体外培养神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元的实验研究

摘要

目的：对体外培养的神经干细胞(NeuralStemCells，NSCs)进行诱导分化，观察其分化为多巴胺能神经元的能力和条件，为进一步利用NSCs移植治疗帕金森病奠定技术基础。 方法：取怀孕13．5-14．5天SD大鼠胚胎大脑皮层细胞，添加表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)、碱性成纤维生长因子(basicfibergrowthfactor，bFGF)和B27进行体外无血清培养筛选NSCs；取P3代NSCs在不同条件下进行诱导分化，观察其向酪氨酸羟化酶(州)阳性神经元的分化能力。诱导分化条件分为：(1)将携带核受体相关因子1(Nurrl)基因的重组质粒pcDNA3．卜hygro—Nurrl，电穿孔法转染NSCs，并进行分化实验；(2)利用全反式维甲酸(alltrans-retinoicacid，ATRA)和银杏提取物(Extracts0fGinkgoBiloba，Egb)对NSCs进行诱导分化；(3)制备骨髓基质细胞饲养层，利用饲养层细胞与NSCs共培养来观察其分化能力：(4)观察胎牛血清诱导NSCs分化。用免疫细胞化学方法对分化细胞进行递质表型鉴定，并且对阳性染色细胞计数进行统计分析。 结果：(1)携带Nurrl基因的重组质粒电穿孔法转染NSCs并经潮霉素筛选后，免疫组化染色检测到Nurrl表达。传代细胞分化7天后酪氨酸羟化酶免疫组化染色阳性神经细胞比率为27．20％±7．12％：与自然分化组差异有显著性(p<0．01)。(2)ATRA诱导分化组、Egb诱导分化组及ATRA+Egb组TH阳性神经元的百分比分别为12．02％4-2．78％、18．13％±1．74％和13．00％±2．54％，均显著高于对照组5．74％±1．81％。Egb诱导分化组及ATRA+Egb组乙酰胆碱酯酶(AchE)阳性神经元百分比分别为42．83％±3．08％和43．32％±5．60％，均高于对照组27．48％±2．51％，但ATRA诱导分化组26．32％±3．62％与对照组比较无显著差异。(3)利用骨髓间质细胞作为饲养层细胞与NSCs共培养，7天后分化为TH阳性细胞比率为15．12％±5．2％，显著高于自然分化对照组5．74％±1．8l％。(4)血清对NSCs向TH阳性神经元分化无促进作用，TH+细胞比率为1．67％±1．10％，与对照组无显著差异。结论：(1)转Nurrl基因可显著促进NSCs向TH阳性神经元分化。(2)ATRA可以促进NSCs向TH阳性神经元分化，但对NSCs向Ache阳性神经元分化无影响；Egb对NSCs分化为Ache阳性和TH阳性神经元有明显的促进作用；联用Egb和ATRA对NSCs分化无协同效应。(3)利用骨髓间质细胞作为饲养层细胞可促进NSCs向TH阳性神经元分化。(4)血清对NSCs向TH阳性神经元分化无促进作用。(5)Nugl基因修饰、ATRA／Egb、骨髓基质细胞饲养层均能诱导NSCs向TH阳性神经元分化，Nurrl基因修饰法效果最佳。

目录

英文缩略词表

论文摘要

1.引言

2.材料与方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

附录

致谢

综述 神经干细胞分化的研究进展