聚乙二醇化重组人促红素的N糖基化液相分析方法

摘要

本发明公开了聚乙二醇化重组人促红素的N糖基化液相分析方法，包括：对聚乙二醇化重组人促红素样品工作液进行酶解；收集N糖链冷冻干燥后进行荧光标记；纯化后再次进行冷冻干燥；复溶后利用超高效液相色谱对纯化样品进行N糖基化色谱分析，按异构体峰簇积分色谱图，得到不同唾液酸化程度的异构体峰簇的峰面积百分比。本发明检测方法可以按照唾液酸化程度的差异对糖链异构体进行分离，相同唾液酸含量的糖型异构体组成同一簇峰，可简单、明了地依据各簇峰所占比例制定质量标准，在药物生产过程中实现便捷地质量控制，后续用于生产过程的质量控制时，无需每次均经质谱鉴定即可依照不同唾液酸化程度的峰簇所占比例进行质量控制，节省时间与经济成本。

说明书

技术领域

本发明涉及聚乙二醇化重组人促红素的N糖基化液相分析方法，尤其涉及基于唾液酸化差异且便于药物质量控制的聚乙二醇化重组人促红素的N糖基化液相分析方法，属于聚乙二醇化重组人促红素的N糖基化分析领域。

背景技术

重组人促红素(EPO)是治疗肾性贫血的有效药物，随着中国肾衰透析成本降低，透析病人数量不断增加，未来EPO的需求将会逐渐增加。但是EPO半衰期短，药物频繁注射给病人带来较大的痛苦和安全风险。聚乙二醇重组人促红素(PEG-EPO)是利用聚乙二醇修饰EPO后开发的一种长效促红素，主要用于肾功能不全病人的贫血治疗。聚乙二醇修饰的蛋白质药物在血液循环中的半衰期明显延长，溶解度和稳定性得到改善，免疫原性降低，生物利用度增强，它的半衰期由重组EPO的24小时延长至130小时，明显改善了药物在临床中的局限性。

PEG-EPO是由165个氨基酸组成的且经PEG修饰的多肽，是高度糖基化的重组细胞因子，同时含有3个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点。糖基化是一种重要的翻译后修饰，最重要的糖基化影响因素是PEG-EPO分子中唾液酸的含量，未发生唾液酸修饰的糖链，末端裸露的半乳糖会被肝脏半乳糖受体识别，从而快速被清除，因此，重组人促红素类药物的N糖基化水平对其生物学活性有重要影响，N寡糖是关乎有效性的关键质量属性。国外药典中已有针对EPO的N寡糖质控标准，但目前中国国内外尚无针对聚乙二醇化重组人促红素(PEG-EPO)的N寡糖质控标准，所以亟需开发一种快速准确的PEG-EPO N寡糖分析的方法。

与完整的蛋白或糖肽分析相比，糖链的分析方法更灵敏。较小的糖链分子更容易分离，质谱离子化或检测也更容易，可检测到更低丰度的糖型。LC-MS是目前EPO糖基化分析的最重要方法之一。尽管EPO中同时存在N-糖链和O-糖链，但对EPO糖链的分析主要集中于N-糖链，这是由于传统用于O-糖链释放的方法如碱性β-消除，条件比较苛刻，唾液酸易丢失或O-乙酰化修饰易被破坏。而对N-糖链的分析相对简单，PNGase F酶切就可得到EPO中所有的N-糖链。然而，重组人促红素类药物的糖链十分复杂，因此液相色谱分离在质谱鉴定前是必须的。

发明内容

为更全面、便捷地对聚乙二醇化重组人促红素(PEG-EPO)进行N寡糖质量控制，依据PEG-EPO的N寡糖末端含有大量不同比例的唾液酸的特性，且WAX-HILIC混合模式色谱技术适合含有唾液酸的寡糖分离，寡糖分子中唾液酸越多，电荷数越大，保留能力越强，本发明提供了一种聚乙二醇化重组人促红素的N糖基化液相分析方法，包括：

