用于增殖产生胰岛素的胰岛细胞的组合物和方法及其治疗用途

摘要

本发明公开了将胰腺细胞分化为衍生自分离的胰岛的产生CD133/Ki‑67‑阳性激活的胰岛增殖细胞(AIPC)的功能性胰岛素，并使用包含活性剂的培养基在体外培养中扩增所衍生的AIPC的组合物和方法。本发明还公开了AIPC用于体内疗法、具体地对于胰腺病症、包括I型糖尿病的哺乳动物内植入的用途。

说明书

相关申请的引用

本发明申请主张2018年6月25日提交的美国临时专利申请No.62/689,780的权益，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。

背景技术

糖尿病是通过高血糖所定义的代谢疾病，但是其还导致对多种身体系统，包括神经、血管、眼、肾、心脏等的严重损伤。一些研究估计全世界可能存在4亿以上带糖尿病存活的人，并且糖尿病的发生率和发病率在全球，特别是美国、中国和印度逐渐升高。

存在多种糖尿病变体，但是两种主要类型占大多数。在1型糖尿病中，由于胰岛素-产生胰岛β-细胞的损失，胰脏产生很少或不产生胰岛素。这些胰岛素-产生胰岛细胞存在于2型糖尿病中，但是由于胰岛素抵抗，所产生的胰岛素的量和有效性较低。因此，不考虑变体，糖尿病的特征可以在于胰岛细胞的功能障碍。

糖尿病和胰岛生物学的研究已严重受限于不能培养和扩增胰岛细胞。目前，胰岛群集或细胞仅可以在培养中维持约3周，其基本上处于恶化状态，从而阻碍了胰岛细胞的长期研究。这种对培养和增殖胰岛细胞的不能性也限制了作为糖尿病潜在治愈方法的胰岛细胞代替治疗的能力。

目前，两种目前用于产生β-细胞以提供糖尿病中的药物发现和细胞移植疗法的细胞来源的标准技术为：(i)非β胰岛细胞，如诱导性-多潜能干(iPC)细胞，或成纤维细胞通过基因重编程和/或暴露于分化和多个成熟因子，或者通过将胚胎干细胞分化为β-样细胞的分化；和(ii)通过使用治疗性分子，成熟β-细胞的增殖的诱导。当前方法的主要缺陷与遗传操纵、分化效率和用于触发β-细胞增殖的化学品的潜在脱靶作用有关。另外，大部分方法需要长期培养和明显的操作步骤/时间，其提高了微生物污染的风险，显著影响生产成本，从而最终影响临床转化。

先前，研究组已尝试从干细胞体外产生胰岛素-产生胰腺β-细胞，因为据信这将提供用于糖尿病中药物发现和细胞移植疗法的前所未有的细胞来源。在2009年，在CellResearch中发表了指导人胚胎干(ES)细胞和人诱导性多潜能干(iPS)细胞两者分化成类似于成年胰岛β-细胞的成熟胰岛素-产生细胞的策略。为了产生这些iPS细胞，体细胞必需经历通过经受多个因子的游离基因重编程，所述多个因子包括(并且不局限于)OCT4、SOX2、KLF4和抗p53的短发夹RNA，并且这是需要花几个星期建立的多步事件。在最终阶段，分化的人ES细胞对葡萄糖刺激起反应，以接近成年人胰岛的方式分泌C-肽。此外，首次体外观察到了诱导的胰岛素-产生细胞内C-肽、PDX1和NKX6-1的共表达。为了产生这些细胞，使用了多种试剂/因子，并且所述规程需要2-3周的多步分化规程来产生细胞。

在2014年，Pagliuca等人(Cell,159卷:2期,428-439页,2014年10月9日)使用可缩放的混悬液-基培养系统，从人多潜能干细胞(hPSC)体外产生了β-细胞，其可以产生大于10

而在2015年，加利福尼亚的一个小组通过使用游离基因重编程因子结合特异性生长因子和化合物将人成纤维细胞转化为内胚层细胞命运(Nat.Commun.2016；7:100080)。使用促进向功能性胰腺β-样细胞的体外分化和成熟的化合物使这些细胞进一步分化。然而，这些细胞有待提供β-细胞替代来源，这主要是因为当体内植入时，他们的严格操作需要将细胞封装在装置中，他们不能产生适当调节血糖所必需的胰岛中的所有细胞，和移植后7周内畸胎瘤的形成。

先前，成熟β-细胞的增殖诱导伴随着双重-特异性酪氨酸-调节激酶1A(DYRK1A)的小分子抑制剂的使用(Wang等人,Cell Metab.2019；29:638-65)。DYRK1A抑制剂的使用导致在β-细胞中产生了1.5％-3％的增殖指数。最近，为了促进成熟β-细胞的增殖，Wang等人将DYRK1A与转化生长因子β超家族(TGFbSF)/SMAD信号转导的药理学抑制组合，产生了人β-细胞增殖的显著进一步协同升高(平均标记指数，5％-8％并且高达15％-18％)和小鼠和人两者的β-细胞数的升高。为了诱导成熟β-细胞的增殖，使用了完整胰岛并且不在胰岛外产生细胞。细胞不移动并且保持在胰岛结构中。为了从胰岛释放细胞，使用通过添加等量100％FBS中和的0.05％胰蛋白酶使胰岛解离。尽管该工作似乎是有希望的，但是所观察到的增殖水平不足以产生用于治疗性使用，如用于糖尿病的治疗的胰岛素-产生细胞的活细胞来源所必需的胰岛素-产生细胞数目。

