用于诊断、治疗和预防赘生性和神经性障碍的组合物和方法

摘要

本发明涉及用于诊断、治疗和预防各种病症的组合物和方法，所述各种病症包括但不限于癌症和神经性障碍。特别地，本发明涉及用于抑制PC4的组合物和方法。

说明书

相关申请的引用

本申请要求于2018年6月28日提交的美国临时申请号62/691,267的优先权，所述美国临时申请的全部内容引入作为参考。

背景

1.发明领域

本发明涉及用于诊断、治疗和预防各种形式的癌症的组合物和方法。特别地，本发明涉及包含PC4表达、活性和/或功能的抑制剂或调节物的组合物和方法。

2.背景描述

当前的癌症治疗剂，包括小分子和生物制品，靶向细胞表面分子或胞浆蛋白。这些靶的抑制可以导致细胞凋亡的开始，同时允许核DNA保持完整，这是癌症复发的先决条件。因此，靶向核蛋白，尤其是涉及染色质结构和DNA修复的蛋白质的疗法，可能具有阻断细胞凋亡逆转且降低复发率的潜力。

肺癌是美国的癌症有关死亡率的主要原因，其中可直接归于该疾病的死亡多于乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌的组合。据估计，2015年有158,040名美国人死于肺癌。存在肺癌的两个主要类型。约85%至90%的肺癌为非小细胞肺癌（NSCLC），而剩余部分为小细胞肺癌（SCLC）。这些类型的肺癌非常不同地进行治疗。

NSCLC已被分类为罕见病，具有对于更快速的调控路径的明确未满足的医学需要。尽管罕见病状态，患有NSCLC的患者群体的数量是显著的。用于NSCLC的当前治疗包括用于早期疾病的手术和放射，以及用于IV期转移性（40%）或III期局部晚期（30%至40%）疾病的化学疗法。最近的研究路线已集中于涉及肿瘤血管生成途径的靶蛋白因子，包括VEGFR、EGFR和酪氨酸激酶家族的成员。

人转录正辅因子4（PC4，也称为p14、p15、Sub1同系物等）是具有127个氨基酸残基的单链DNA结合蛋白，具有在N末端附近的富含丝氨酸的区域。这种辅因子已被克隆并鉴定为一般正辅因子，其可以通过与许多序列-和细胞-特异性调节物直接相互作用，来介导许多基因的转录激活[Ge和Roeder，（1994），Purification，cloning and characterizationof a human coactivator，PC4，that mediates transcriptional activation of classII genes. Cell 78，513-523；Kretzschmar，M.等人，（1994）A novel mediator of classII gene transcription with homology to viral immediate-early transcriptionalregulators. Cell 78，525-534]。由PC4介导的调节物包括许多核激素受体、肿瘤抑制因子、癌蛋白、以及对于肿瘤发生和其它人疾病的发病机制所必需的其它重要因子。

PC4充当癌蛋白，并且在肿瘤的细胞分化、发育和发病机制中发挥重要作用（美国专利号8,076,061）。PC4的表达受肿瘤抑制蛋白p53的控制，p53在转录水平上与PC4蛋白本身相互作用。另外，PC4充当p53的独特激活物，以调控涉及细胞周期、细胞凋亡、DNA修复和其它细胞应答的许多基因的转录[Kishore A. H.等人，（2007）p53 regulates its ownactivator-transcriptional coactivator PC4: a new p53 responsive gene.Biochem. J. 406，437；Banerjee，S.等人（2004）General transcriptional coactivatorPC4 activates p53 function. Mol. Cell Biol. 24，2052-2062]。PC4活性可以通过翻译后修饰（至少包括磷酸化和乙酰化）来进一步调控。PC4的磷酸化抑制其与靶向激活物相互作用的活性，并且负面调控其辅激活物功能。质谱分析提示了，PC4的体内过度磷酸化主要由酪蛋白激酶II介导，并且限于N末端富含丝氨酸的区域[Ge，H.等人，（1994）Phosphorylation negatively regulates the function of coactivator PC4. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91，12691-12695]。PC4的乙酰化由p300介导，并且受磷酸化抑制[Kumor，P.B.R.等人，（2001）p300-mediated acetylation of human transcriptionalcoactivator PC4 is inhibited by phosphorylation. J. Biol. Chem. 276，16804-16809]。

存在鉴定调控与癌症和肿瘤发生有关的基因和蛋白质的小分子，以及关于恶性肿瘤的改善分子诊断的需要。另外，存在具有增强的肿瘤特异性以及对正常细胞和组织的降低毒性的治疗和预防癌症的改善方法的需要。