(1)制备聚乙二醇化重组人促红素(PEG-EPO)样品工作液；

(2)用糖苷酶对聚乙二醇化重组人促红素样品工作液进行酶解；从酶解液中收集N糖链，将N糖链冷冻干燥后进行荧光标记；

(3)将荧光标记后的N糖链纯化后再次进行冷冻干燥；

(4)将冷冻干燥后的纯化样品复溶后利用超高效液相色谱对纯化样品进行N糖基化色谱分析，按异构体峰簇积分色谱图，得到不同唾液酸化程度的异构体峰簇的峰面积百分比，即样品中不同唾液酸化异构体的比例。

其中，对纯化样品进行N糖基化色谱分析包括：相同唾液酸化程度的异构体作为同一簇峰呈现在色谱图中，即糖链末端带有2个唾液酸分子的异构体集中在同一峰簇中，记为S2；糖链末端带有3个唾液酸分子的异构体集中在同一峰簇中，记为S3；糖链末端带有4个唾液酸分子的异构体集中在同一峰簇中，记为S4；因糖链末端带有1个唾液酸分子的异构体较少，本发明不对糖链末端带有1个唾液酸分子的异构体峰簇(S1)进行分析；记录S2-S4峰群保留时间和峰群面积百分比，得到不同唾液酸化程度的异构体峰簇的峰面积百分比，即样品中不同唾液酸化异构体的比例。

作为一种优选的具体实施方案，步骤(1)中所述的制备聚乙二醇化重组人促红素(PEG-EPO)样品工作液包括用PBS缓冲液对聚乙二醇化重组人促红素样品进行换液处理得到聚乙二醇化重组人促红素工作液；其中，所述PBS缓冲液的浓度优选为20-30mM，pH值优选为6.8-7.2，为了达到更好的效果，所述PBS缓冲液的浓度更优选为25mM，pH值更优选为7.0；

所述的换液处理优选采用超滤管离心超滤实现换液处理，最终调整聚乙二醇化重组人促红素样品蛋白浓度为0.8-2.4mg/mL，优选为1.6mg/mL，作为PEG-EPO样品工作液。

作为一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所述糖苷酶优选糖苷酶F，其中，糖苷酶F与聚乙二醇化重组人促红素工作液的比例优选为1:20-30(v/v)，更优选为1:25；其中，所述的酶解可以在下述条件下进行：在37℃温度下酶切反应10-15h。

作为一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所述的从酶解液中收集N糖链的方法可以是利用截留分子量10kD的超滤管离心超滤酶解液，并用超纯水洗涤2-3次收集滤出液得到N糖链。

步骤(2)中进行荧光标记所用到的荧光标记试剂组分可以是本领域的任何一种荧光标记试剂组分，作为一种供参考的具体实施方案，荧光标记试剂组分包括含醋酸的DMSO溶液、2-AB、氰基硼氢化钠；其中，含醋酸的DMSO溶液作为溶剂，其醋酸含量优选为30％(v/v)；2-AB在标记试剂中的含量优选为5.0％-5.5％(w/v)，更优选为5.0％；氰基硼氢化钠在标记试剂中的含量优选为6.0％-6.5％(w/v)，更优选为6.0％。

步骤(2)中进行荧光标记的反应参数可以是本领域的常规的参数，譬如，荧光标记温度可以为60-70℃，优选为65℃；荧光标记时间可以为4-6h，优选为5h。

步骤(3)中对N糖链纯化是利用GlycoWorks HILIC 1cc纯化柱实现的；其中，所述的纯化过程包括平衡、上样、洗涤、洗脱。作为一种优选的具体实施方案，所述的纯化过程为：首先向每个GlycoWorks HILIC 1cc纯化柱中加入超纯水进行平衡后使用正压或者负压装置超纯水排出，再加入乙腈溶液平衡后将乙腈排出；按照N糖链样品：纯乙腈＝1:10的比例分别将样品与纯乙腈混合后上样，将上样溶剂排出后，用乙腈洗涤后再用pH值为6.0-8.0的含5％乙腈的25mM碳酸氢铵溶液洗脱；优选的，采用用pH值为7.0的含5％乙腈的25mM碳酸氢铵溶液洗脱，收集洗脱液，对洗脱液进行冷冻干燥，得到糖链冻干粉。