当前用于产生作为用于糖尿病中的细胞疗法或移植的来源的真正的β-细胞的两种标准技术是高强度的，需要多个步骤、大量因子并且需要多周来产生所期望的细胞。细胞-基疗法提供了治疗和改变通过现有药物不足以解决的疾病，如I型糖尿病的过程的前景。

发明内容

本文所述的组合物和方法克服了上述方法的问题。本文公开了激活的胰岛增殖细胞(AIPC)群体和制备它们的方法。AIPC群体能够产生胰岛素并且使得胰岛群体的扩增能够满足用于细胞-基疗法中的使用的要求。

本文描述的方法提供了将分离的胰岛分化成具有特定百分比的产生胰岛素且具有CD133细胞标志物和Ki-67-标志物两者的胰岛(其在本文中表示为“三重阳性”胰岛)(本文进一步描述的)的AIPC群体为的快速方式。所谓的“三重阳性”胰岛是葡萄糖反应性的并且对适当刺激起反应而分泌胰岛素和高血糖素两者。

所述AIPC的代表性培养物已按照布达佩斯条约的条款通过ATCC保藏[保藏号_________]。

本文还公开了包括向哺乳动物，例如，人施用有效量的AIPC群体以恢复能够对葡萄糖刺激起反应而产生胰岛素的健康胰岛的治疗方法。

附图说明

图1示出了与在单独基础培养基中培养的鼠胰岛(参见表3)相比，用包含IMG(≈3μg/mL)的细胞培养基处理的培养的鼠胰岛(如本文进一步描述的，参见表2)的显微镜图像。在治疗后24小时内，所处理的胰岛变得较少群集，并且胰岛细胞显示出主动迁移离开群集。对照胰岛维持它们的群集形态并且显示出最小的细胞迁移迹象。培养72小时时，所处理的胰岛已丧失了它们大部分形态并且开始建立产生CD133阳性、Ki-67阳性增殖胰岛细胞的胰岛素的集落。(参见实施例1)

图2示出了与未处理的对照胰岛相比，用包含IMG(≈3μg/mL)的细胞培养物处理的培养的人胰岛的显微镜图像。如通过鼠胰岛所示(图1所示)，用包含活性剂的细胞培养基处理的培养的人胰岛显示出胰岛细胞从胰岛(第2天)迁移以及迁移的胰岛细胞扩增成产生CD133阳性、Ki-67阳性增殖胰岛细胞(第7天)的胰岛素的相同趋势。(参见实施例2)

图3示出了在第3和10天，如通过对照细胞群体(未处理的小鼠胰岛细胞)相对于处理的细胞群体的碘化丙啶和吖啶橙染色，然后进行FAC所确定的，比较细胞存活力的柱状图；两个群体(对照/未处理和处理的细胞)在第3和10天显示出超过80％的细胞存活力。(参见实施例1)

图4A和图4B示出了描绘与分离的人胰岛培养后，包含活性剂的培养基的作用的总结结果的柱状图；在包含IMG(≈10μg/mL)的培养基中培养的人胰岛导致与对照(未处理的人胰岛)相比，胰岛细胞数目升高，如通过CyQUANT细胞增殖测定(其测量细胞的DNA含量)所确定的。在胰岛铺板后3天进行测定，并且在细胞在培养基中培养10天后通过台盼蓝拒染进行细胞计数以确定细胞增殖。两种细胞测量方式(细胞增殖和细胞计数)显示衍生自在包含活性剂的培养基中培养的人胰岛的胰岛细胞数目显著升高，具体地，未处理的对照中的6,400个细胞，相比于用IMG处理后的9,500个细胞(图4A)；和未处理的对照中的小于500,000个细胞，相比于用IMG处理后的约2,500,000个细胞(图4B)。

图5示出了通过用包含活性剂(IMG)的培养基处理分离的、非天然胰岛所产生的AIPC能够在五(5)天内扩增超过至少两(2)代。用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记AIPC，然后使用CellTrace

图6A和图6B示出了与对照胰岛相比，包含活性剂(IMG)的培养基中培养的分离的胰岛促进胰岛向包含胰岛素、CD133和Ki-67-阳性细胞表型的细胞群体(AIPC)扩增。具体地，在包含活性剂的培养基中至少60％和大于70％(平均值)的所培养的分离的胰岛产生CD133/Ki-67/胰岛素阳性AIPC(61.47％)(参见图6B)；然而，对照细胞显示出小于5％的作为CD133/Ki-67/胰岛素阳性的对照细胞群体(基本为0％)(参见图6A)。使用FACs，对培养的AIPC评价CD133(体细胞祖细胞标志物)、Ki-67(与增殖有关的核内蛋白)的表达和胞内胰岛素表达。(参见实施例1和2)。

图7示出了在用包含活性剂的培养基处理后，衍生自分离的人胰岛的AIPC在葡萄糖刺激后分泌胰岛素。对AIPC进行静态培育葡萄糖刺激分泌测定(参见实施例2)。衍生的AIPC经历5种刺激条件以对于β-细胞功能评价来自培养基的胰岛素分泌。将AIPC与下列培育30分钟：(1)2.8mM葡萄糖(对照基线)；(2)16.7mM葡萄糖(用于胰岛素刺激)；(3)16.7mM葡萄糖+100μM IBMX(即，3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤，用于胰岛素最大刺激)；(4)1.7mM葡萄糖+1μM肾上腺素(用于高血糖素刺激)；(5)5.6mM葡萄糖+20mM KCl(用于胰岛素和高血糖素的其它刺激)。测定后，将培养基储存在-20℃，并对胰岛素进行标准ELISA分析，其中结果显示对于组1，胰岛素分泌水平为11μIU/mL胰岛素/百万个细胞；对于组2，57μIU/mL胰岛素/百万个细胞；对于组3，221μIU/mL胰岛素/百万个细胞；对于组4，6μIU/mL胰岛素/百万个细胞；和对于组5，22μIU/mL胰岛素/百万个细胞。

