靶细胞的杀死百分比＝100％-细胞的存活百分比。

当与未转导的或用非间皮素或MUC16特异性CAR对照转导的T细胞相比时，用抗MSLN.MUC16 28ζCAR构建体或抗MSLN抗MUC16 BBζCAR构建体转导的T细胞可显示出针对表达间皮素或MUC16的细胞的细胞毒性。但是，与抗间皮素CAR对照相比，用抗间皮素-CD3ε和抗MUC16-CD3ε转导的T细胞可诱导更有效的针对靶标的细胞毒性。抗间皮素-CD3γ和抗MUC16-CD3γTFP也可以介导强细胞毒性，其大于在5至10:1的效应物靶标比率下用抗间皮素和抗MUC16-CAR观察到的细胞毒性。使用具有替代性铰链区的TFP可以获得类似的结果。再次，抗间皮素-CD3ε和抗MUC16-CD3ε或抗间皮素-CD3γ和抗MUC16-CD3γTF转导的T细胞对表达间皮素或MUC16的靶细胞的细胞毒性可能大于抗间皮素和抗MUC16-CAR转导的T细胞。

用编码对间皮素和MUC16具有特异性的TFP的mRNA电穿孔的T细胞也可以证明对表达间皮素的细胞的强细胞毒性。虽然对照或抗间皮素和抗MUC16 TFP构建体均未观察到对间皮素阴性细胞的显著杀伤，但用抗间皮素和抗MUC16-CD3ε或抗间皮素和抗MUC16-CD3γTFP转导的T细胞可观察到对表达间皮素或MUC16的细胞的间皮素或MUC16特异性杀伤。

TFP还可在实时细胞毒性测定(RTCA)格式中显示出优于CAR的细胞毒性。RTCA测定法实时测量专用96孔板的每个孔中的粘附性靶细胞单层的电阻抗，并将最终读数表示为称为细胞指数的值。细胞指数的变化表明由于共孵育的T细胞效应物杀死靶细胞而破坏靶细胞单层。因此，可将效应T细胞的细胞毒性评价为与仅含有靶细胞的孔相比含有靶细胞和效应T细胞的孔的细胞指数的变化。

在DMEM、10％FBS、1％抗生素-抗真菌剂(Life Technologies)中培养粘附性靶细胞。为了制备RTCA，将50μL例如DMEM培养基添加到E-板的适当孔中(ACEA

第二天，将效应T细胞洗涤并重悬于细胞毒性培养基(无酚红RPMI1640

在RTCA测定中，通过用抗间皮素-28ζ和抗MUC16-28ζCAR-转导的T细胞或抗间皮素-BBζ和抗MUC16-BBζCAR-转导的构建体转导的T细胞可观察到对TFP-转导的细胞的杀伤，如通过相对于单独的细胞或与用对照CAR构建体转导的T细胞共孵育的细胞，在添加效应细胞后细胞指数的时间依赖性降低所证明的。然而，由表达TFP的T细胞所进行的靶细胞杀伤可能比使用CAR所观察到的杀伤更深和更快。例如，在添加用TFP转导的T细胞4小时内，对表达间皮素或MUC16的靶细胞的杀伤可能基本上完全。用许多包含其他CD3和TCR构建体的TFP构建体转导的T细胞可观察到很少杀伤或没有杀伤。使用具有替代性铰链区的TFP可以获得类似的结果。TFP转导的T细胞对间皮素转导的靶细胞的细胞毒性大于CAR转导的T细胞。

相对于用于转导的病毒量(MOI)，TFP转导的T细胞的细胞毒性活性可以是剂量依赖性的。随着TFP慢病毒MOI的增加，可以观察到间皮素阳性细胞杀伤的增加，进一步加强了TFP转导与细胞毒性活性之间的关系。