作为一种优选的具体实施方案，步骤(4)中所述的复溶是利用超纯水和乙腈水溶液对糖链冻干粉进行重新溶解；其中，超纯水和乙腈水溶液的使用顺序优选为先使用超纯水进行复溶，样品溶解后再加入纯乙腈；所用到的超纯水和乙腈的比例优选为65:35。

作为一种优选的具体实施方案，步骤(4)中利用超高效液相色谱对纯化样品进行N糖基化色谱分析的色谱分析条件包括：流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为100mM甲酸铵溶液，pH值4.4；流动相B为70％乙腈；流动相的洗脱梯度见下：

流速优选为0.4ml/min；柱温可以为25-35℃；检测模式为荧光检测；检测波长为Ex330nm/Em420nm。

本发明提供一种便于聚乙二醇化重组人促红素(PEG-EPO)生产过程中质量控制的N糖基化检测方法，该方法基于超高效液相分析技术，依据糖链异构体唾液酸化程度差异对其进行分离。具体地，PEG-EPO的N寡糖末端含有大量不同比例的唾液酸，同时WAX-HILIC混合模式色谱技术适合含有唾液酸的寡糖分离，寡糖分子中唾液酸越多，电荷数越大，保留能力越强。本发明检测方法首先利用糖苷酶将N糖链特异性酶切，再利用2-AB对糖链进行荧光标记，利用优化的色谱参数实现在色谱上分离并检测N糖的目的。依据该方法的分离原理可知，相同唾液酸程度的糖链会集中在同一或邻近时间段洗脱下来，色谱图中相同唾液酸化程度的糖链异构体以峰簇形式呈现，这一结论已在该方法开发初期经质谱鉴定佐证。

本发明检测方法可以按照唾液酸化程度的差异对糖链异构体进行分离，相同唾液酸含量的糖型异构体组成同一簇峰，可以简单、明了地依据各簇峰所占比例制定质量标准，在药物生产过程中实现便捷地质量控制。本发明建立的检测方法后续用于生产过程的质量控制时，无需每次均经质谱鉴定即可依照不同唾液酸化程度的峰簇所占比例进行质量控制，可大大节省时间成本与经济成本。

特异性的考察试验结果显示，各样品的S2-S4各簇峰清晰可见，空白对照在积分区间内无明显干扰峰，本发明检测方法特异性良好。重复性考察试验结果显示，各峰群保留时间的RSD％范围为0.09％-4.25％，各峰群面积百分比的RSD％范围为0.38％-1.59％，证明本发明检测方法重复性良好。准确度考察试验结果显示，5个不同浓度样品的回收率在100.60％-116.33％范围内，同时，5个不同浓度的3份平行样品即15个样品的各峰群面积百分比的RSD％范围为5.18％-12.60％，表明本发明建立的检测方法准确度较高。

附图说明

图1为醇沉法收集糖链液相谱图。

图2为超滤法收集糖链液相谱图。

图3为洗脱液pH值为6.0时糖链色谱图。

图4为洗脱液pH值为8.0时糖链色谱图。

图5为洗脱液pH值为7.0时糖链色谱图。

图6为液相洗脱梯度优化前色谱图。

图7为液相洗脱梯度优化后色谱图。

图8为根据本发明实施例对本方法进行特异性考察的色谱图。

图9为根据本发明实施例对本方法进行重复性考察的色谱图。

图10为本发明液相分析方法对PEG-EPO糖基化检测结果。图11为采用商品化试剂盒对PEG-EPO糖基化分析检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