图8示出了在用包含活性剂的培养基处理后，衍生自分离的人胰岛的AIPC在葡萄糖刺激后分泌高血糖素。对AIPC进行静态培育葡萄糖刺激分泌测定(参见实施例2)。衍生的AIPC经历5种刺激条件以对于α-细胞功能评价来自培养基的高血糖素分泌。将AIPC与下列培育30分钟：(1)2.8mM葡萄糖(对照基线)；(2)16.7mM葡萄糖(用于胰岛素刺激)；(3)16.7mM葡萄糖+100μM IBMX(用于胰岛素最大刺激)；(4)1.7mM葡萄糖+1μM肾上腺素(用于高血糖素刺激)；(5)5.6mM葡萄糖+20mM KCl(用于胰岛素和高血糖素的其它刺激)。测定后，将培养基储存在-20℃，并对高血糖素进行标准ELISA分析，其中结果显示对于组1，高血糖素分泌水平为32pg高血糖素/百万个细胞；对于组2，30pg/百万个细胞；对于组3，52pg/百万个细胞；对于组4，98pg/百万个细胞；和对于组5，75pg/百万个细胞。

图9示出了在培养20天时，衍生的AIPC的亮场显微镜学，此后，衍生的AIPC显示出AIPC开始产生类似于胰岛的二级结构的迹象(在显微镜中并且通过染色可见)。当测试时，确定这些胰岛-样结构是二苯基硫卡巴腙(DTZ)阳性的，代表从头构建的胰岛中的推定β-细胞。DTZ结合存在于胰岛β-细胞中的锌离子，并因此将胰岛染色成红色(颜色结果未显示)。

图10A示出了用包含活性剂(IMG)的培养基处理后60天时，衍生的AIPC的FACs标志物谱和形态。在培养60天后，评价AIPC谱(使用如实施例2所述的流式细胞术)，并且作为细胞类型百分比(％)评价标志物。标志物谱如下(作为细胞百分比)：胰岛素-阳性/Ki-67-阳性/CD133-阳性显示为总细胞群体的61.47％。约10％的细胞对于标志物谱是阴性的。此外，根据本文中的方法所扩增的衍生的AIPC将它们的标志物谱(CD133/Ki-67/胰岛素“三重”阳性表型)和细胞形态在培养中维持了超过60天(图10B和10C)。

图11示出了AIPC保持体内存活并且在高血糖小鼠模型中引起血糖水平降低(参见实施例4)。在AIPC输注前4天，用浓度为75mg/kg的STZ处理C57BL/6J小鼠(n＝6；表示为M1、M2、M3、M4、M5、M6)。在第0天，当动物的空腹BG水平大于200mg/dL时，对每个STZ-处理的高血糖小鼠注射包含约四(4)百万鼠AIPC(分离自蕃茄红小鼠)的细胞悬液。每周测量两次每种STZ-处理的小鼠的空腹血糖水平；在AIPC施用后第28天处死两只动物，并且在第42天处死两只动物。在第46天，对剩余2只STZ-处理的动物注射另外(约)1000万个细胞(分别通过尾静脉)并在第70天处死。所有接受AIPC注射的STZ-处理的动物显示出血液葡萄糖水平的改善，从AIPC施用前的300-500mg/dL，降低至AIPC施用后第50天时的约200mg/dL。

图12示出了处死的动物的组织学分析(实施例4)示出了STZ-处理的动物胰脏中的供体蕃茄红AIPC，表明尾部-输注的AIPC通过血流向胰脏的迁移/归巢。AIPC似乎在更长的一段时间内处于更大的浓度。

图13示出了在第70天处死的AIPC输注小鼠的免疫组织学分析(实施例4)示出了胰脏内对蕃茄红和Ki-67两者“双重阳性”的区域，表明已归巢至胰脏的AIPC可以分裂和增殖。

具体实施方式

本文描述了用于促进包含胰岛的原代细胞分离株向包含标志物CD133(干细胞标志物)和Ki-67(活性增殖标志物)阳性细胞的内分泌祖细胞群体的增殖、扩增和分化以及胰岛素分泌的组合物和方法。所述组合物包含含有基础培养基和活性剂的培养基，所述活性剂包含根据(例如)SEQ ID NO：1的分离的多肽或其活性片段。可替换地，所述活性剂可以包含根据(例如)SEQ ID NO：2-4的分离的多肽。所述方法包括所述培养基促进包含对于CD1331和Ki-67阳性的标志物谱的内分泌祖细胞群体从包含胰岛的分离的原代细胞的胰岛细胞分化和增殖的使用。

本文描述了内分泌祖细胞群体(称为AIPC、AIPCs或AIPC群体)，其中所述内分泌祖细胞群体是a)哺乳动物来源的；b)对CD133细胞标志物呈阳性的；c)对Ki67细胞标志物呈阳性的；d)对刺激起反应产生-胰岛素的；e)通过用包含活性剂的培养补充剂处理包含胰岛的分离的原代细胞产生的，所述活性剂包含具有根据(例如)SEQ ID NO：1-4的氨基酸序列同一性的多肽或多肽片段。

其它方法包括通过本文所述的方法产生的内分泌祖细胞群体用于细胞移植或植入，或者用于工程设计对于治疗多种胰脏病症或疾病有用的组织的使用。

在本发明公开中使用以下术语来描述本发明的不同方面。这些术语仅用于解释的目的，并且不意欲限制本发明的任何方面的范围。

如本文所使用的“活性剂”是指具有与根据SEQ ID NO：01，包括SEQ ID NO：2-4(其代表SEQ ID NO：1的片段)的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列的蛋白、多肽、肽片段或其类似物，并且包括对其的任何修饰。另外，考虑了具有与根据SEQ ID NO：2-4的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列的肽片段或其类似物，并且包括对其的任何修饰。

