提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质在治疗急性心肌梗死中的应用

摘要

本发明公开了提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质在治疗急性心肌梗死中的应用。实验证明，与C57BL/6小鼠相比，肝脏特异过表达SIRT5蛋白的C57BL/6小鼠的心肌梗死面积和心肌纤维化面积均显著减少，心脏功能有一定程度的提高。由此可见，提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质可以减少心肌梗死面积、减少心肌纤维化面积和提高心脏功能，进一步预防和/或治疗急性心肌梗死。本发明具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质在治疗急性心肌梗死中的应用。

背景技术

翻译后修饰(Post Translational Modification，PTM)是近年发现的蛋白质在翻译完成后受到的诸如磷酸化、乙酰化、琥珀酰化等修饰过程，可能对蛋白质的空间 构型、信号转导等产生影响，从而改变蛋白质的生物功能。大量基础研究提示PTM在 急性心脏缺血缺氧的致病过程中起重要的调控作用，如组胺去乙酰化酶HDAC7可能通 过影响平滑肌细胞增殖、迁移在冠状动脉支架植入术后再狭窄中起重要保护作用，氧 化修饰的高密度脂蛋白可能通过影响动脉粥样硬化斑块的稳定性、从而容易引起急性 冠脉事件。

赖氨酸琥珀酰化是一种近年新发现的蛋白质翻译后修饰，具体过程是将蛋白质的赖氨酸(K)残基由琥珀酰辅酶A(SucCoA)所提供的琥珀酰基团替换，使蛋白质的空 间构型以及功能发生变化，从而实现对病理、生理过程的调控。研究还表明，赖氨酸 琥珀酰化对于能量代谢活跃的疾病如肿瘤、糖尿病、脑卒中、肝病等均具有重要的调 控作用，但关于赖氨酸琥珀酰化在心脏疾病中作用的研究极少。

发明内容

本发明的目的是预防和/或治疗急性心肌梗死。

本发明首先保护提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质、和/或、提高肝脏SIRT5基因表达量的物质在制备减少心肌梗死面积的产品中的应用。

本发明还保护提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质、和/或、提高肝脏SIRT5基因表达量的物质在制备减少心肌纤维化面积的产品中的应用。

本发明还保护提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质、和/或、提高肝脏SIRT5基因表达量的物质在制备提高心脏功能的产品中的应用。

本发明还保护提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质、和/或、提高肝脏SIRT5基因表达量的物质在制备预防和/或治疗急性心肌梗死的产品中的应用。

本发明还保护C1)-C4)。

C1)SIRT5蛋白作为靶点在开发减少心肌梗死面积的产品中的应用。

C2)SIRT5蛋白作为靶点在开发减少心肌纤维化面积的产品中的应用。

C3)SIRT5蛋白作为靶点在开发提高心脏功能的产品中的应用。

C4)SIRT5蛋白作为靶点在开发预防和/或治疗急性心肌梗死的产品中的应用。

上述任一所述的应用中，所述SIRT5蛋白的检测对象具体可为肝脏。

本发明还保护S1)-S4)。

S1)SIRT5基因作为靶点在开发减少心肌梗死面积的产品中的应用。

S2)SIRT5基因作为靶点在开发减少心肌纤维化面积的产品中的应用。

S3)SIRT5基因作为靶点在开发提高心脏功能的产品中的应用。

S4)SIRT5基因作为靶点在开发预防和/或治疗急性心肌梗死的产品中的应用。

上述任一所述的应用中，所述SIRT5基因的检测对象可为肝脏。

本发明还保护产品甲，可包括提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质或提高肝脏SIRT5基因表达量的物质；

所述产品甲的功能可为减少心肌梗死面积、减少心肌纤维化面积、提高心脏功能、预防急性心肌梗死和/或治疗急性心肌梗死。

所述产品甲的活性成分可为提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质或提高肝脏SIRT5基因表达量的物质。

本发明还保护产品乙，可包括提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质或提高肝脏SIRT5基因表达量的物质；

所述产品乙的功能可为制备鼠模型；

所述鼠模型具有K1)至K3)中至少一种表型：K1)心肌梗死面积减少；K2)心肌 纤维化面积减少；K3)心脏功能提高。

所述产品乙的活性成分可为提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质或提高肝脏SIRT5基因表达量的物质。

本发明还保护提高肝脏SIRT5蛋白活性和/或表达量的物质在制备鼠模型中的应用；所述鼠模型具有K1)至K3)中至少一种表型：K1)心肌梗死面积减少；K2)心肌 纤维化面积减少；K3)心脏功能提高。

本发明还保护提高肝脏SIRT5基因表达量的物质在制备鼠模型中的应用；所述鼠模型具有K1)至K3)中至少一种表型：K1)心肌梗死面积减少；K2)心肌纤维化面积 减少；K3)心脏功能提高。