除另有说明外，以下所例举的实施例和试验例均按以下方法进行试剂和样品准备。

1.1实验仪器：waters超高效液相色谱仪(H-class型)、紫外分光光度计、离心机、电子天平、涡旋震荡仪、恒温水浴锅。

1.2试剂和材料：糖苷酶F、二甲亚砜(DMSO)、冰乙酸、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、氰基硼氢化钠、甲酸铵(色谱级)、甲酸(色谱级)、乙腈(色谱级)、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠·2H

1.3溶液的配制：

1.3.1标记试剂：取350μl DMSO置于离心管中，再加入150μl冰乙酸，混合均匀，得到30％醋酸的DMSO溶液。称取10mg 2-AB加至200μl 30％醋酸的DMSO溶液中，震荡溶解得到2-AB溶液。称取12mg氰基硼氢化钠加至200μl 2-AB溶液中，震荡溶解，65℃加热助溶，得到2-AB标记试剂。

1.3.2 85％乙腈：量取乙腈85ml，与15ml超纯水混合均匀，避光保存。

1.3.3含5％乙腈的25mM碳酸氢铵溶液(pH值7.0)：称取0.2g碳酸氢铵溶于90ml超纯水中，再加入5ml乙腈，混合均匀后用甲酸调节pH值至7.0，并用超纯水定容至100ml。

1.3.4 25mM PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，二水合磷酸氢二钠1.8g置于90ml超纯水中，充分溶解后用超纯水定容至100ml，得到100mM的PBS缓冲液。使用前将其稀释4倍，并用盐酸调节pH值至7.5，得到25mM的PBS缓冲液。

1.3.5流动相A(100mM甲酸铵(pH值4.4))：称取6.3g甲酸铵，溶于990ml超纯水中，用甲酸调节pH值至4.4，用超纯水定容至1L。经0.22μm滤膜过滤，超声脱气20min。

1.3.6流动相B(70％乙腈)：量取700ml乙腈与300ml超纯水充分混匀，超声脱气20min。

实施例1聚乙二醇化重组人促红素的N糖基化液相分析方法的建立

1.样品工作液的制备

初始PEG-EPO样品各取400μl分别置于超滤管(MWCO 10kD)中，14000rpm离心10min；加入300μl 25mM的PBS缓冲液(pH值7.5)，混匀，14000rpm离心10min；再加入300μl25mM的PBS缓冲液(pH值7.5)，混匀，14000rpm离心，最后一次离心时间可根据样品实际体积进行调整。换相后的样品用分光光度计测定蛋白浓度，然后用25mM的PBS缓冲液(pH值7.5)调整蛋白浓度为2.0mg/ml，作为样品工作液。

2.糖苷酶酶解：取样品工作液100μl，加至0.6ml的离心管中，再加入4μl糖苷酶F(PNGase F)，混合均匀，置于37℃下酶切12h。

3.N糖链超滤及冻干：将酶解后的样品分别转移至超滤管中，加入300μl超纯水，混匀，14000rpm离心8min；再加入300μl超纯水，混匀，14000rpm离心8min，收集滤出液至1.5ml离心管中。将离心管中的液体冷冻结实后放入真空干燥仪中充分干燥。

4.2-AB标记：向干燥的糖链中加入100μl 2-AB标记试剂，置于65℃下反应5h，进行荧光标记。

5.糖链纯化：使用GlycoWorks HILIC 1cc纯化柱对标记后的样品进行纯化。首先向每个纯化柱中加入1ml超纯水进行平衡，使用正压或者负压装置按照约1滴/s的速度(下同)将超纯水排出，再加入1ml 85％的乙腈溶液平衡，然后将乙腈排出。按照糖链样品：纯乙腈＝1:10的比例分别将样品与纯乙腈混合后上样，将上样溶剂排出后，用200μl 85％的乙腈洗涤3次，再用100μl含5％乙腈的25mM碳酸氢铵溶液(pH值7.0)洗脱4次，收集洗脱液，冷冻后置于真空干燥仪中浓缩至干燥，即得到荧光标记的N糖链冻干样品。将按照上述同样方法处理的PBS缓冲液作为空白样品。