如本文所使用的，术语AIPC、AIPCs或AIPC群体是指根据本文所述的方法产生的非天然衍生的内分泌(胰腺)祖细胞群体，其中所述细胞群体对于细胞标志物CD133和Ki67是阳性的并且响应刺激产生胰岛素。

如本文所使用的，术语“生长”是指处于活的状态的细胞的维持，并且可以包括(但不限于)细胞的增殖和/或分化。术语“增殖”是指由于细胞分裂，存在于培养中的细胞数目的增加。

如本文所使用的“培养”、“培养的”或“培养”是指细胞从环境(如宿主哺乳动物中)的移除或分离和它们在良好的体外人工环境中的后续生长。“培养的细胞”旨在包括通过将细胞转移至具有新鲜生长培养基的新容器中，从而为继续生长、分化和/或增殖提供更多空间的继代培养(即传代)。

术语“扩增”旨在表示所得的细胞群体衍生自胰岛在包含IMG的媒介物组合物中的离体培养。术语“扩增的”不应被视为或受限于任何细胞来源的机制或理论，并且可以包括在培养中从头发生的细胞。

对“胰腺细胞”的提及包括通常存在于胰脏中的那些细胞，并且包括胰岛细胞，例如，高血糖素-合成α-细胞、胰岛素-产生β-细胞及其任意组合。从通过本文所述的方法培养的胰岛细胞增殖的所衍生的AIPCs对于胰岛素的产生和用于治疗糖尿病(包括，例如，I型糖尿病)的受试者中的植入等是有用的。胰腺细胞群体对于Ki-67一般不超过3％的阳性，Ki-67是用于辨别使用如本文所述的方法从胰腺细胞产生的AIPCs的细胞标志物。

如本文所使用的术语“靶点”是指需要治疗或补充的受体宿主(哺乳动物，优选地人)中的区域。靶点可以是具体器官内的单一区域或者可以是宿主中的多个区域。在一些实施方式中，无论是否靶向胰脏，所述补充或替换导致产生了与正常组织，如胰腺组织相同的生理反应。

如本文所使用的，术语“治疗”、“治愈”和“处理”以及如本文所使用的其它语法等价形式包括减轻、减少或改善疾病或病况的症状、预防其它症状，改善或预防症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病况，例如，终止疾病或病况的发展，减轻疾病或病况，导致疾病或病况消退，缓解疾病或病况所引起的状况，或者终止疾病或病况的症状，和预防。这些术语还包括实现治疗益处和/或预防益处。治疗益处表示正在治疗的潜在病症的根除或改善。另外，通过一种或多种与潜在病症有关的生理学症状的根除或改善，从而在患者中观察到改善，实现了治疗益处，尽管所述患者仍可能患有潜在的病症。

如本文所使用的，“治疗有效量”或“有效量”表示足以实现所述效果的量。治疗病况的治疗有效量是能够在患者或患者群体中实现临床相关终点的活性物质的量。作为非限制性实例，有效量的包含AIPCs的组合物的施用是约400万至约1400万个细胞/千克的量，或者大于2亿个细胞的量，以将高血糖受试者，如患有高血糖的患者降低至正常血糖范围，约100至125mg/dL(5.6至6.9mmol/L)至小于150mg/dL。作为用于注射或输注的组合物配置的AIPCs的适当剂量将基于正在治疗的受试者和正在治疗的病况的严重程度。在鼠科模型和使用哺乳动物(人或鼠科)细胞的细胞培养实验中部分实施了本文所公开的实例。使用比例法，如异速比例法，有可能预测如本文所公开的，包含AIPCs的组合物向成年人的施用的适合且示例性的剂量范围。剂量比例法是实验方法，并且已在本领域中很好地鉴别和理解。该方法假设在物种间，对于解剖学、生理学和生物化学过程，存在一些独特特征，并且照此，通过比例法解释了药代动力学/生理学时间中的可能差异。作为一个实例且不意欲作为限制，基于文献，人胰脏具有60万至200万个胰岛；因此，在正常人胰脏中存在约六亿个胰岛细胞，其中它们的一半是β-细胞。因此，基于该尺度，预期400万个AIPCs/kg的剂量将足以替换正常人胰脏中的β-细胞。

如本文所使用的，术语“序列同一性”是指以序列之间的同一性或相似性术语表示的两条或更多条氨基酸序列之间的同一性。可以作为同一性百分比测量序列同一性；百分比越高，则序列同一性越高。对序列整个长度计算同一性百分比。当使用标准方法比对时，氨基酸序列的同系物或直系同源基因具有相对高的序列同一性程度。当直系同源蛋白衍生自更密切相关的物种(例如，人和小鼠序列)时，与不太密切相关的物种(例如，人和秀丽隐杆线虫(C.elegans)序列)相比，这种同源性更明显。

将用于比较的序列进行比对的方法在本领域中是熟知的。多种程序和比对算法描述于：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Nat.Acad Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:23744,1988；Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet等人,Nuc.AcidsRes.16:10881-90,1988；Huang等人Computer Appls.in the Biosciences 8,155-65,1992；和Pearson等人,Meth Mol.Bio.24:307-31,1994；Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990，其提供了序列对比方法和同源性计算的详细考虑。可以使用NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)确定序列同一性水平(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990)，其可得自几个来源，包括国家生物信息中心(National Center for BiologicalInformation(NCBI)，National Library of Medicine,Building 38A,Room 8N805,Bethesda,Md.20894,US)和互联网。