概述

本发明涉及作用于抑制和/或预防癌症，且特别是肿瘤和其它病症的发展的试剂，并且特别涉及包含PC4表达、活性和/或功能的抑制剂或调节物的组合物和方法。

本发明的一个实施方案涉及包含AG-1031、AG-1503、AG-1601和/或其组合的组合物。优选地，组合物进一步包含药学上可接受的载体。

本发明的另一个实施方案涉及用于治疗或预防病症的方法，其包括向患者施用有效量的包含AG-1031、AG-1503和/或AG-1601的药物组合物。优选地，病症是癌症和/或神经性障碍，并且优选地，癌症是非小细胞肺癌、脑肿瘤或神经胶质瘤。还优选地，神经性障碍是阿尔茨海默氏病。优选地，药物组合物的有效量是治疗有效或预防有效的，并且该组合物是静脉内、肌内或经口施用的。

本发明的另一个实施方案涉及用于预防病症的疫苗，其包含AG-1031、AG-1503和/或AG-1601。优选地，本发明的疫苗抑制肿瘤形成、癌细胞的增殖、预防转移性疾病和/或神经变性。这些化合物是手性分子，并且作为具有L和S异构形式的对映体存在。本发明的化合物可以含有L和S同种型两者，或者仅作为L同种型或仅作为S同种型被分离。

本发明的另一个实施方案涉及抑制或预防肿瘤形成、癌细胞的增殖、转移性疾病和/或神经变性的方法，其包括向有需要的患者施用本发明的疫苗。优选地，施用是经口、静脉内或肌内的。还优选地，疫苗可以进一步包含佐剂，例如含有铝的化合物。可替代地，佐剂可以是不含铝的。

本发明的其它实施方案和优点部分地在下述说明书中阐述，并且部分地可以由该说明书显而易见，或者可以从本发明的实践中获悉。

附图说明

图1：药物规格和适应证表。

图2：AG-1503的化学结构（仅显示了一种同种型；（Cas#：5522-63-4粪卟啉III四甲基酯；MW：710.83）。

图3：AG-1031的化学结构（9-甲基(I)和13-甲基(II)反式-(±)-18-乙烯基-4,4a-二氢-3,4-双(甲氧羰基)4a,8,14,19-四甲基-23H,25H-苯并[

图4A：AG-1601的化学结构，其显示为L同种型（I和III；3-(2,8,13,18-四甲基-3-(3-氧代-3-((3-苯丙基)氨基)丙基)-12,17-二乙烯基卟啉-7-基)丙酸）；和S同种型（II和IV；3-(3,7,12,17-四甲基-18-{3-氧代-3-[(3-苯丙基)氨基]丙基)-8,13-二乙烯基卟啉-2-基}丙酸两者（WJUS01-241-1a；合成的；MW：679.86）。

图5：API物质对PC4-DNA结合的干扰。

图6A：显示了AG-1031和AG-1503抑制大鼠胶质母细胞瘤细胞系C6的图表。

图6B：显示了AG-1031和AG-1503抑制人非小细胞肺癌细胞系H841的图表。

图7：显示了AG-1031抑制NSCLC肿瘤生长的直方图。

图8：显示了AG-1031抑制NSCLC肿瘤生长的图表。

图9：在使用AG-1031作为针对NSCLC的疫苗中的渐进步骤。

图10：在AG-1031施用后的生长结果，显示了NSCLC形成的阻止。

图11A：在用化合物897-902之一接种疫苗后，AG-1031对A549异种移植小鼠中的肿瘤生长的作用的评价。

图11B：在用化合物903-908之一接种疫苗后，AG-1031对A549异种移植小鼠中的肿瘤生长的作用的评价。

图12：AG-1031对A549异种移植小鼠中的肿瘤生长的疫苗作用评价（疫苗组 – 上；对照组 – 下）。

图13：AG-1031对A549异种移植小鼠中的肿瘤生长的作用的评价。

图14A：如通过中心运动距离测量的，通过AG-1503对荷有神经胶质瘤的大鼠的焦虑和活动的旷场研究。

图14B：如通过运动总距离测量的，通过AG-1503对荷有神经胶质瘤的大鼠的焦虑和活动的旷场研究。

图15：AG-1031和AG-1503改善新物体识别的功效。

图16A：如通过基线的百分比测量的，研究和记忆能力的电生理学测试。

图16B：如通过实际百分比测量的，研究和记忆能力的电生理学测试。

图17A：肿瘤组织中的细胞凋亡相关蛋白的蛋白质印迹。

图17B：海马（hippopotamus）组织中的细胞凋亡相关蛋白的蛋白质印迹。

图18A：在NSCLC-A549细胞上的新化合物的筛选鉴定了AG-1601。

图18B：在NSCLC-14299细胞上的新化合物的筛选鉴定了AG-1601。

图19A：在NSCLC-H841细胞上的新化合物的筛选鉴定了AG-1601。

图19B：在神经胶质瘤C6细胞上的新化合物的筛选鉴定了AG-1601。

图20A：在旷场和新物体识别（NOR）实验中，AG1601改善了通过Aβ42诱导的认知损害。实验的时间图。B. 在旷场实验中进入中心区内的次数；C. 短期记忆的识别指数，以及D. 长期记忆实验的识别指数。