基于荧光素酶的细胞毒性测定通过间接测量共培养后残留的活靶细胞中的荧光素酶酶活性来评估TFP T细胞的细胞毒性。

将人肿瘤细胞系K562用作共培养的靶细胞系。不表达靶标(“DN”)、表达MSLN(“MSLN+”)、MUC16(“MUC16+”)或MSLN和MUC16(“DP”)的K562细胞通过用编码人MSLN、人MUC16胞外结构域的慢病毒转导或依次用两种病毒转导而产生。通过应用与慢病毒编码的抗性基因匹配的抗生素来选择稳定表达所需靶抗原的靶细胞。通过用编码萤火虫荧光素酶的慢病毒转导进一步修饰靶细胞以过表达萤火虫荧光素酶，然后进行抗生素选择以产生稳定的细胞系。

在典型的细胞毒性测定中，将靶细胞以每孔5000个细胞铺板在96孔板中。将TFP T或对照细胞以一定范围的效应物与靶标比率添加到靶细胞中。然后将细胞混合物在37℃和5％CO

使用MSLN+或MUC16+和MSLN-或MUC16-细胞来进行表达CAR和TFP构建体的T细胞的活化。如上文所述，连续两天用50个MOILV转导活化的PBMC并扩增。转导后第8天，在细胞毒性培养基(无酚红RPMI1640

在未转导的T细胞或用阳性对照结合剂转导的T细胞中使用MSLN-或MUC16-细胞和MSLN+或MUC16+细胞进行类似实验。

T细胞的活化可类似地通过分析颗粒酶B产生来评估。如上文所述培养并扩增T细胞，并根据制造商的试剂盒说明书(Gemini Bio-products；100-318)对颗粒酶B进行胞内染色。收集细胞，用PBS洗涤三次并用人Fc阻断物阻断10分钟。在4℃下，用抗CD3 APC(克隆，UCHT1)和抗CD8 APCcy7(克隆SK1)对细胞进行表面抗原染色30分钟。然后将细胞用固定/透化溶液(BD

与识别带有同源抗原的细胞有关的效应T细胞活化和增殖的另一量度是效应细胞因子诸如白介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的产生。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。

使用

相对于未转导的或对照CAR转导的T细胞，当与内源性表达间皮素或MUC16的细胞或间皮素或MUC16转导的细胞共培养时，用TFP转导的T细胞可产生更高水平的IL-2和IFN-γ。相反，与间皮素或MUC16阴性细胞或未转导细胞共培养可导致从TFP转导的T细胞释放很少细胞因子或不释放细胞因子。与先前的细胞毒性数据一致，用替代性铰链区构建的TFP在与携带间皮素或MUC16的靶细胞共培养时可产生类似结果。

材料和方法

使用人MUC16肽转化、再克隆和表达V

在pMECS GG载体中克隆的纳米抗体基因在N末端含有PelB信号序列并且在C末端含有HA标签和His

在pMECS GG载体中，His

为了表达并纯化在pMECS GG载体中克隆的纳米抗体，制备含有感兴趣纳米抗体基因的pMECS GG载体并将其用于用此质粒转化非抑制型菌株(例如WK6)。使用MP057引物(5’-TTATGCTTCCGGCTCGTATG-3’(SEQ ID NO:99))对所得克隆的纳米抗体进行测序以验证克隆的身份。通过ELISA或任何其他合适的测定法重复测试抗原结合能力。含有具有纳米抗体基因的重组pMECS GG载体的非抑制型菌株(例如WK6)可用于表达并纯化纳米抗体。

将纳米抗体基因从pMECS GG再克隆至pHEN6c载体

引物序列：

-引物A6E(5’GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR GGA GG 3’)(SEQ ID NO:94)。

-引物PMCF(5'CTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T 3')(SEQ IDNO:95)。

-通用反向引物(5’TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C 3’)(SEQ ID NO:96)。

-通用正向引物(5CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3’)(SEQ ID NO:97)。