活性剂可以是包含293个氨基酸的肽的多肽、其肽片段，如美国专利申请No.15/811,060中所述的肽片段或其组合；其中所述多肽或片段的序列包含与如下所示且表示为SEQ ID NO：1-4的(293)氨基酸序列的一部分具有至少50％的同源性：

表I：SEQ ID NO：1-4：

SEQ ID NO：01(293aa；约31kDa的片段)

SEQ ID NO：2(159aa；约17kDa的片段)

SEQ ID NO：3(75aa；约8kDa的片段)

SEQ ID NO：4(87aa；约9kDa的片段)

可以翻译后修饰活性剂的氨基酸残基或将其与其它功能性或无功能分子基团缀合。参见，例如，Guo等人Mol.Biosyst.7(7):2286-2295,2011，其一般地描述了人核糖体蛋白S2的拮抗性瓜氨酸化和甲基化(例如，SEQ ID NO：1)。自然地，这些修饰的氨基酸残基包含在氨基酸序列中和本文所述的活性剂的范围内。

可以在本领域中已知的用于蛋白质生产，如细菌、酵母中的或者通过合成方式的生产，或者如美国专利申请No.15/811,060中所述的条件下生产根据(例如)SEQ ID NO：1-4的多肽和/或多肽片段。

第一方面涉及用于刺激胰岛群体向AIPC群体生长、增殖和分化的组合物，其中所述组合物包含含有基础培养基和有效量的活性剂的培养基，其中所述活性剂包括包含根据(表1中所列的)SEQ ID NO：1-4中的一个或多个的氨基酸序列的多肽或其活性片段。在一个实施方式中，所述多肽包括与SEQ ID NO：01中所示的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸序列；在另一个实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：01中所示的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。可替换地，多肽包括与SEQ ID NO：2-4中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸序列；在另一个实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：2-4中任一项所示的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。

第二方面涉及用于产生AIPC群体的方法，其包括用包含基础培养基和有效量的活性剂的细胞培养基体外培养胰岛群体。可以分析所述组合物以确定所述组合物对葡萄糖的反应性，如当暴露于一定量的葡萄糖时，分泌葡萄糖的能力。AIPC群体的特征涉及当暴露于适当刺激时，分泌高血糖素的能力。

第三方面涉及包含激活的胰岛增殖细胞(AIPC)群体的组合物，其中60％的AIPC群体由CD133细胞标志物和Ki-67细胞标志物组成，并且其中至少60％的AIPC群体能够产生胰岛素。

第五方面涉及包含通过以下方法所获得的激活的胰岛增殖细胞(AIPC)群体的组合物，所述方法包括用包含基础培养基和有效量的活性剂的细胞培养基体外培养胰岛群体。

第六方面涉及产生AIPC群体的方法，其包括用包含基础培养基和有效量的活性剂的细胞培养基体外培养胰岛群体以获得AIPC群体；对于对CD133、Ki-67和胰岛素具有选择性的一种或多种细胞标志物，筛选AIPC群体；和收集通过从培养的细胞群体中，作为CD133/Ki-67-阳性和胰岛素-产生的筛选所鉴别的AIPC群体。产生AIPC群体的方法还可以包括将AIPC群体在适合的培养基上铺板，用包含基础培养基和有效量的活性剂的培养基处理细胞以获得培养的AIPC群体，将培养的AIPC传代直至增殖了适合百分比的CD133/Ki-67-阳性和胰岛素-产生细胞的培养的AIPC群体。另外，可以将CD133+/Ki-67+/胰岛素+(“三重阳性”)胰岛细胞包装、配制或封装以用于向哺乳动物(例如，人)递送或移植。

第七方面涉及用于扩增和增殖激活的胰岛增殖细胞(“AIPC”)群体的方法，其包括使培养的AIPC群体酶促分离以获得分离的AIPC群体，将包含分离的AIPC群体和包含含有基础培养基和活性剂的培养基的细胞培养基的组合物再铺板至培养平板。可以在所述AIPC扩增和增殖中使用适合的蛋白酶，例如，胰蛋白酶。一旦分离，可以以足以形成颗粒的一定转速(例如，1000rpm)和持续时间(例如，7min)使AIPC离心。可以期望以适合的细胞密度，例如，约1000个细胞/cm

第八方面涉及处于用于体内疗法，具体地用于治疗一种或多种胰腺病症，具体地I型糖尿病的向哺乳动物施用或植入的包装制剂或微囊制剂形式的激活的胰岛增殖细胞(“AIPC”)群体。AIPC群体可以作为递送溶液包装，或者在递送媒介中包装，并且通过植入、注射或输注施用，无论所述施用是全身、局部还是针对靶点的。

第九方面涉及治疗胰腺病症的方法，其中所述胰腺病症是哺乳动物中的高血糖或I型糖尿病，其包括：在包含基础培养基和有效量的活性剂的培养基中体外培养来自哺乳动物种的胰岛群体以获得AIPC群体。在一个实施方式中，所述AIPC群体由胰岛素-产生CD133/Ki-67-阳性细胞组成。在另一个实施方式中，所述治疗胰腺病症的方法还包括测量AIPC群体对葡萄糖的反应。在另一个实施方式中，治疗胰腺病症的方法还包括使所述AIPC群体扩增和增殖；并且还包括将包含所述AIPC群体(例如，主要为胰岛素-产生CD133/Ki-67-阳性细胞群体)的组合物植入哺乳动物中，将所述组合物递送至靶点，借此提供胰腺疾病的治疗。在一个实施方式中，可以作为水溶液、混悬液、封装剂(encapsulation)、微囊剂(microencapsulation)和/或封装制剂或半固体制剂递送所述组合物；其中可以通过注射、输注、网膜或腹膜袋、手术植入中的一种或多种或者通过将所述组合物作为装置的一部分包装，将所述组合物递送至哺乳动物中的靶点。