图20B：在旷场和新物体识别（NOR）实验中，AG1601改善了通过Aβ42诱导的认知损害。在旷场实验中进入中心区内的次数。

图20C：在旷场和新物体识别（NOR）实验中，AG1601改善了通过Aβ42诱导的认知损害。短期记忆的识别指数。

图20D：在旷场和新物体识别（NOR）实验中，AG1601改善了通过Aβ42诱导的认知损害。长期记忆实验的识别指数。

图21A：AG1601逆转了通过Aβ42诱导的海马LTP和DEP压制。通过TBS诱导LTP，并且通过LFS诱导DEP。

图21B：AG1601逆转了通过Aβ42诱导的海马LTP和DEP压制。LTP的平均fEPSP斜率。

图21C：AG1601逆转了通过Aβ42诱导的海马LTP和DEP压制。DEP的平均fEPSP斜率。

图22A：AG1601在Aβ-42诱导的AD模型中增强了还原的突触蛋白的表达。通过蛋白质印迹分析海马组织的匀浆物，并且如所示的通过个别抗体进行检测。

图22B：AG1601在Aβ-42诱导的AD模型中增强了还原的突触蛋白的表达。PSD95和SYP蛋白的定量分析。*P<0.05相对于假手术组，#P<0.05和##P<0.01相对于Aβ42组；n=3/组。

图23A：AG1601在Aβ-42诱导的AD模型中增强了还原的SIRT1蛋白的表达。来自海马组织的匀浆物的蛋白质印迹分析。

图23B：AG1601在Aβ-42诱导的AD模型中增强了还原的SIRT1蛋白的表达。蛋白质印迹结果的定量分析。

图23C：AG1601在Aβ-42诱导的AD模型中增强了还原的p-CREB蛋白的表达。来自海马组织的匀浆物的蛋白质印迹分析。

图23D：AG1601在Aβ-42诱导的AD模型中增强了还原的p-CREB蛋白的表达。蛋白质印迹结果的定量分析。

图24A：AG-1601在大鼠细胞中的功效（实际值）。

图24B：AG-1601在大鼠细胞中的功效（图表值）。

图25A：AG-1601在人神经胶质瘤细胞中的功效（实际值）。

图25B：AG-1601在人神经胶质瘤细胞中的功效（图表值）。

图26A：不同分批的AG-1601在C6和U251神经胶质瘤细胞中的功效（实际值）。

图26B：不同分批的AG-1601在C6和U251神经胶质瘤细胞中的功效（图表值）。

图27A：AG-1601在C6和U87神经胶质瘤细胞中的功效（实际值）。

图27B：AG-1601在C6和U87神经胶质瘤细胞中的功效（图表值）。

图28A：AG-1601、TMZ和卡莫司汀在U251细胞中的功效（实际值）。

图28B：AG-1601、TMZ和卡莫司汀在U251细胞中的功效（图表值）。

图29A：AG-1601、TMZ和卡莫司汀在U87细胞中的功效（实际值）。

图29B：AG-1601、TMZ和卡莫司汀在U87细胞中的功效（图表值）。

图30：AG-1601克服了T98G细胞中的TMZ抗性的效果。

图31A：AG-1601加强了TMZ在U251细胞中的效果（实际值）。

图31B：AG-1601加强了TMZ在U251细胞中的效果（图表值）。

图32A：AG-1601加强了TMZ在U87细胞中的效果（实际值）。

图32B：AG-1601加强了TMZ在U87细胞中的效果（图表值）。

图33A：AG-1601在SF295异种移植肿瘤小鼠模型中的功效（在n=6下的治疗）。

图33B：AG-1601在SF295异种移植肿瘤小鼠模型中的功效（在n=6下的对照）。

图33C：AG-1601在SF295异种移植肿瘤小鼠模型中的功效（在n=6下的治疗）。

图33D：AG-1601在SF295异种移植肿瘤小鼠模型中的功效（在n=6下的对照）。

图34A：在AG-1601治疗期间U87/SF295异种移植肿瘤小鼠的体重（治疗）。

图34B：在AG-1601治疗期间U87/SF295异种移植肿瘤小鼠的体重（对照）。

图35：从终止的SF295异种移植小鼠中分离的肿瘤（AG-1601临床前试验）。

图36：假手术、假手术加上AG-1601治疗的、C6神经胶质瘤、以及神经胶质瘤加上AG-1601治疗的体重。

图37：C6神经胶质瘤和神经胶质瘤加上AG-1601的肿瘤大小图像。

图38A：C6神经胶质瘤和神经胶质瘤加上AG-1601的肿瘤体积。

图38B：C6神经胶质瘤和神经胶质瘤加上AG-1601的肿瘤重量。

图39：假手术、假手术加上AG-1601治疗的、C6神经胶质瘤、以及神经胶质瘤加上AG-1601治疗的存活率。

发明描述

PC4是一般的转录辅因子，其通过多种多样的基因特异性和/或组织特异性调节物来介导转录激活。发现PC4的活性形式在大多数癌细胞系和原发性肿瘤中是上调的，并且发现PC4表达水平与肿瘤恶性程度相关联（参见美国专利号8,076,061）。这种调控分子涉及细胞凋亡、细胞周期进展、发育、磷酸化、增殖、染色质组构、DNA复制和修复，以及与癌症、神经变性疾病和其它病症有关的其它途径。最近的研究还已证实了PC4是人中表征的48种常见癌症标记物之一。