通过使用含有携带纳米抗体基因的重组pMECS GG作为模板以及引物A6E和PMCF的大肠杆菌进行PCR来扩增纳米抗体基因(约30个PCR循环，每个循环由在94℃下30秒、在55℃下30秒和在72℃下45秒、随后在PCR结束时在72℃下延伸10分钟组成)。扩增约400bp的片段。然后纯化PCR产物(例如，通过来自

纯化PCR产物并用BstEII消化过夜(或用来自Fermentas Life

纳米抗体的表达和纯化：

使用新鲜转化的WK6菌落接种10-20ml LB+氨苄青霉素(100μg/mL)+葡萄糖(1％)并在37℃下在200-250rpm振荡下孵育过夜。将1ml此预培养物添加到补充有100μg/mL氨苄青霉素、2mM MgCl

将培养物以8000rpm离心8分钟，并且将1升培养物中的沉淀重悬于12ml TES

通过IMAC进行纯化

用PBS平衡His-Select：每个来源于1升培养物的周质提取物，向50ml falcon管中添加1ml树脂(约2ml His-select溶液)，添加PBS至50ml最终体积并混合，并且然后以2000rpm离心2分钟，并弃去上清液。用PBS洗涤树脂两次，并且然后添加周质提取物并在室温下在轻微振摇下孵育30分钟至1小时(更长的孵育时间可导致非特异性结合)。

将样品加载到在底部具有过滤器的PD-10柱上(GE healthcare，目录号17-0435-01)，并用50至100ml PBS(每1ml树脂使用50-100ml PBS)洗涤。进行3次洗脱，每次使用1mlPBS/0.5M咪唑/1ml树脂，并且将合并的洗脱液在4℃下用PBS透析过夜(截止值3500道尔顿)以去除咪唑。

此时可通过对洗脱样品进行OD

免疫接种

在第0、7、14、21、28和35天用与KLH缀合的人MUC16肽(hMUC16)(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP-C-KLH)(SEQ ID NO:93)和/或在C-末端生物素化的人MUC16肽(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP-C-生物素)和/或在N-末端生物素化的人MUC16肽(生物素-NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP)皮下注射美洲驼。在注射前将生物素化的肽与中性抗生物素蛋白混合。使用的佐剂是GERBU佐剂P(GERBU Biotechnik GmbH)。在第40天，从美洲驼收集约100ml抗凝血液以用于淋巴细胞制备。

VHH文库的构建

从美洲驼淋巴细胞构建VHH文库以筛选抗原特异性纳米抗体的存在。为此，将来自外周血淋巴细胞的总RNA用作用寡(dT)引物合成第一链cDNA的模板。使用此cDNA，通过PCR扩增VHH编码序列，用SAPI消化，并将其克隆到噬菌粒载体pMECS-GG的SAPI位点。由此获得的VHH文库称为核心93GG。文库由约10

人MUC16肽特异性纳米抗体的分离

将核心93GG文库在C-末端或N-末端生物素化的hMUC16肽NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(SEQ ID NO:92)(bio-hMUC16)上淘选4轮。使bio-hMUC16肽与链霉亲和素包被的板相互作用，然后将来自文库的噬菌体添加到板中。在每轮淘选后，通过比较从抗原包被的孔洗脱的噬菌粒颗粒的数目与从阴性对照孔(用链霉亲和素包被并封闭但不含肽)洗脱的噬菌粒颗粒的数目来评估抗原特异性噬菌体的富集。这些实验表明噬菌体群体在第2轮后富集约2倍抗原特异性噬菌体。在第1、3和4轮后没有观察到富集。总共随机选择380个菌落(第3轮的190个、第4轮的190个)，并通过ELISA分析其周质提取物中抗原特异性纳米抗体的存在(使用包含可溶性纳米抗体的粗周质提取物进行ELISA)。用于ELISA筛选的肽与用于淘选的肽相同，使用没有肽的封闭的链霉亲和素包被的孔作为阴性对照。在这380个菌落中，34个菌落在此测定中评分为阳性。根据阳性菌落的序列数据，区分6种不同的全长纳米抗体，其属于2个不同的CDR3组(B细胞谱系)(参见Excel文件)。属于相同CDR3组(相同B细胞谱系)的纳米抗体非常相似，并且它们的氨基酸序列表明它们来自由体细胞超突变导致的克隆相关的B细胞或来自相同的B细胞，但在文库构建期间由于RT和/或PCR错误而多样化。属于相同CDR3组的纳米抗体识别相同的表位，但它们的其他特征(例如，亲和力、效力、稳定性、表达产率等)可以不同。来自这些淘选的克隆在其名称中具有以下代码：MU。