在本发明的另一个方面，包含激活的胰岛增殖细胞(AIPC)群体的组合物还包含一种或多种缓冲液、一种或多种药学上可接受的载体或者一种或多种药学上可接受的添加剂。

本文所述的细胞培养系统包括至少初始，胰岛群体；细胞培养生长基底；和包含基础培养基和有效量的活性剂的培养基，其中所述活性剂包括根据(例如)SEQ ID NO：1-4的多肽或其片段，其中所述多肽或多肽片段与根据SEQ ID NO:1的多肽具有至少75％，或者至少80％，或者至少85％，或者至少90％，或者至少95％的序列同一性，例如，96％或以上，97％或以上，98％或以上或99％或以上的序列同一性。

实施例

通过对本文所主张的主题的说明而非通过限制提供了以下实施例。在整个实施例中，术语“IMG”用于表示具体的活性剂，其在本文中表示为SEQ ID NO：1，但条件是可以使用另一种活性剂，例如，SEQ ID NO：2-4，如本文中所描述和定义的。术语IMG及其量的使用不表示所述活性剂的任何具体剂量或浓度。对于实施例，在表2中描述了培养基中的添加剂/补充剂和活性剂的浓度，而在表3.培养条件中列出了对照培养基。

在37℃，标准CO

分割技术包括从培养平板除去上清液(保留上清液)。然后，用2-5mL PBS清洗平板(保留清洗液)。使用约3-5mL胰蛋白酶(如得自Sigma-Aldrich)，通过在存在胰蛋白酶的情况下，在37℃培育所述细胞约3-5分钟直至细胞分离来分离AIPC。然后，用PBS再次清洗平板。然后，以1000rpm将胰蛋白酶化的细胞以及保留的PBS清洗液和收集的细胞培养上清液在4℃离心7分钟。倒掉所得上清液，并将颗粒在2mL PBS中再混悬并再次离心。然后除去上清液，将颗粒在含有IMG的培养基中再混悬，并以约1000个细胞/cm

表2培养基

表3对照培养基

实施例1

在一项示例性研究中，从8至10周大的雄性BALB/c小鼠(如得自Jackson Labs或Charles River)的胰脏分离了300个鼠胰岛。在补充有10％胎牛血清、2mmol L-谷氨酰胺、抗生素和包含约3.0μg/mL浓度的IMG的添加剂的包含CMRL培养基(最初由ConnaughtMedical Research Laboratories开发，并且目前得自Mediatech等)的培养基中培养分离的胰岛。将处理的细胞与对照细胞一起生长并比较，对照细胞是在不含IMG的基础培养基中生长的相同细胞。在24小时内，基于以10倍放大倍数，通过显微镜(使用具有Lumenera照相机，Infinity分析软件的Leica光学显微镜)的目视检查，观察到在包含IMG的细胞培养基中生长的细胞变得较少群集，并且培养的胰岛细胞似乎主动迁移离开细胞群集。另一方面，观察到对照胰岛细胞维持它们的群集形态并且显示出最小的细胞迁移迹象。处理后3天，在包含IMG的培养基中培养的胰岛细胞在培养中显示出自由漂浮和贴壁细胞两种。如通过吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染色所确定的，自由漂浮的细胞是30％存活的。AO是可以渗透活细胞和死细胞两者的插入染料，而PI是在流式细胞术分析中用于排除非活细胞的细胞不可渗透的荧光溶液。PI通过在基底对之间插入结合至双链DNA，但是PI会被具有完整质膜的细胞排除。贴壁细胞是85％存活的。相反，对照胰岛细胞培养未显示出自由漂浮或贴壁细胞特征，尽管胰岛群集似乎是健康的，如通过细胞存活力>90％所测量的。截止第10天，已表明在包含IMG的培养基中培养的胰岛细胞显示出低胰岛细胞集群百分比，在培养中无保留的可辨别的自由漂浮细胞，并且贴壁细胞似乎形成集落。所测量的在包含IMG的培养基中培养的胰岛细胞的总细胞存活力大于90％。尽管对照细胞继续未显示出迁移或贴壁，但是胰岛群集细胞存活力保持在约90％。在培养25天时，将来自处理和对照(未处理)培养的胰岛细胞固定并对CD133(体细胞祖细胞标志物)和胰岛素染色。免疫组织化学染色显示用包含IMG的细胞培养基处理的胰岛细胞为至少75％胰岛素-阳性的。此外，处理的胰岛细胞为至少70％CD133-阳性的；约60％或以上的所测试的处理的胰岛细胞对CD133和胰岛素是阳性的(认为是“双重阳性的”)。相反，尽管90％胰岛素阳性，但对照细胞仅在小于5％的细胞群体中对标志物CD133显示出阳性。同样地，已发现小于5％的细胞群体对于CD133标志物和胰岛素两者是双重阳性的。

结果显示本文所述的细胞培养系统和培养基具有诱导胰岛细胞激活和从胰岛中迁移的作用。这些细胞形成了CD133/胰岛素“双重阳性”细胞群体的集落，其推定地代表了激活的β-细胞祖代，所述β-细胞祖代反过来可以用于使受损的胰岛再生的方法和治疗。