已惊讶地发现了在体外和体内均抑制PC4活性的许多分子（参见图1）。一个令人惊讶的发现是，目前用于光动力疗法中并且先前被FDA批准用于非肿瘤适应证的分子AG-1031，在体外和体内通过阻断其双链DNA结合能力来特异性抑制PC4活性，抑制非小细胞肺癌（NSCLC）细胞生长。除在肿瘤形成后抑制衍生自NSCLC细胞系A549的小鼠异种移植模型中的肿瘤生长之外，AG-1031的预注射还有效地阻止异种移植模型中的肿瘤形成。此外，AG-1031显著抑制衍生自胶质母细胞瘤细胞系C6的异种移植模型中的神经胶质瘤生长，伴有记忆力丧失和其它活性丧失的恢复。

另一个令人惊讶的发现是作为AG-1031类似物的分子AG-1503，其对神经胶质瘤细胞系C6的生长具有特异性抑制活性，但对NSCLC细胞系的生长没有显著的抑制活性。C6细胞系的异种移植模型的研究指示了，AG-1503具有恢复记忆丧失和其它活性丧失的更好活性。

另一个令人惊讶的发现是分子AG-1601，其是新合成的AG-1031类似物。研究指示了，除抑制一些NSCLC细胞系的生长之外，与AG-1503相比，这种分子对神经胶质瘤细胞的生长具有甚至更好的抑制活性。本发明的组合物和方法提供了一种先前不可用的个性化医学方法，其用于治疗和/或预防癌症、肿瘤和其它医学病症，具有新靶和新免疫刺激机制。

AG-1503

AG-1503（图2）是AG-1031的类似物，并且鉴定为强PC4抑制剂，并且表征为用于NSCLC、胶质母细胞瘤和阿尔茨海默氏病的潜在疗法。当单独或者与AG-1031、AG-1601或其它药物组合使用时，AG-1503可以用作用于NSCLC、神经胶质瘤治疗和其它癌症的单一疗法。AG-1503可以作为用于NSCLC和或神经胶质瘤的个性化药物，和/或作为预防NSCLC和/或神经胶质瘤发生的补充剂或疫苗。AG-1503可以通过一种或多种修饰进行修饰，而不减少功能活性，例如通过添加氢、羟基、线性或分支羧基、氧基、甲基或乙基的取代，或者通过与类似分子化学偶联。另外，AG-1503是手性的，并且作为具有L和S异构形式的对映体存在。本发明的化合物可以含有L和S同种型两者，或者仅作为L同种型或仅作为S同种型被分离。各种化学形式在本文中都称为AG-1503。

AG-1031

AG-1031（参见图3）是FDA批准的用于非肿瘤适应证的光动力（PD）药物。通过使用高通量筛选平台，AG-1031被鉴定为强PC4抑制剂，并且就针对非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗功效进行了表征。特别地，AG-1031可以在用于NSCLC和其它癌症的第一线治疗中，单独或者与AG-1503、AG-1601或其它药物组合用作用于NSCLC治疗的单一疗法。AG-1031可以作为用于NSCLC的个性化药物，和/或作为预防NSCLC发生的补充剂或疫苗。AG-1031可以通过一种或多种修饰进行修饰，而不减少功能活性，例如通过添加氢、羟基、线性或分支羧基、氧基、甲基或乙基的取代，或者通过与类似分子化学偶联。另外，AG-1031是手性的，并且作为具有L和S异构形式的对映体存在。本发明的化合物可以含有L和S同种型两者，或者仅作为L同种型或仅作为S同种型被分离。各种化学形式在本文中都称为AG-1031。

AG-1601

AG-1601（图4）是新合成的另一种AG-1031类似物。AG-1601被鉴定为强PC4抑制剂，并且可用作用于NSCLC、胶质母细胞瘤和阿尔茨海默氏病的疗法。AG-1601的化学结构作为L同种型（I和III；3-(2,8,13,18-四甲基-3-(3-氧代-3-((3-苯丙基)氨基)丙基)-12,17-二乙烯基卟啉-7-基)丙酸）；和S同种型（II和IV；3-(3,7,12,17-四甲基-18-{3-氧代-3-[(3-苯丙基)氨基]丙基)-8,13-二乙烯基卟啉-2-基}丙酸两者（WJUS01-241-1a；合成的；MW：679.86）存在。当单独或者与AG-1031、AG-1503或其它药物组合使用时，AG-1601作为用于NSCLC和/或神经胶质瘤治疗的单一疗法。AG-1601作为用于伴有PC4阳性患者的诊断的NSCLC和/或神经胶质瘤的个性化药物。AG-1601可以作为用于NSCLC和或神经胶质瘤的个性化药物，和/或作为预防NSCLC和/或神经胶质瘤发生的补充剂或疫苗。AG1601显示在体外对神经胶质瘤细胞比TMZ和卡莫斯汀更好的功效，显示对SF295异种移植肿瘤小鼠模型的功效；并且显示对C6异种移植肿瘤大鼠模型的功效。AG-1601可以通过一种或多种修饰进行修饰，而不减少功能活性，例如通过添加氢、羟基、线性或分支羧基、氧基、甲基或乙基的取代，或者通过与类似分子化学偶联。另外，AG-1601是手性的，并且作为具有L和S异构形式的对映体存在。本发明的化合物可以含有L和S同种型两者，或者仅作为L同种型或仅作为S同种型被分离。各种化学形式在本文中都称为AG-1601。