6.样品的复溶

向每份冻干糖链中加入65μl超纯水复溶，溶解后再加入35μl乙腈，即总计用100μl乙腈水溶液复溶。混匀后待用。

7.设置液相分析参数

7.1仪器参数

柱温30±5℃；流速0.4ml/min；样品池温度10℃±1℃；上样量10μl；Ex330nm/Em420nm。

7.2洗脱梯度

表1洗脱梯度

利用超高效液相色谱对纯化样品进行N糖基化色谱分析，按异构体峰簇积分色谱图，得到不同唾液酸化程度的异构体峰簇的峰面积百分比，即样品中不同唾液酸化异构体的比例。

其中，对纯化样品进行N糖基化色谱分析包括：相同唾液酸化程度的异构体作为同一簇峰呈现在色谱图中，即糖链末端带有2个唾液酸分子的异构体集中在同一峰簇中，记为S2；糖链末端带有3个唾液酸分子的异构体集中在同一峰簇中，记为S3；糖链末端带有4个唾液酸分子的异构体集中在同一峰簇中，记为S4；因糖链末端带有1个唾液酸分子的异构体较少，本发明不对糖链末端带有1个唾液酸分子的异构体峰簇(S1)进行分析；记录S2-S4峰群保留时间和峰群面积百分比，得到不同唾液酸化程度的异构体峰簇的峰面积百分比，即样品中不同唾液酸化异构体的比例。

试验例1聚乙二醇化重组人促红素的N糖基化液相分析方法中有关参数的优化试验

1.从酶解液中收集N糖链的收集方法优化试验

分别试验了利用醇沉法(取上清)和超滤法(取滤出液)处理酶解液。N糖链冻干及荧光标记过程与说明书中步骤相同。液相分析后结果如图1、图2所示。图1显示在液相色谱上，糖链信号被干扰，无法正常出峰，推测应为聚乙二醇(PEG)的干扰。因为PEG既具有良好的水溶性，又可溶于醇、酮等多种有机溶剂，利用醇沉法除去蛋白杂质的同时却无法除去游离于样品的PEG。图2显示，当利用截留分子量10kD的超滤管离心超滤酶解液后进行液相分析时，出现较明显峰形，说明干扰出峰信号的物质已被除去。华润昂德生物药业有限公司所制备PEG-EPO用到的PEG活化酯分子量主要为30kD，EPO蛋白分子量和糖苷酶分子量也远大于10kD，因此本发明所采用超滤管可以有效截留蛋白杂质和PEG杂质，而将N糖链分子(最大分子量5kD)滤出。

2.N糖链纯化方式的优化试验

首先向每个GlycoWorks HILIC 1cc纯化柱中加入1ml超纯水进行平衡，使用正压或者负压装置按照约1滴/s的速度(下同)将超纯水排出，再加入1ml 85％的乙腈溶液平衡，然后将乙腈排出。按照糖链样品：纯乙腈＝1:10的比例分别将样品与纯乙腈混合后上样，将上样溶剂排出后，用200μl 85％的乙腈洗涤3次，再分别用pH值为6.0、7.0、8.0的100μl含5％乙腈的25mM碳酸氢铵溶液(pH值7.0)洗脱4次，分别收集洗脱液。纯化完成后对洗脱收集液进行冷冻干燥，得到糖链冻干粉。液相分析结果如图3-图5。结果显示，洗脱液pH值为7.0时效果较好，而且与不经纯化直接冻干、标记的糖链色谱图(图2)相比，峰形及分离度均有改善。

3.复溶溶剂的加入比例的优化试验

为便于进一步液相上样分析，分别用超纯水和乙腈比例为50:50、60:40、65:35的溶液对冻干糖链进行复溶。实验结果显示，水和乙腈比例为50:50时，无法完全溶解糖链，离心后有明显沉淀；水和乙腈比例为60:40时，沉淀明显减少，成半透明状；水和乙腈比例为65:35时，已无肉眼可见的沉淀。此时可顺利进行液相进样分析，不会出现堵塞现象。