hMUC16肽特异性纳米抗体的流式细胞术分析

纳米抗体和细胞

每种抗hMUC16-肽Nb的周质提取物以与上文所述的初始ELISA筛选相同的方式产生。将来自各细胞系(SKOV3 Mucl6 Luc，OVCAR3Mucl6 Luc，Expi-293和Jurkat)的细胞解冻、洗涤并计数。将来自每个Nb克隆的周质提取物与约2x10

首先使用流式细胞术评价在Jurkat人T细胞系中MSLN和MUC16双特异性TFP的表达。将编码MSLN-特异性TFP、MUC16-特异性TFP或双特异性TFP(在单个慢病毒载体中通过T2A序列连接的MSLN TFP和MUC16 TFP)的慢病毒制剂用于转导Jurkat细胞。

在慢病毒转导后四十八小时，收获转导的Jurkat细胞和未转导的(NT)对照细胞并分析MSLN-和MUC16-特异性TFP的表面表达。通过Fc MSLN即具有Fc标签的人间皮素/MSLN(296-580)蛋白(AcroBiosystems，目录号：MSN-H526x)检测MSLN特异性TFP。用Zenon

通过αMUC16-生物素肽(UniProtKB：Q8WX17，aa14319-14438，在New EnglandPeptide合成)检测MUC16特异性TFP，随后用链霉亲和素-PE(BD Bioscience，目录号：554061)检测MUC16特异性TFP。每个样品使用40皮摩尔的MUC16肽。将所有Jurkat细胞(NT、MSLN TFP、MUC16 TFP、双特异性TFP)首先用标记的Fc_MSLN和MUC16-生物素同时染色，然后用链霉亲和素-PE染色。

在用编码MSLN TFP的慢病毒转导的Jurkat细胞上检测到MSLN特异性TFP而非MUC16 TFP的表达(图3B)。此外，在用编码MUC16 TFP的慢病毒转导的Jurkat细胞上检测到MUC16 TFP，而非MSLN TFP(图3C)。对于用编码双特异性TFP的慢病毒转导的Jurkat细胞，在相同转导的Jurkat细胞群体的表面上检测到MSLN TFP和MUC16 TFP(图3D)。对于NT Jurkat细胞没有观察到MSLN TFP或MUC16 TFP的检测(图3A)。

在Jurkat细胞与不表达靶标(“DN”)、表达MSLN(“MSLN+”)、MUC16(“MUC16+”)或MSLN和MUC16(“DP”)的各种基于K562的靶细胞共培养后24小时收获的上清液中测量单特异性TFP Jurkat细胞和双特异性TFP Jurkat细胞的靶标特异性细胞因子产生。使用MesoScale Discovery Technology(MesoScale Diagnostic，LLC)，使用U-PLEX生物标记组I(hu)测定(目录号：K15067L-4)分析上清液中人IL-2的水平。