使用1,1'-羰基二咪唑用于激活，通过原材料Ph-IX（3,3'-(3,7,12,17-四甲基-8,13-二乙烯基卟啉-2,18-二基)二丙酸与3-苯丙胺的偶联，来制备AG1601和3,3'-(3,7,12,17-四甲基-8,13-二乙烯基卟啉-2,18-二基)双(N-(3-苯丙基)丙酰胺）（在本文中称为化合物B1）。AG1601和化合物B1可以通过使用氯仿/甲醇系统的层析方法进行纯化，以获得高化学纯度（>=95~97%）的可分离的固体AG1601和化合物B1。

制备方法可以包括下述主要步骤：

○ a）在环境温度下，在二甲基甲酰胺/二氯甲烷中，通过1,1'-羰基二咪唑激活原材料的羧酸1~3小时，以形成羰基咪唑中间产物M。

○ b）向上述中间产物M的溶液中逐滴添加芳基烷基胺，并且继续搅拌24~48小时。

○ c）向上述溶液中添加水，以沉淀出产物并过滤掉溶剂。

○ d）使用氯仿/甲醇（或乙醇）洗脱剂在硅胶柱上分离粗产物，以给出AG1601（在薄层层析上的较慢迁移）和化合物B1（在薄层层析上的较快迁移）。

可以使用这种方法来合成任何长度的胺的酰胺。该方法特别适合于快速生成用于生物学筛选的类似物。当中间产物M形成时，它可以分成多重部分，用于具有不同长度和形状的取代基的胺的反应。

本发明的方法允许反应在环境条件下维持的通常可获得的溶剂中发生。单酰胺和二酰胺比率可以通过胺数量加以控制，以在硅胶柱上分离产物混合物。

该方法产生可以有效地分开的单酰胺和二酰胺的混合物。在层析纯化后，纯的（>=95%）单酰胺和二酰胺可以用于体外和细胞筛选。

所述方法使得能够快速生成具有结构多样性和用于开发数量的可扩展性的化合物。例如，可以在下述程序中制备酰胺的化合物文库。

首先激活Ph-IX（3,3'-(3,7,12,17-四甲基-8,13-二乙烯基卟啉-2,18-二基)二丙酸。然后将它分成四个等份，并且与四种不同的胺反应。

步骤1：向在3 mL无水DMF（二甲基甲酰胺）中的Ph-IX（60 mg，0.107 mmol）溶液中，加入CDI（1,1'-羰基二咪唑，52 mg，0.321 mmol）。

步骤2：在室温下搅拌一小时后，当红色略微褪色（指示结束）时，经由注射器将红色液体平等地分配到四个试管中

步骤3：如下文3.1-3.4中所示，添加0.321 mmol胺，并且搅拌24小时。加入水以沉淀粗产物。

步骤4：将粗产物加载到制备型薄层层析板上，并且用混合溶剂（氯仿:甲醇=100:5）洗脱，以将二胺与单酰胺异构体分开。

3.1：当在步骤3中使用3-苯丙胺（45 µL，0.321 mmol）时，在层析分离后获得AG1601和化合物B1，以给出>95%（通过在UV光，253 nm下察看TLC板）。产率：28%（A，rf=0.4，单酰胺，5 mg）；33%（B，rf=0.8，二酰胺，7 mg）

3.2当在步骤3中使用丙胺（26 µL，0.321 mmol）时，在层析分离后获得化合物C，以给出>95%纯度（通过在UV光，253 nm下察看TLC板）。产率：17%（C，rf=0.5，二酰胺，3 mg）

3.3：当在步骤3中使用异丙胺（28 µL，0.321 mmol）时，在层析分离后获得化合物D和E，以给出>95%纯度（通过在UV光，253 nm下察看TLC板）。产率：35%（D，rf=0.5，二酰胺，5.7mg），29%（E，rf=0.8，单酰胺，5 mg）

3.4 .：当在步骤3中使用N,N-二甲基丙胺（40 µL，0.321 mmol）时，在层析分离后获得化合物F，以给出>90%纯度（通过在UV光，253 nm下察看TLC板）。产率：26%（F，rf=0.15，二酰胺，5 mg）