实施例2

在另一项示例性研究中，使用了人胰岛。人胰岛，如Human Islets for Research

实施例3

单独地，将人胰岛(3,000-10,000)在对照培养基或包含CMRL 1066培养基且补充有10％胎牛血清、10％人血清、2mmol/L-谷氨酰胺、抗生素和10.0μg/ml浓度的IMG的培养基中，在涂覆了包含I型胶原蛋白(来自鼠尾的胶原蛋白，Sigma-Aldrich C3867)和内皮细胞贴壁因子(ECAF，Sigma-Aldrich E9765)的贴壁因子混合物(AFM)的板上培养。可以使用不同比例的ECAF和胶原蛋白，包括50/50比例的胶原蛋白和ECAF。涂覆AFM薄层(3-10mL之间)并在设置30分钟后，除去过量的AFM并使板在超净工作台中干燥45分钟。在使用前，用PBS清洗板以除去任何潜在的污染物。将培养的胰岛在AFM-处理的烧瓶中(可以使用板)，在培养基或对照培养基中培育2至5天。

基于使用亮视野显微镜检查所观察到的结果，对照胰岛(在不含IMG的标准CMRL培养基中培养)显示维持了它们的群集形态，并且未显示出细胞迁移的迹象。测定了胰岛培养(无论是在包含IMG的培养基中培养还是在标准培养基中培养)的CD133和Ki-67(与增殖有关的核内蛋白)的表达，并且使用BD FACSAria流式细胞仪，通过荧光激活细胞分选(FACS)测定了胞内胰岛素表达。初始，对CD133表达标记培养细胞，然后根据生产商的说明，用FOXP3固定/透性化缓冲液，将细胞固定并透性化，并分别用缀合的荧光抗体对Ki-67和胞内胰岛素染色。然后，在FOXP3固定/透性化并用缀合的荧光抗体染色后，进行FACS分析。发现在包含IMG的培养基中培养的人胰岛细胞对于CD133、Ki-67和胰岛素是阳性的(三重阳性)，具体地：对于胰岛素、CD133和Ki-67，大于80％阳性，而对照细胞对胰岛素显示出大于75％的阳性，并且对于CD133和Ki-67显示出约10-15％的阳性。

为了测试培养的胰岛的葡萄糖反应性，对AIPC进行静态培育葡萄糖刺激分泌测定。将约1×10

实施例4

为了确定AIPC是否是体内存活的并且为了验证作为高血糖治疗和血糖控制方法的AIPC，用链脲佐菌素(STZ)(75mg/kg，用于破坏小鼠中的胰岛素-产生细胞和用于产生1型糖尿病表型的化学品)处理6只C57BL/6J小鼠(Jackson Labs，产品号No 000664)。一旦STZ-处理的动物(n＝6)显示出200mg/dL以上的空腹血糖水平，(用STZ处理后4天)，通过尾静脉注射，向STZ-处理的小鼠施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)水混悬液或在300μL PBS中包含约400万个AIPC的细胞混悬液。从番茄红(Tomato-Red)小鼠(Jackson Labs，产品号No 007576)分离在本研究中使用的AIPC，所述小鼠的细胞表达稳健的td-Tomato荧光。

为了产生用于细胞混悬液的AIPC，根据先前发表的方法(Bertera等人,JTransplant.2012；2012:856386,2012Dec 9)，通过5型胶原酶消化(得自Sigma-Aldrich)，从番茄红小鼠分离鼠胰岛。简言之；在处死后立即将2-3mL的冷胶原酶溶液(1.95mg/ml，在Hank's平衡盐溶液(HBSS)中)通过胆总管注射到胰脏中。除去完全膨胀的胰脏，并在组织培养烧瓶中，在37℃培育20分钟，然后振荡5秒以破碎组织。用补充有0.2％BSA的冷HBSS清洗消化的组织，并通过Ficoll梯度纯化胰岛。在培养基(表2)中，在37℃，标准CO

每周测量两次AIPC施用后的STZ-处理的小鼠的空腹血糖水平；在第28天处死2只动物(M2和M6)，并且在AIPC注射后的第42天处死2只动物(M3和M5)。在第46天，通过尾静脉注射，向剩余的2只动物(M1和M4)施用处于混悬液(PBS)中的另外的1000万个细胞/300μL，并在研究第70天处死。

结果显示STZ-处理的AIPC-注射的小鼠显示出空腹血糖水平降低，所述水平是随时间降低的。最终2只动物(接受两次AIPC注射的那些STZ-处理的小鼠，总计接受了约1400万个细胞)在第53天显示出正常的糖血(200mg/dL以下的血糖水平)(参见图11)。此外，组织学和免疫学分析表明通过尾静脉注射到STZ-处理的小鼠中的AIPC归巢至或移植到胰脏内，并且一旦向胰脏移植，则继续增殖，如通过组织学染色和显微分析所示(在图12和图13示出了结果)。

处死的动物的组织学分析示出了STZ-处理的动物胰脏中的供体蕃茄红AIPC，表明尾静脉输注的AIPC向胰脏的迁移/归巢(参见图12)。AIPC似乎在更长的一段时间内处于更大的浓度。通过尾静脉注射接受AIPC并随后在第70天处死的STZ-处理的小鼠的免疫组织学分析显示出对于蕃茄红和Ki-67两者双重阳性的胰腺组织内的区域(基于对标志物的组织学染色)，表明注射的AIPC归巢至胰脏，在此它们能够继续细胞分裂和增殖(参见图13)。

本文描述的方法包括在包含基础培养基和活性剂的细胞培养基中培养分离的胰岛的步骤。培养基未显示出导致胰岛细胞存活力降低的迹象，并且显示出促进胰岛解离和胰岛细胞从胰岛内部核心移动的直接迹象。在用培养基处理期间，显示出了这种所产生的培养的胰岛细胞的扩增。在包含活性剂的细胞培养基中扩增的所产生的细胞对胰岛素表达、CD133和Ki-67测试为阳性，并且代表了推定使用本文所述的方法和培养基产生的新型AIPC细胞群体。将通过分离的胰岛与包含活性剂的培养基的培养所产生的AIPC连续传代超过18代，并且显示保持在分离后存活至少100天。