上述任一所述SIRT5蛋白的Gene ID为68346。

上述任一所述SIRT5基因的GeneBank号为NC_000079.7。

上述任一所述心脏功能指的是射血分数(ejection fraction,％EF)和左室短轴缩短率(percentage of fraction shortening，％FS)。

实验证明，与C57BL/6小鼠相比，肝脏特异过表达SIRT5蛋白的C57BL/6小鼠(Liver Sirt5

附图说明

图1为建立小鼠急性心肌梗死模型的实验过程。

图2为健康志愿者与急性ST段抬高型心肌梗死患者血浆中蛋白的琥珀酰化相对含量比较结果(n＝6)。

图3为假手术小鼠与C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型外周血浆中蛋白的琥珀酰化相对含量比较结果(n＝8)。

图4为Liver Sirt5

图5为Liver Sirt5

图6为Liver Sirt5

图7为C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型心脏中SIRT5蛋白的表达量显著增加。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域 普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文 献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等， 如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，患者和健康志愿者均知情同意。

肝脏特异过表达SIRT5蛋白的C57BL/6小鼠为Sirt5条件敲入的C57BL/6小鼠， 具体由Biocytogen公司(中国北京)应用CRISPR/Cas9技术获得，记载于如下文献中： Du，Y.etal.SIRT5 deacylates metabolism-related proteins and attenuates hepaticsteatosis in ob/ob mice.EBioMedicine36，347-357，doi：10.1016/j.ebiom.2018.09.037(2018).

实施例1、小鼠冠脉左前降支结扎的急性心肌梗死模型(以下简称小鼠急性心肌梗死模型)的构建

1、构建小鼠急性心肌梗死模型的方法

取8-10周龄雄性小鼠，术前12h禁食，不禁水。使用2％戊巴比妥钠肌肉注射(90mg/kg)，术后吗啡镇痛。术中监测小鼠肢体II导联心电图。麻醉稳定后仰卧位固 定，剪开颈部皮肤钝性分离肌肉，切开气管后插管，连接小动物呼吸机，并持续监测 心电图。小鼠胸前区域脱毛，沿左侧3-4肋间斜行剪开胸部皮肤约2cm，眼科弯镊钝 性分离肋前肌肉及肋间肌，在3-4肋间隙钝性分离，打开胸腔，注意避免损伤肺叶， 分离心包后可观察到心脏，于左心耳和肺动脉圆锥交界处下方活结结扎冠状动脉左前 降支(LAD)，心电图出现ST段抬高即小鼠急性心肌梗死模型制备成功。

建立小鼠急性心肌梗死模型的实验过程见图1。

2、取C57BL/6小鼠，按照步骤1的方法，构建C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型。

3、取肝脏特异过表达SIRT5蛋白的C57BL/6小鼠(简称Liver Sirt5

4、假手术小鼠的制备

取8-10周龄雄性小鼠，术前12h禁食，不禁水。使用2％戊巴比妥钠肌肉注射(90mg/kg)，术后吗啡镇痛。术中监测小鼠肢体II导联心电图。麻醉稳定后仰卧位固 定，剪开颈部皮肤钝性分离肌肉，切开气管后插管，连接小动物呼吸机，并持续监测 心电图。小鼠胸前区域脱毛，沿左侧3-4肋间斜行剪开胸部皮肤约2cm，眼科弯镊钝 性分离肋前肌肉及肋间肌，在3-4肋间隙钝性分离，打开胸腔，注意避免损伤肺叶， 分离心包后可观察到心脏，仅将线穿过冠状动脉左前降支(LAD)不结扎，后逐层关闭 胸腔，缝合肌肉、皮肤。

实施例2、急性心肌梗死导致外周血浆中白蛋白赖氨酸的琥珀酰化修饰显著减少

1、本发明人的发明人分析ctl组(6个健康志愿者(ctl)组成)和STEMI组(6 个急性ST段抬高型心肌梗死患者(STEMI)组成)血浆中蛋白质谱。

结果表明，STEMI及ctl血浆中均可检测到赖氨酸(K)的琥珀酰化(Succ)、丙 二酰化(Mal)和戊二酰化(Glut)修饰(见表1)。

表1

比较STEMI组外周血浆、ctl组外周血浆和STEMI组冠脉抽吸血浆中蛋白琥珀酰化、丙二酰化、戊二酰化修饰的相对含量。部分结果见图2(Albumin为白蛋白，K为 赖氨酸，Succ为琥珀酰化修饰)。结果表明，与ctl组外周血浆相比，STEMI组外周血 浆和冠脉抽吸血浆中白蛋白多个赖氨酸位点的琥珀酰化修饰、丙二酰化修饰均显著减 少(*为p<0.05，**为p<0.01)。

3、取实施例1构建的8只C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型或8只假手术小鼠，术 后24h或72h，收集外周血并进行血浆蛋白的质谱分析。

结果表明，C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型和假手术小鼠外周血浆中均可检测到赖氨酸(K)的琥珀酰化(Succ)、丙二酰化(Mal)和戊二酰化(Glut)修饰(见表2)。