甲酯的合成可以通过下述程序来完成。

向在2 mL无水DMF（二甲基甲酰胺）/2 mL CH

化合物G，1H NMR（CDCl

化合物H，1H NMR（CDCl

可以使用下文概述的程序来实现大规模的AG1601和化合物B1合成。

向在10 mL无水DMF（二甲基甲酰胺）/10 mL CH

来自上文两个反应运行的合并的粗产物经受蒸发。在二氯甲烷去除后，向剩余的液体中加入150 mL水溶液（盐水:水=1:2），以粉碎(crush out)固体。在柱层析（62g硅胶）后，获得AG1601（单酰胺）（388 mg，61%）和化合物B1（二酰胺）（64 mg，8.5%）。还获得了含有AG1601和化合物B1两者的部分（70 mg，~9%）。

AG1601，1H NMR（DMSO-d

化合物B1，1H NMR（DMSO-d

MS：电喷雾电离正模式：[M+1]+=797.5；高分辨率MS确认：M+1=797.5453，分子式：C

本发明的一个实施方案涉及包含小分子的组合物，所述小分子抑制或调控PC4表达和/或活性。由于癌蛋白PC4在关于许多类型的人癌症和肿瘤的癌发生中起重要作用，因此PC4表达的调控导致细胞（包括癌细胞）的增殖和转移性疾病的压制和/或抑制。优选地，本发明的组合物被配制用于通过减少细胞PC4水平和/或抑制PC4功能，来直接或间接地治疗或预防癌症。本发明的优选组合物包含抑制或调控PC4表达和/或活性的化合物的类似物和衍生物。优选的PC4抑制剂包括例如AG-1031（维替泊芬/维速达尔）、AG-1503（粪卟啉III四甲基酯）、AG-1601及其组合。本发明的组合物治疗或预防各种病症，包括但不限于癌症、恶性肿瘤、肿瘤、神经性障碍和阿尔茨海默氏病。本发明的组合物提供了特别的吸引力，因为它们对于短期或长期施用是安全或/和有效的，具有最低限度的或没有不希望有的副作用。这些小分子优选是非诱变性的（不同于化学治疗剂）以及非细胞毒性的，但对于一种或多种疾病和病症的治疗和/或预防具有高效力。鉴定的某些小分子已经被FDA批准用于其它医学适应证，具有已知的安全概况，而其它小分子在其它方面是新的且以前未知的。类似物和衍生物包括具有保守取代、添加或缺失的本发明的小分子。保守取代、添加或缺失包括例如甲基或醛基、或者非功能性标记物或标记化合物的添加或缺失。

本发明的另一个实施方案涉及包含本发明小分子的药物组合物。药物组合物包含与药学上可接受的载体和盐组合的本发明的小分子，并且可以是水性的或冷冻干燥的。药学上可接受的载体包括例如水和其它水溶液、油、脂肪酸、糖类、碳水化合物和盐，并且可以是液体、凝胶或固体，例如粉末、胶囊或片剂，其配制用于对患者直接施用或定时释放施用。

本发明的另一个实施方案涉及用于治疗疾病和病症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的本发明的组合物。用本发明的组合物治疗的疾病和病症包括癌症，例如但不限于肺癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、小肠癌、卵巢癌和其它恶性肿瘤，以及阿尔茨海默氏病和并发症。患者包括但不限于哺乳动物，例如人（例如，成人、青少年、儿童、婴儿）、灵长类动物和驯养动物。施用可以是肠胃外或非肠胃外的，但优选是经口、肌内或静脉内的。治疗可以是短时间段（例如脉冲或连续的）、短期或长期、或在患者一生自始至终连续的。

本发明的组合物可以单独或者与有效地治疗癌症的一种或多种其它治疗组合，以有效量施用于受试者。本发明的组合物的有效量是有效降低或消除患病细胞数目的量和/或预防疾病复发的量。优选地，有效量是对患者无害的量，或者任何有害副作用降到最低或在其它方面被组合物对患者的有益效果超过的量。待施用的有效剂量通常取决于患者的年龄或重量、和/或疾病的严重程度而变。

本发明的另一个实施方案涉及本发明的药物组合物，当施用于患者时，所述药物组合物预防疾病或病症的发病。此类药物组合物充当预防疾病或病症的预防药物、免疫刺激剂和/或疫苗，所述疾病或病症例如癌症（包括但不限于肿瘤和转移性疾病）、神经性疾病及其组合。本发明的组合物的施用可以作为单一预防有效大丸剂（bolus），作为多重预防有效剂量，并且可以包括佐剂。佐剂可以含有铝，或可替代地，佐剂可以是不含铝的。施用可以是肠胃外或非肠胃外的，但优选是经口、肌内或静脉内的。

在一个进一步的方面，本发明提供了试剂盒，其包含一种或多种组合物，每种组合物包含治疗有效量的本公开内容的化合物的一种或多种化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其前药、其任何组合，以及在治疗脑癌中使用所述一种或多种组合物的说明书。