4.色谱分析条件的优化试验

为使成簇色谱峰尽量接近基线分离且最大程度提高分离度，分别试验了不同液相洗脱梯度。最初始和最终的洗脱梯度见表2-表3。优化前与优化后的液相色谱图见图6、图7。

表2优化前洗脱梯度

表3优化后洗脱梯度

试验例2本发明检测方法特异性的考察试验

对空白样品、华润昂德生物药业有限公司生产的PEG-EPO对照品、PEG-EPO原液、PEG-EPO原液加速降解样品(40℃下放置7天)进行N糖基化检测。

特异性的考察试验结果(图8)显示，各样品的S2-S4各簇峰清晰可见；空白对照在积分区间内无明显干扰峰，特异性良好。

试验例3本发明检测方法的重复性考察试验

按照实施例1所述步骤制备PEG-EPO糖链冻干粉，复溶后该供试品连续进样6次。可接受标准：各峰群保留时间的RSD％≤5.0％，各峰群面积百分比的RSD％≤10.0％。

结果显示，各峰群保留时间的RSD％范围为0.09％-4.25％，各峰群面积百分比的RSD％范围为0.38％-1.59％，具体数据见表4，6次进样结果图谱见图9，结果证明本方法重复性良好。

表4本发明方法重复性考察具体数据

试验例4本发明检测方法的准确度考察试验

按照实施例1中的所述方法分别制备蛋白浓度为1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL、2.2mg/mL、2.4mg/mL的PEG-EPO工作液，并依照实施例1中相应的步骤分别用5个不同浓度的样品工作液制备5份糖链冻干粉并复溶，分别记为供试品B1，B2，B3，B4，B5。每个浓度的样品平行制备3份。上样分析后记录每个浓度样品S2-S4峰群峰面积的总和(总CPA)，计算每个浓度样品3次进样的总CPA试验平均值。以各浓度样品(供试品B1-供试品B5)的总CPA平均值与PEG-EPO工作液蛋白浓度做直线回归方程，得到线性拟合曲线。根据拟合得到的线性方程计算上述各浓度样品的理论总CPA值，将实测值与理论值相比计算回收率。

回收率％＝(试验测定总CPA平均值)÷(理论总CPA值)×100％。

可接受标准：线性拟合得到的R

结果显示，5个不同浓度样品的回收率在100.60％-116.33％范围内，具体数据见表5。同时，5个不同浓度的3份平行样品即15个样品的各峰群面积百分比的RSD％范围为5.18％-12.60％，具体数据见表6，表明本发明建立的检测方法准确度较高。

表5本发明检测方法准确度考察具体数据(一)

表6本发明检测方法准确度考察具体数据(二)

试验例5本发明方法与GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan试剂盒方法的比较试验

依据实施例1所述步骤制备PEG-EPO N糖链冻干粉并进行液相分析，得到本发明方法的检测色谱图见图10。

商品化试剂盒方法所用到的试剂盒为Waters品牌的GlycoWorks RapiFluor-MSN-Glycan试剂盒(货号：176003635)。具体步骤见试剂盒配套说明书，详细实验过程见www.waters.com/RapiFluorMS。用该方法制备PEG-EPO N糖链并进行液相分析得到的色谱图见图11。

两种检测方法的结果比较可知，本发明方法可以按照唾液酸化程度的差异对糖链异构体进行分离，相同唾液酸含量的糖型异构体组成同一簇峰，可以简单、明了地依据各簇峰所占比例制定质量标准，在药物生产过程中实现便捷地质量控制。而利用上述商品化试剂盒方法得到的检测结果是单个异构体峰，在不同批次的药物中细微糖基化差异均可导致峰形分布的差异，只能进一步通过质谱确定糖型，无法方便、快捷、低成本地实现生产过程的质量控制。