一种促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化为神经干细胞的中药单体纳米制剂及其应用

摘要

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体的中药单体纳米制剂及其在体外促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化为神经干细胞的用途。一种促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成为NSCs的中药单体纳米制剂，所述制剂为转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体，所述中药单体纳米制剂在制备用于治疗中枢神经系统退行性疾病药物中的应用。本发明首次发现转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体可以显著促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成为神经干细胞，转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体可以增强去分化的神经干细胞的增殖能力，可以促进去分化的神经干细胞向神经元分化，为临床治疗中枢神经系统退行性疾病提供新的治疗药物。

说明书

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，涉及星形胶质细胞体外去分化诱导，具体涉及一种转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体的中药单体纳米制剂及其在体外促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化为神经干细胞的用途。

技术背景

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种慢性的中枢神经系统退行性疾病，以特定神经元进行性丧失为病理特征，并且神经元丢失是AD等神经退行性疾病的主要致病因素与最终结果。近些年随着对神经再生研究的不断深入，促进中枢神经再生治疗AD已成为极具潜力的手段。目前神经再生治疗策略主要分为两类，一是将体外扩增的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植到受损的中枢神经系统部位，替代原有细胞；二是激活原位NSCs，促进内源性神经再生。目前移植外源性NSCs所面临的主要困难包括：外源性NSCs取材困难、来源不足，移植后NSCs存活率低、定向分化困难、有成瘤风险等，降低了临床应用的可能性；而内源性NSCs数量有限、增殖、定向分化及迁移能力不足，很难在病灶区域分化为功能性神经元。因此寻找并建立能促进病灶区域神经再生、补充替代丢失的神经元，恢复神经元突触功能的新方法对治疗AD等中枢神经系统退行性疾病具有重要意义。

星形胶质细胞(Astrocytes,As)是神经胶质细胞的主要亚型之一，在神经系统微环境稳态维持、神经信号传导、突触结构形成和神经环路可塑性等过程中发挥了重要的作用。有研究表明，As在多种神经系统疾病模型中被激活，成为反应性As(Reactiveastrocytes，RAs)，重获某些干细胞特性，能够在某些转录因子和/或信号通路刺激下逆分化为神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)，并且这些As来源的NSCs具有分化为神经元和神经胶质细胞的能力，提示As有潜力成为补充替代丢失神经元，恢复神经再生能力的候选细胞。然而，在AD小鼠模型中发现，Aβ异常沉积引发小胶质细胞活化，释放大量炎性细胞因子致使RAs形态、功能和基因表达都发生了改变，导致其逆分化能力下降，神经毒性增加，导致海马损伤加重。因此，针对AD病变对As功能的影响，采用药物抑制AD脑内病理反应改善微环境、恢复并增强As的神经再生能力具有重要意义。

蛇床子素(Osthole,Ost)是从伞形科植物独活中提取分离出来的香豆素类脂溶性化合物，可促进NSCs向神经元分化，促进AD小鼠神经再生，具有较好的抗AD作用；但是Ost水溶性及稳定性差、生物利用度低等缺点，制约了其疗效的发挥。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成为NSCs的中药单体纳米制剂，该制剂为转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体。本发明利用转铁蛋白(Transferrin,Tf)修饰的脂质体载药系统可改善Ost水溶性及稳定性差和生物利用度低的问题，能够诱导促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化为NSC，促进神经再生治疗AD等中枢神经系统退行性疾病，具有较强的临床应用价值。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成为NSCs的中药单体纳米制剂，所述制剂为转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体。

进一步地，所述中药单体纳米制剂在制备用于治疗中枢神经系统退行性疾病药物中的应用。

进一步，所述的中枢神经系统退行性疾病包括AD、帕金森等。

一种促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的方法，该方法包括使用转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体孵育Aβ损伤的星形胶质细胞。

进一步地，所述促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的方法在制备神经干细胞中的应用。

一种中药单体纳米制剂在制备体外促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成为神经干细胞中的的应用。

进一步地，所述的中药单体纳米制剂为转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体。

与现有技术比，本发明的有益效果如下。

本发明首次发现转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体可以显著促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成为神经干细胞。实验证明，与模型组相比，转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体可以显著促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成为神经干细胞。

本发明提供的转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体可以增强去分化的神经干细胞的增殖能力，实验证明，与模型组相比，转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体可以显著促进去分化的神经干细胞增殖。

本发明提供的转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体可以促进去分化的神经干细胞向神经元分化，实验证明与模型组相比，转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体可以显著促进去分化的神经干细胞向神经元分化。

附图说明

图1是小鼠海马区星形胶质细胞形态学观察及免疫荧光染色鉴定代表性图；其中A为小鼠海马区星形胶质细胞形态学观察及GFAP免疫荧光染色的代表性图，B为DCX、NeuN、OLIG2及Iba-1免疫荧光染色的代表性图，标尺＝50μm。