根据本文的方法所产生的衍生的激活的胰岛增殖细胞群体在培养中包含至少30％的CD133+/Ki-67+细胞；或者在培养中包含至少35％的CD133+/Ki-67+细胞；或者在培养中包含至少40％的CD133+/Ki-67+细胞；或者在培养中包含至少45％的CD133+/Ki-67+细胞；或者在培养中包含至少50％的CD133+/Ki-67+细胞；或者在培养中包含至少60％的CD133+/Ki-67+细胞；或者在培养中包含至少70％的CD133+/Ki-67+细胞；或者在培养中包含至少80％的CD133+/Ki-67+细胞；或者在培养中包含至少85％的CD133+/Ki-67+细胞；或者在培养中包含至少90％的CD133+/Ki-67+细胞；并且其中至少60％的衍生的激活的胰岛增殖细胞也是胰岛素产生的。

先前已在本领域中描述了体外产生的胰岛细胞的封装和向哺乳动物的植入的特征(参见，例如，Altman等人,1984,Trans.Am.Soc.Art.Organs30:382-386和美国专利6,703,017B1，以上文献作为参考并入本文)-并且它们将适合于根据本文所公开的方法产生的AIPC。优选地，所述封装剂是低变应原的，易于且稳定位于靶组织中，并且为植入的细胞组合物提供了额外的保护以保护和防止植入的IPPC的破坏。

尽管已出于清楚理解的目的，通过说明和实施例在一些细节方面描述了以上发明，但是显而易见地，可以在所附权利要求的范围内实践某些变化和修改。对本领域技术人员清楚地是相对于如前文描述的任何方面和多个实施方式描述的特征可以是在不同实施方式之间可互换地可应用的。

如前文描述的本发明的方面和实施方式是描述本发明的多种特征的实例。在本发明申请中提及的所有专利公开和专利申请表现出本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利公开和专利申请以每个单个专利公开或专利申请具体且单独表明作为参考并入的相同程度作为参考并入本文。

在本说明书的整个描述和权利要求中，单词“包含”和“含有”及其变化形式表示“包括但不限于”，并且它们不意欲(并且不)排除其它部分、添加剂、组分或步骤。在本说明书的整个描述和权利要求中，除非上下文另外要求，否则单数涵盖了复数。具体地，当使用不定冠词时，除非上下文另外要求，否则说明书应被理解为考虑了多个以及单一。

结合本发明的具体方面、实施方式或实施例描述的特性、特征、化合物、化学部分或基团将理解为除非与之矛盾，否则适用于本文所述的任何其它方面、实施方式或实施例。在本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的所有特性和/或因此所公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任意组合合并，除了其中这些特性和/或步骤中的至少一些互相排斥的组合。本发明不局限于任何以上实施方式的详细信息。本发明延伸至在本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的特性的任何一个新颖特性或任何新颖特性的组合，或者延伸至因此所公开的任何方法或过程的步骤的任何一个新颖步骤或任何新颖步骤的组合。

本文所公开的信息作为参考并入本文，其包括(例如)2017年11月13日提交的美国专利申请No.15/811,060；2019年1月9日提交的PCT/GB2019/050049；和2018年6月25日提交的美国临时专利申请No.62/689,780。在本文所引入的术语和/或表达与本文所公开的术语和/或表达冲突的情况下，以本文所公开的信息为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 想象制药有限责任公司

<120> 用于增殖产生胰岛素的胰岛细胞的组合物和方法及其治疗用途

<130> IMG007_PCT

<140> <141>

<150> 62/689,780 <151> 2019-06-20

<160> 4

<170> Patentin version 3.5

<210> 1 <211> 293

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ala Asp Asp Ala Gly Ala Ala Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly1 5 10 15

Pro Gly Met Gly Asn Arg Gly Gly Phe Arg Gly Gly Phe Gly Ser Gly20 25 30

Ile Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg35 40 45

Gly Ala Arg Gly Gly Lys Ala Glu Asp Lys Glu Trp Met Pro Val Thr50 55 60

Lys Leu Gly Arg Leu Val Lys Asp Met Lys Ile Lys Ser Leu Glu Glu65 70 75 80

Ile Tyr Leu Phe Ser Leu Pro Ile Lys Glu Ser Glu Ile Ile Asp Phe85 90 95

Phe Leu Gly Ala Ser Leu Lys Asp Glu Val Leu Lys Ile Met Pro Val100 105 110

Gln Lys Gln Thr Arg Ala Gly Gln Arg Thr Arg Phe Lys Ala Phe Val

115 120 125

Ser Ala Arg Gly Cys Thr Ala Thr Leu Gly Asn65 70 75

<210> 4 <211> 87

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Gly His Val Gly Leu Gly Val Lys Cys Ser Lys Glu Val Ala Thr Ala1 5 10 15

Ile Arg Gly Ala Ile Ile Leu Ala Lys Leu Ser Ile Val Pro Val Arg20 25 30

Arg Gly Tyr Trp Gly Asn Lys Ile Gly Lys Pro His Thr Val Pro Cys35 40 45

Lys Val Thr Gly Arg Cys Gly Ser Val Leu Val Arg Leu Ile Pro Ala50 55 60

Pro Arg Gly Thr Gly Ile Val Ser Ala Pro Val Pro Lys Lys Leu Leu65 70 75 80

Met Met Ala Gly Ile Asp Asp85

<210>