表2

比较AMI组(由8只C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型组成)术后24h外周血浆、 AMI组术后72h外周血浆和ctl组外周血浆(由8只假手术小鼠组成)中蛋白琥珀酰 化、丙二酰化、戊二酰化修饰的相对含量。部分结果见图3(Albumin为白蛋白，IGG2B 为免疫球蛋白G，K为赖氨酸，Succ为琥珀酰化修饰，Ctl为ctl组外周血浆，AMI 24h 为AMI组术后24h外周血浆，AMI 72h为AMI组术后72h外周血浆)。结果表明，与ctl 组外周血浆相比，AMI组术后24h外周血浆中白蛋白和免疫球蛋白G多个赖氨酸位点 的琥珀酰化修饰显著减少(*为p<0.05)。

实施例3、肝脏特异过表达SIRT5蛋白的小鼠的心肌梗死面积和心肌纤维化面积显著减少、心脏功能提高

由于白蛋白只要在肝脏中代谢，因此实施例2中急性心肌梗死导致外周血浆中蛋白多个赖氨酸位点的琥珀酰化修饰显著减少可能是由于急性缺氧状态下肝脏中SIRT5 蛋白的表达量增加引起的。为了进一步验证，取实施例1构建的C57BL/6小鼠急性心 肌梗死模型或Liver Sirt5

一、统计心肌梗死面积

1、取小鼠(C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型或Liver Sirt5

2、心肌组织固定之后，沿心脏短轴从心尖段开始切片，厚度约1mm，每个心脏3-4片。切片迅速放入六孔板并及时加入2ml浓度为1-2％的TTC溶液，37℃摇床孵育30min。

3、弃TTC溶液，用双蒸水冲洗组织切片2次，加样枪吸尽所有液体后每孔加入 4％多聚甲醛2ml固定切片，常温30min后拍照。

实验结果见图4中A。

4、使用Image-Pro plus软件测量左心室组织正常心肌组织面积和坏死心肌面积，其中正常心肌组织为TTC染色阳性显示为红色，坏死心肌组织TTC染色阴性显示为白 色。心肌梗死面积(％)＝梗死区域面积/左心室面积×100％

统计结果见图4中B(n＝8)。

二、统计心肌纤维化面积

取小鼠(C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型或Liver Sirt5

染色步骤为：(1)石蜡切片常规脱蜡至水，水洗5min；(2)3％氯化汞饱和溶液固 定40min，流水冲洗10min；(3)0.5％冰乙酸洗涤1s；(4)酸性品红+丽春红2R(1:2) 工作液染色10min；(5)0.5％冰乙酸洗涤1s；(6)1％磷钼酸洗涤2s；(7)1％亮绿复 染3min；(8)0.5％冰乙酸I、II洗涤各1s；(9)无水乙醇I、II、III洗涤各2s；(10) 二甲苯I、II各透明10min；(11)最后使用中性树胶封片，在普通光学显微镜下观察。

使用Image-Pro plus软件计算胶原容积分数(心肌胶原纤维面积/心肌组织总面积×100％)。

统计结果见图5中B(n＝6)。

三、观察心脏功能

取小鼠(C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型或Liver Sirt5

对比C57BL/6小鼠和Liver Sirt5

心脏功能结果见图6(n＝8)。

结果表明，与C57BL/6小鼠相比，Liver Sirt5

实施例4、C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型心脏中SIRT5蛋白的表达量显著增加

1、取实施例1构建的C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型或假手术小鼠，术后5天，0.5％戊巴比妥钠100mg/kg过量麻醉后，脱颈法处死小鼠，采集心脏组织。

2、完成步骤1后，将心脏组织冻入液氮后-80℃保存，用冰冻切片机切成约6μm 厚的心肌切片，室温干燥后用冰丙酮(-20℃)固定5min，再次室温干燥，然后用 Polysiloxane分隔开各个切面。室温下将切片置于含0.3％过氧化氢的PBS中20min 去除内源性过氧化物酶活性，再用PBS漂洗3次(每次5min)。接下来，根据不同二 抗选择特异性血清封闭20min，减少二抗的非特异性结合。封闭完成后于湿盒中加入 相应一抗4℃结合过夜，结合完毕后用PBS漂洗3次(每次5min)。二抗以1:200稀释， 在湿盒中室温孵育45min，结合完毕后用PBS漂洗3次(每次5min)，加入HRP标记的 链亲和素室温下孵育30min，加入AEC显色2-30min不等，目标蛋白显示为红色，放 入水中终止反应。PBS漂洗3次(每次5min)后用苏木精对染细胞核。以水溶性封片 剂甘油明胶进行封片。

部分结果见图7(左图为C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型，右图为假手术小鼠， 箭头为Sirt5蛋白)。结果表明，与假手术小鼠相比，C57BL/6小鼠急性心肌梗死模型 心脏中SIRT5蛋白的表达量显著增加。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨 和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较 宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发 明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本 发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的 改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。