NT Jurkat细胞在与任何靶标肿瘤细胞共培养时不产生任何可检测的IL-2，无论是否有靶标表达(图4)。单特异性TFP Jurkat细胞仅在与表达匹配靶标的靶细胞共培养时产生IL-2(即，与表达或过表达MSLN的K562细胞共培养的MSLN TFP Jurkat细胞和与表达或过表达MUC16的K562细胞共培养的MUC16 TFP Jurkat细胞)。MSLN TFP Jurkat细胞在与MSLN+靶细胞或DP靶细胞共培养时产生IL-2，但与DN或MUC16+靶细胞共培养时不产生IL-2。MUC16 TFP Jurkat细胞在与MUC16+靶细胞或DP靶细胞共培养时产生IL-2，但与DN或MSLN+靶细胞共培养时不产生IL-2。双特异性TFP Jurkat细胞响应于表达任一靶标仅MSLN(MSLN+)、仅MUC16(MUC16+)或两种靶标(DP)的靶细胞而产生IL-2，这表明比两种单特异性TFPJurkat细胞更广泛的反应性(图4)。与不表达靶标(DN)的靶细胞共培养时不产生IL-2证实了双特异性TFP的特异性。

通过用编码单特异性TFP或双特异性TFP的慢病毒转导从健康供体人原代T细胞产生NT、MSLN TFP、MUC16 TFP和双特异性TFP T细胞。从健康供体PBMC中纯化T细胞，并在第0天通过MACS GMP T Cell

在第10天，如上文所述，收集T细胞并通过流式细胞术用Fc MSLN和MUC16-生物素肽染色，以测定单双特异性TFP或双特异性TFP的表面表达。除了配体以外，还使用

与使用Jurkat细胞的测定所看到的结果相似，对于MSLN TFP T细胞，检测到MSLN特异性TFP(图5C)而非MUC16 TFP(图5D)的表达；此外，对于MUC16 TFP T细胞，检测到MUC16TFP(图5F)而非MSLN TFP(图5E)。对于双特异性TFP T细胞，在转导细胞的表面上检测到MSLN TFP和MUC16 TFP(图5G和5H)。对于NT T细胞没有检测到MSLN TFP或MUC16 TFP(图5A和5B)。

使用根据实施例14制备的原代人T细胞，使用体外细胞毒性测定评价单特异性和双特异性TFP T细胞对靶特异性肿瘤细胞的杀伤。将不表达靶标(“DN”)、表达MSLN(“MSLN+”)、MUC16(“MUC16+”)或MSLN和MUC16(“DP”)的肿瘤细胞系稳定转导以表达作为报告基因的萤火虫荧光素酶。与NT或TFP T细胞共培养十四八小时后，用Bright-Glo

如所预期的，NT T细胞没有显示出针对任何靶细胞的可检测的杀伤(图6)。单特异性TFP T细胞仅杀伤表达匹配靶标的靶细胞。MSLN TFP T细胞显著杀伤MSLN+靶细胞或DP靶细胞，但不杀伤DN或MUC16+靶细胞。MUC16 TFP T细胞完全杀伤MUC16+靶细胞或DP靶细胞，但不杀伤DN或MSLN+靶细胞。双特异性TFP T细胞显著杀伤表达任一靶标仅MSLN(MSLN+)、仅MUC16(MUC16+)或两种靶标(DP)的靶细胞，这证明比两种单特异性TFP T细胞更广泛范围的反应性(图6)。不存在对不表达靶标(DN)的靶细胞的杀伤证实了双特异性TFP T细胞的特异性。

通过前述实施例中描述的方法制备并转导原代人T细胞。使用

当与表达匹配靶标的肿瘤细胞共培养时，所有TFP T细胞均产生大量的IFN-γ(图7A)。与针对表达不匹配靶标的肿瘤细胞的杀伤的缺乏及其特异性相一致，对于与MUC16+靶细胞培养的MSLN TFP T细胞或对于与MSLN+靶细胞培养的MUC16 TFP T细胞没有观察到细胞因子产生。相反，观察到双特异性TFP T细胞具有比单特异性TFP T细胞更广泛的反应性，在与MSLN+、MUC16+或DP靶细胞共培养后观察到显著的IFN-γ产生(图7A)。

