体外培养的星形胶质细胞在机械损伤后逆分化为神经干细胞的实验研究

摘要

神经干细胞（NSC）移植是目前被认为是治疗中枢神经损伤最有临床应用前景的细胞，但NSC的来源、致瘤性以及移植后的排异反应等诸多方面的问题又面临着巨大的挑战。研究发现：在神经系统损伤（机械性、化学性或病理损伤）时，损伤区周围的AST能够表达nestin，且呈现神经前体细胞或NSC特性，经过培养可以获得NSC，这一现象的发生机理不甚清楚。 据推测可能与AST周围分子微环境变化引起其逆分化有关。因此AST逆分化的特性为神经系统损伤修复、退行性疾病及脑肿瘤的治疗提供了一条蹊径。本实验目的是通过模拟体内建立体外的损伤模型，观察AST在机械损伤区和远离损伤区的nestin表达的变化及逆分化形成NSC的情况，同时应用损伤AST培养体系产生条件培养基来干预正常生长的AST,进一步研究正常生长AST形成神经前体细胞/NSC情况以及AST 逆分化的可能性。最后采用蛋白技术对条件培养基的活性进行筛选分析,探讨诱使AST逆分化的细胞因子及可能存在的作用机制。为下一步从蛋白和基因水平研究引起AST逆分化为NSC的分子机制打下基础，也为临床上采用促AST逆分化活性分子治疗神经损伤提供理论依据。 本研究共分为五部分。在第一实验部分中，我们成功建立了一种培养高纯度和高细胞活性的脊髓AST方法，应用这种方法培养的脊髓AST，然后对培养的AST的细胞活性，细胞纯度，细胞周期进行分析，结果证明：这种培养脊髓AST方法可以有效排除非AST的污染，获得的AST具有活性高、增殖力强以及纯度高（可达99％以上）的特点，同时这种分离培养方法省时省力且操作简便可行，为应用AST作为细胞实验模型的研究奠定基础。 在第二部分实验中，首先建立AST机械损伤的模型，应用免疫细胞化学染色和及Westren-blot方法对对损伤后1-7d的AST在不同时间点对GFAP和Nestin表达的变化进行了观察和检测，同时应用BrdU染色检测AST损伤后细胞增殖的变化；最后应用NSC条件培养基培养这些损伤的AST并观察AST在损伤后的逆分化形成神经干细胞的情况。结果发现： AST在损伤后1-7d，Nestin表达不断发生变化，在损伤初期Nestin表达仅局限于损伤区的部分细胞，随着培养时间延长Nestin阳性细胞数量不断增加而且由损伤区向远离损伤区的方向扩散。Western-blot结果证实AST在损伤后1-7d，Nestin表达呈现上升趋势，其表达的相对光密度由0.404升至0.707，而GFAP表达量不断下降，其表达的相对光密度值由0.86降至0.721，而对照组没有明显的Nestin表达；BrdU染色发现，AST在损伤后损伤区BrdU+细胞数量随着培养时间延长不断增加，其比例由13.4％增至55.3％，培养至7d时达到43.2％，略有下降，但仍明显高于对照组7.9％；将损伤后的AST用干细胞条件培养基进行培养,可以产生神经干细胞球,经RA和含血清的培养基诱导分化可以产生神经元和神经胶质细胞，这些结果可以提示AST损伤后可以发生逆分化反应。 在第三部分实验中，为了进一步探讨AST机械损伤后的发生逆分化的是由损伤后AST产生某些可溶性信号分子引起，还是由AST 之间的细胞间网络通讯（缝隙连接）和无所不在的钙震荡导致或二者协同作用的结果。我们将正常的AST置入损伤的AST培养体系中进行细胞不接触的联合培养，然后观察生长在AST损伤环境中正常AST细胞学特性的变化。通过应用免疫细胞化学染色技术对与损伤的AST联合培养的AST 进行GFAP和Nestin染色，观察它们在不同培养时间后表达的变化并且对不同染色情况的细胞进行计数，同时对联合培养的细胞进行BrdU染色，检测AST增殖的情况；另外对不同培养时间细胞的周期进行流式细胞仪检测，分析AST细胞的周期变化； 最后应用NSC条件培养基对这些AST培养，研究AST在损伤环境中逆分化形成神经干细胞的情况。