图2是星形胶质细胞来源的NSCs鉴定的代表性图；其中A为星形胶质细胞逆分化过程光镜图，B为星形胶质细胞逆分化来源的神经球鉴定代表性图，C为星形胶质细胞逆分化来源的NSCs多向分化能力检测的代表性图，标尺＝50μm。

图3-1至图3-2是转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体对星形胶质细胞逆分化为NSCs的影响。标尺＝50μm，与Control组相比，

图4是转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体对星形胶质细胞去分化而来的神经干细胞增殖能力的影响。标尺＝50μm；与Control组相比，

图5是为转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体对星形胶质细胞去分化而来的神经干细胞向神经元分化的影响。标尺＝50μm；与Control组相比，

具体实施方式

下面结合实施例和附图具体阐述本发明所述的转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的应用，但不限于以下实施方式。

实施例

一、实验材料。

GFAP、NeuN抗体(北京博奥森生物科技有限公司)，Nestin、MAP-2、DCX、Sox-2、OLIIG-2抗体(美国Abcam公司)，Cy3、FITC标记二抗(美国Jackson公司)，BrdU(美国Sigma公司)，蛇床子素(纯度≥98％，成都普菲德生物科技有限公司)。

二、实验方法。

1.蛇床子素脂质体(Ost-Lip)的制备。

采用薄膜分散法制备Ost-Lip。精密称取处方量EPC、Chol、DSPE-PEG

2.转铁蛋白修饰蛇床子素脂质体(Tf-Ost-Lip)的制备。

精密称取2.00mg Tf加入到制得的Ost-Lip溶液中，于37℃水浴条件下振摇2h，即可得到Tf-Ost-Lip。

3.星形胶质细胞的原代培养、传代与鉴定。

3.1星形胶质细胞的原代培养。

取新生(48h内)C57BL/6小鼠，置于75％乙醇中浸泡10min，移入超净工作台内。取出大脑并分离出海马区，移入5mL离心管中，加入3mL PBS溶液，眼科剪剪成1mm

3.2星形胶质细胞的传代。

待细胞融合度达到90％时进行传代，弃去培养基，加入1mL PBS溶液清洗细胞2次，加入0.5mL 0.05％胰蛋白酶常温消化，显微镜下观察细胞突起回缩并与瓶底分离后，加入等体积完全培养基终止消化，将细胞混悬液转移至15mL离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清液，加入完全培养基吹打混匀，显微镜下计数，调整细胞浓度为1×10

3.3星形胶质细胞的鉴定。

将第3代星形胶质细胞按1×10

(1)吸去孔内培养基，PBS清洗3次，每次5min。

(2)4％多聚甲醛固定30min，PBS清洗3次，每次5min。

(3)1％Triton X-100透化15min，PBS清洗3次，每次5min。

(4)5％BSA封闭15min，PBS清洗3次，每次5min。

(5)每孔加入兔抗GFAP、DCX、NeuN、OLIG2或Iba-1一抗稀释液100μL(1：200，V/V)，置于4℃冰箱孵育过夜。

(6)次日晨，室温复温30min，PBS清洗3次，每次5min，每孔加入山羊抗兔FITC标记二抗稀释液100μL(1：500，V/V)，室温避光孵育1h，PBS清洗3次，每次5min。

(7)加入DAPI染色液染细胞核，室温避光显色15min，PBS清洗3次，每次5min。

(8)倒置荧光显微镜下观察各孔阳性细胞并拍照。

4.AD细胞模型的制备、分组与给药。

4.1 AD细胞模型的制备。

根据前期实验结果，选取Aβ

4.2分组与给药。

(1)空白对照组：用神经干细胞专用培养基正常培养。

(2)模型组：用含50μM Aβ

(3)Tf-Ost-Lip组：用神经干细胞专用培养基并添加Tf-Ost-Lip(100μM)来培养Aβ

5.神经球诱导分化。

将各孔神经球用移液器打散后移入离心管中，1500rpm，离心3min，弃去上清液，加入分化培养基(包含10％FBS、1％P/S的DMEM/F12培养基)，吹打混匀，显微镜下计数，调整细胞浓度为5×10

6.神经球及诱导分化后的鉴定。

利用免疫荧光染色进行鉴定，方法如下。

(1)吸去孔内培养基，PBS清洗3次，每次5min。

(2)4％多聚甲醛固定30min，PBS清洗3次，每次5min。

(3)1％Triton X-100透化15min，PBS清洗3次，每次5min。

(4)5％BSA封闭15min，PBS清洗3次，每次5min。

(5)每孔加入Nestin、Sox-2、DCX、MAP-2、GFAP、NeuN或OLIG2一抗稀释液100μL(1：200，V/V)，置于4℃冰箱孵育过夜。

(6)次日，室温复温30min，PBS清洗3次，每次5min，每孔加入Cy3或FITC标记二抗稀释液100μL(1：500，V/V)，室温避光孵育1h，PBS清洗3次，每次5min。