对于单特异性TFP T细胞和双特异性TFP T细胞观察到GM-CSF(图7B)和TNF-α(图7C)的显著产生，针对肿瘤细胞具有类似反应性模式。当与靶标匹配的肿瘤细胞共培养时，MSLN TFP和MUC16 TFP T细胞仅产生细胞因子，而与靶标不匹配的细胞共培养时不产生细胞因子。双特异性TFP T细胞对表达任一种或两种靶标的靶细胞有应答。

将招募患有不可切除卵巢癌伴复发性或难治性疾病的患者以进行表达MSLN-MUC16-TFP的T细胞的临床研究。初步研究将研究表达MSLN-MUC16-TFP的T细胞的安全性，并将研究细胞动力学和药效动力学结果。这些结果将告知对用于进一步研究的剂量的选择，然后将其施用于患有不可切除卵巢癌的较大患者队列以定义表达MSLN-MUC16-TFP的T细胞的功效特征。

用于T细胞活化的另一种测定是CD107a的表面表达，CD107a是一种位于静息细胞的细胞质细胞溶解颗粒的膜中的溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1)。效应T细胞的脱粒(细胞溶解活性的先决条件)导致活化诱导的颗粒胞吐后CD107a动员到细胞表面。因此，除细胞因子产生以外，CD107a暴露提供了与细胞毒性密切相关的T细胞活化的额外量度。

分别洗涤靶细胞和效应细胞并将其重悬于细胞毒性培养基(RPMI+5％人AB血清+1％抗生素抗真菌剂)中。在0.5μL/孔的PE/Cy7标记的抗人CD107a(LAMP-1)抗体(克隆-H4A3，

通过流式细胞术检测CD107a在T细胞表面上的暴露。使用

与先前的细胞毒性和细胞因子数据一致，表达肿瘤相关抗原的靶细胞与用抗肿瘤相关抗原-28ζCAR转导的效应T细胞的共培养可诱导表面CD107a表达相对于与肿瘤相关抗原阴性靶细胞孵育的效应物的增加。相比之下，在相同条件下，表达抗肿瘤相关抗原-CD3εLL或抗肿瘤相关抗原-CD3γLL TFP的效应物可表现出5至7倍的CD107a表达诱导。用替代性铰链区构建的抗肿瘤相关抗原TFP在与携带肿瘤相关抗原的靶细胞共培养时可产生类似的结果。

为了评估用抗肿瘤相关抗原TFP转导的效应T细胞在体内实现抗肿瘤应答的能力，将用抗肿瘤相关抗原-28ζCAR、抗肿瘤相关抗原-CD3εTFP或抗肿瘤相关抗原-CD3γTFP转导的效应T细胞过继转移到先前用肿瘤相关抗原+人癌细胞系接种的NOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG-JAX)小鼠中。

在研究开始前至少6周龄的雌性NOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG-JAX)小鼠获自杰克逊实验室(库存号005557)，并使其适应3天再进行实验用途。将用于接种的表达人肿瘤相关抗原的细胞系维持在对数期培养中，然后收获并用台盼蓝计数以确定活细胞计数。在肿瘤攻击当天，将细胞以300g离心5分钟并以0.5-1x10

相对于未转导的T细胞，用抗肿瘤相关抗原-28ζCAR、抗肿瘤相关抗原-CD3εTFP或抗肿瘤相关抗原-CD3γTFP转导的T细胞的过继转移可以延长表达间皮素的细胞系荷瘤小鼠的存活，并且可以表明抗肿瘤相关抗原CAR和TFP转导的T细胞都能够介导靶细胞杀伤，在这些小鼠模型中具有相应增加的存活。总之，这些数据可以表明TFP代表了用于使嵌合受体工程化的替代性平台，所述嵌合受体在体外和体内均表现出优于第一代CAR的抗原特异性杀伤。

表2-示例性序列

尾注

尽管本文已示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说将明显的是，此类实施方案仅作为实例提供。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换而不偏离本发明。应当理解的是，可以在实践本发明时采用在本文中描述的本发明的实施方案的各种替代方案。所意图的是，以下权利要求限定本发明的范围以及由此涵盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。