结果发现: 将正常的AST与损伤的AST联合培养后，在联合培养1d后，有少量呈现斑块状的着色的Nestin+细胞，而且染色比较/Nestin 淡，GFAP染色比较强烈，GFAP++的细胞相对较少，仅有24.4％。此时也有少量的GFAP-/Nestin+它们所占比例为3.6％；培养到3d后，GFAP+/Nestin+细胞数目不断增加可达72.9％，而且Nestin在细胞中的表达明显增强；与此同时GFAP+/Nestin-细胞数目在减少（18.2％），而GFAP-/Nestin+细胞数目已增加到6.8％，总的细胞密度在增加，且Nestin染色呈现强阳性反应的细胞在不断增加；培养5d后， GFAP+/Nestin+数目可达78.6％,GFAP-/Nestin+的细胞数也有所增加达到10.5％，GFAP+/Nestin-降至6.4％。 而对照组的细胞没有明显的GFAP+/Nestin+阳性细胞出现，基本都是GFAP+/Nestin-的细胞。经过BrdU染色我们发现在联合培养1d，3d，5d时，BrdU阳性细胞所占比例分别13.9％，19.6％，25.68％。通过流式细胞仪对细胞周期检测发现，当联合培养1d，3d，5d后细胞周期也发生了明显的变化，处于G2期细胞的百分比由16.4％增至23.2％,而对照组细胞基本都滞留在G0/G1, 处于G2期的细胞比例一直都低于7.1％。将这些细胞用干细胞条件培养基培养可以得到具有多向分化潜能的NSC, 进行诱导分化后可以产生神经元和神经胶质细胞，但是这些神经球分化很不一致，具有异质性。以上结果可以提示：AST损伤后发生的逆分化可能是通过产生可溶性分子介导实现。其次AST逆分化产生的神经前体细胞/NSC分化后具有异质性。 在第四部分实验中，为了进一步证明条件培养基诱导AST发生逆分化的可能性以及探讨诱导AST发生逆分化的机制，在本实验中，我们用AST损伤条件培养基培养正常AST，观察这些AST产生神经前体细胞和RG情况。 实验采用G5无血清和有血清培养基培养损伤的AST，然后用其培养正常的AST，结果发现无血清组的AST在3d后能够形成RG样细胞，经过RC-2免疫细胞化学染色，这些具有RG样的细胞形态且呈现RC-2阳性反应，有血清组AST在培养5d后也可以产生RC-2免疫反应阳性形似RG的细胞，且RG的产生随着培养时间延长不断增加。同时对两组细胞进行Pax-6进行半定量RT-PCR，结果发现：经过条件培养基诱导后的AST可以表达Pax-6,且表达的量无血清组在3d和5d时分别为0.421和0.539，有血清组在5d和10d时分别为0.586和1.09。其次对两组细胞进行RC2和Nestin免疫双标染色，发现两组的细胞都有RC2+/Nestin+双阳性的细胞产生，但无血清组的比例相对较高。最后对细胞进行了A2B5和GFAP双标染色，结果发现，随着培养时间的延长细胞由GFAP+/A2B5-逐渐转变为FAP-/A2B5+。这些结果提示：AST损伤条件培养基可以诱导AST逆向分化为RG和胶质细胞的前体细胞，这种逆行分化现象视乎不受血清影响。 在第五部分实验中，我们对AST损伤条件培养基中活性分子进行初步分离和活性分析，结果发现：AST损伤后能够产生的促AST发生逆分化的分子，这些分子可能存在多种，它们可能位于不同分子量范围，对AST产生逆分化效应通过协同作用实现。经过初步筛选得到促AST逆分化的活性分子的分子量位于30-70kd，但是这一区段的分子诱导AST逆分化形成的神经球生长的速度比较缓慢，同时经过分化诱导产生的少突胶质细胞相对多,从以上的结果可以提示对此区段分子发生逆分化反应的AST可能只是AST的一种亚型。 综上所述，AST在体外机械损伤情况下能够逆分化产生神经干细胞，而且损伤后可释放一些可溶性活性分子，这些分子能够促使培养的AST发生逆分化，这种逆分化发生机制可能要经历向RG和胶质细胞前体细胞的转化的过程，能引起AST逆分化分子有多种，包括位于30-70kd分子量范围，对这段分子发生效应的AST可能只是AST的一种亚群。