本公开内容的化合物可以以大约1:1、1:2或更大、1:5或更大、1:10或更大、1:20或更大、1:50或更大、或者1:100或更大的L/S异构体比率、或S/L异构体比率存在于组合物中和/或施用。

治疗有效的包含一定量的本公开内容的化合物，当施用于受试者用于治疗本文的病况或疾病（例如脑癌）时，所述量足以实现此类治疗。治疗有效量将取决于化合物，疾病及其严重程度，以及待治疗的哺乳动物的年龄、重量、身体状况和响应性而变。

本公开内容的化合物可以施用于受试者，例如优选哺乳动物。优选的哺乳动物包括但不限于豚鼠、犬、猫、大鼠、小鼠、仓鼠和灵长类动物，包括人。

药学上可接受的指示物质或组合物与制剂包含的其它成分、和/或待用其治疗的哺乳动物是化学和/或毒理学相容的。

药学上可接受的盐包括例如这样的盐，其保留指定化合物的相应游离酸或碱的生物有效性，并且不是生物学或其它方面不期望的。药学上可接受的盐的实例包括通过本公开内容的化合物与无机酸或有机酸或无机碱的反应制备的那些盐，此类盐包括但不限于硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟乙酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐和扁桃酸盐。由于本公开内容的单一化合物可以包括多于一个酸性或碱性部分，因此本公开内容的化合物可以在单一化合物中包括单盐、二盐或三盐。

本公开内容的前药指这样的化合物，其可以在生理条件下或通过溶剂分解转换为指定化合物或此类化合物的盐。本公开内容的化合物和/或组合物可以通过各种合适的途径进行施用。合适的途径包括经口、肠胃外（包括皮下、肌内、静脉内、动脉内、皮内、鞘内和硬膜外）、经皮、直肠、鼻、局部（包括含服和舌下）、阴道、腹膜内、肺内和鼻内。应了解，所使用的途径可以随着例如接受者的状况而变。当化合物经口施用时，它可以与药学上可接受的载体或赋形剂一起配制为丸剂、胶囊、片剂等。当化合物肠胃外施用时，它可以与药学上可接受的肠胃外溶媒一起且以单位剂量可注射形式配制，如下文详述的。

为了使用本公开内容的化合物用于哺乳动物包括人的治疗性治疗，它们可以根据标准药学实践配制为药物组合物。本发明的药物组合物以与良好医学实践一致的方式（即量、浓度、时间表、过程、溶媒和施用途径）进行配制、给药和施用。在该上下文中考虑的因素包括待治疗的病症、待治疗的哺乳动物、个别患者的临床状况、病症的原因、试剂的递送部位、施用方法、施用时间表和医学从业者已知的其它因素。待施用的化合物的治疗有效量由此类考虑因素、以及待施用的化合物的性质和量来控制，并且反之亦然。本公开内容的化合物可以配制成药物剂型，以提供易于控制的药物剂量，并且使得患者能够依从开出的方案。

本公开内容的化合物的药物制剂可被制备用于各种施用途径和类型。例如，本发明的两种或更多种化合物可以任选地与冻干制剂、研磨粉末或水溶液形式的药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂混合。可以通过在环境温度下、在适当的pH下且以所需纯度，与生理学上可接受的载体（即，在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒的载体）混合来进行配制。可以使用常规的溶解和混合程序来制备制剂。例如，散装原料药（即，本公开内容的化合物或该化合物的稳定形式）可以在一种或多种赋形剂的存在下溶解于合适的溶剂中。

所使用的载体、稀释剂或赋形剂将取决于应用本公开内容的化合物的手段和目的。溶剂一般可以基于由本领域技术人员公认为施用于哺乳动物安全（GRAS）的溶剂来选择。一般而言，安全溶剂是无毒的水性溶剂，例如水以及在水中可溶或混溶的其它无毒溶剂。合适的水性溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇（例如PEG 400、PEG 300）等及其混合物。可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸（argirune）或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物（例如Zn-蛋白络合物）；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇（PEG）。制剂还可以包括一种或多种稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、色素、甜味剂、芳香剂、调味剂和其它已知的添加剂，以提供药物（即，本公开内容的化合物或其药物组合物）的精致呈现、或有助于药物产品（即，药剂）的制造。活性药物成分也可以被包埋在例如通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，所述微胶囊例如分别在胶体药物递送系统（例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳状液、纳米颗粒和纳米胶囊）或粗乳状液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington's PharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编辑（1980）中。“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其可用于将药物递送至哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。

可以制备本公开内容发明的化合物的缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有本公开内容的化合物的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质为成形制品，例如薄膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶（例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯或聚(乙烯醇)）、聚丙交酯、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物。

本公开内容的药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射水性或油状悬浮液。这种悬浮液可以根据已知技术，使用上文已提到的那些合适的分散剂或湿润剂和助悬剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液或制备为冻干粉末。在可以采用的可接受的溶媒和溶剂中有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发性油可以照常规用作溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可以同样地用于注射剂的制备中。