(7)加入DAPI染色液染细胞核，室温避光显色15min，PBS清洗3次，每次5min。

(8)倒置荧光显微镜下观察各孔阳性细胞并拍照。

7.神经球增殖能力检测。

7.1 NSCs球数量的测量。

分别于第7d、9d及14d对星形胶质细胞去分化而来的NSCs球进行拍照记录，利用Image J软件计算神经球个数。

7.2 BrdU染色。

培养至第14d时，将NSCs球打散继续培养6h，于培养终止前2h加入终浓度为10μM的BrdU溶液，随后进行BrdU/DAPI免疫荧光染色，具体步骤同“方法3.3”按照如下公式计算细胞增殖率。增殖率(％)＝(BrdU

8.神经球向神经元分化能力检测。

培养至第14d时，将NSCs球打散更换为分化培养基，继续培养10d后，进行MAP-2/DAPI免疫荧光染色，具体步骤同“方法3.3”，观察Tf-Ost-Lip对其分化为神经元的影响。

9.统计学分析。

利用GraphPad Prism 6.0统计软件对数据进行处理，所有数据表示为均数±标准差(`x±s)，多组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验，P<0.05视为差异具有统计学意义。

三、实验结果。

1.海马区星形胶质细胞的鉴定。

结果如图1A所示，第3代星形胶质细胞胞突多、突起长、呈多边形和不规则形状，突起相互交织成网状，透光性较好，视野中不可见神经元、成纤维细胞、少突胶质细胞及小胶质细胞，纯度良好。免疫荧光染色结果如图1A所示，细胞呈GFAP阳性表达，细胞质显示绿色荧光，细胞核显示蓝色荧光；而初生神经元特异性标志物DCX、成熟神经元特异性标志物NeuN、少突胶质细胞特异性标志物OLIG2及小胶质细胞特异性标志物Iba-1呈阴性表达，如图1B所示，经过阳性细胞计数及统计，体外培养的星形胶质细胞纯度为95％以上，可用于后续实验。

2.星形胶质细胞逆分化的神经干细胞的鉴定。

如图2A所示，将星形胶质细胞接种于神经干细胞培养基中继续培养之后，可见星形胶质细胞原有的细胞形态发生改变，表现出上皮样细胞形态，并且这些细胞在第7d时逐渐转化成由小的圆形或梭形细胞组成的上皮样NSCs集落，其中一些细胞群表现出了类似于神经球的球体结构，且悬浮生长，随后并不断扩增。将神经球机械性打散后利用免疫荧光细胞化学法对其进行鉴定，结果如图2B所示，细胞可高表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin(红色)和Sox2(绿色)，证明了它们是未分化的神经干细胞，同时也验证了星形胶质细胞具备逆分化为神经干细胞的能力。我们将神经干细胞球机械性打散，使其分散成单个细胞，接种于神经干细胞分化培养基中诱导其分化，10天后，我们采用免疫荧光细胞化学法对其分化能力进行检测。结果显示，NSCs可分化为DCX

3.Tf-Ost-Lip对星形胶质细胞逆分化的影响。

如图3-1至图3-2所示，培养至第7-14d时，Control组神经球数量最多，AD组神经球数量显著减少，与Control组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；孵育Tf-Ost-Lip后神经球数量显著增多，与AD组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)以上结果提示Tf-Ost-Lip可促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化为神经干细胞。

4.Tf-Ost-Lip对星形胶质细胞来源的神经干细胞增殖能力的影响。

NSCs球培养至第14d时，将其打散继续培养6h，于培养终止前2h加入终浓度为10μM的BrdU溶液，行BrdU/DAPI免疫荧光染色，结果如图4所示，Control组NSCs BrdU/DAPI阳性细胞数量最多，细胞增殖率为(43.66±6.44)％，AD组NSCs BrdU/DAPI阳性细胞数量显著减少，细胞增殖率为(23.22±5.21)％，与Control组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；孵育Tf-Ost-Lip后BrdU/DAPI阳性细胞数量显著增多，细胞增殖率为(32.32±3.97)％，与AD组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。以上结果说明Tf-Ost-Lip增强Aβ损伤的星形胶质细胞去分化而来的NSCs的增殖能力。

5.Tf-Ost-Lip对星形胶质细胞来源的神经干细胞向神经元分化的影响。

将NSCs球置于分化培养基中培养10d后，观察Tf-Ost-Lip对其分化为神经元的影响，结果如图5所示，Control组NSCs分化为神经元的比例为(18.47±6.11)％，AD组NSCs分化为神经元的比例为(9.30±2.73)％，与Control组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；孵育Tf-Ost-Lip后NSCs分化为神经元的比例为(12.89±2.77)％，与AD组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示Tf-Ost-Lip可促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化而来的NSCs向神经元分化。

综上所述，通过以上具体实施实例可知，转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体可以显著促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成为神经干细胞，并且这些去分化的神经干细胞具有增殖能力与分化为星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞的能力。转铁蛋白修饰蛇床子素长循环脂质体在促进Aβ损伤的星形胶质细胞去分化成分神经干细胞中是有潜在价值的，并且去分化的神经干细胞可用于治疗AD等多种中枢神经系统疾病。