适合于肠胃外施用的本公开内容的药物组合物包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及致使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括助悬剂和增稠剂。

本发明的组合物也可以以适合于以下的形式配制：经口使用（例如，作为片剂、锭剂、硬或软胶囊、水性或油性悬浮液、乳状液、可分散的粉末或颗粒、糖浆剂或酏剂）、局部使用（例如，作为乳膏、软膏、凝胶、或者水性或油性溶液或悬浮液）、通过吸入施用（例如，作为细分粉末或液体气溶胶）、通过吹入施用（例如，作为细分粉末）。

用于片剂制剂的合适的药学上可接受的赋形剂包括例如惰性稀释剂，例如乳糖、碳酸钠、磷酸钙或碳酸钙，制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石；防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯，以及抗氧化剂，例如抗坏血酸。片剂制剂可以是不包被的或包被的，以改变其崩解以及活性成分在胃肠道内的后续吸收，或在任一情况下，使用本领域众所周知的常规包被试剂和程序来改善其稳定性和/或外观。

用于经口使用的组合物可以以硬明胶胶囊的形式配制，其中活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者配制为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

水性悬浮液一般含有以细粉形式的活性成分，连同一种或多种助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂，例如卵磷脂或环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物（例如聚氧乙烯硬脂酸酯）、或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物（例如十七烷基乙烯氧基鲸蜡醇（heptadecaethyleneoxycetanol））、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物（例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯）、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物（例如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯）。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂（例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯）、抗氧化剂（例如抗坏血酸）、着色剂、调味剂和/或甜味剂（例如蔗糖、糖精或阿斯巴甜）。

油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮于植物油（例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油）、或矿物油（例如液体石蜡）中进行配制。油性悬浮液还可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂如上文阐述的那些以及调味剂，以提供适口的经口制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸进行防腐。

适合于通过添加水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒一般含有活性成分，连同分散剂或湿润剂、助悬剂和一种或多种防腐剂。合适的分散剂或湿润剂和助悬剂由上文已经提到的那些例示。也可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。

本公开内容的药物组合物也可以是水包油乳状液的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡或这些的任何混合物。合适的乳化剂可以是例如天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂、衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯（例如脱水山梨糖醇单油酸酯），以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳状液还可以含有甜味剂、调味剂和防腐剂。

糖浆剂和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、阿斯巴甜或蔗糖进行配制，并且还可以含有缓和剂、防腐剂、调味剂和/或着色剂。

栓剂制剂可以通过将活性成分与合适的非刺激性赋形剂混合进行制备，所述赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，并且因此将在直肠中融化以释放药物。合适的赋形剂包括例如可可脂和聚乙二醇。适合于阴道施用的制剂可以呈现为子宫托、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂，除活性成分之外，其还含有如本领域已知为适当的此类载体。

局部制剂例如乳膏、软膏、凝胶和水性或油性溶液或悬浮液，一般可以通过使用本领域众所周知的常规程序，将活性成分与常规、局部可接受的溶媒或稀释剂一起配制来获得。

用于经皮施用的组合物可以是本领域普通技术人员众所周知的那些经皮皮肤贴剂的形式。

用于通过吹入施用的组合物可以是细分粉末的形式，其含有平均直径例如为30 μm或小得多的颗粒，所述粉末本身包含单独、或者用一种或多种生理上可接受的载体例如乳糖稀释的活性成分。用于吹入的粉末然后方便地保留在含有例如1至50 mg活性成分的胶囊中，用于与例如用于吹入已知试剂色甘酸钠的涡轮吸入器装置一起使用。

用于通过吸入施用的组合物可以是常规的加压气溶胶的形式，其被布置为分配作为含有细分固体或液滴的气溶胶的活性成分。可以使用常规的气溶胶推进剂，例如挥发性氟化烃或烃类，并且气溶胶装置可以方便地布置以分配计量数量的活性成分。

取决于用于施用药物的方法，可以以各种方式包装用于应用的药物组合物（或制剂）。例如，用于分配的制品可以包括已放置适当形式的药物制剂的容器。合适的容器是本领域技术人员众所周知的，并且包括材料例如瓶（塑料和玻璃）、小药囊、安瓿、塑料袋、金属圆筒等等。容器还可以包括防误服组件（tamper-proof assemblage），以防止对包装内容物的不慎接近。另外，容器具有在其上设置的描述容器内容物的标签。标签还可能包括适当的警告。制剂也可以包装在单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以贮存于冷冻干燥（冻干）条件下，仅需要在临使用前添加无菌液体载体例如水用于注射。临时注射溶液和悬浮液由先前描述种类的无菌粉末、颗粒和片剂进行制备。优选的单位剂量制剂是含有活性成分的每日剂量或单位每日亚剂量（如本文上文叙述的）、或其适当部分的那些。

所公开的化合物还可以提供兽药组合物，其包含至少一种如上文定义的活性成分连同因此的兽药载体。兽药载体是可用于施用组合物的材料，并且可以是固体、液体或气体材料，其在其它方面是惰性的或是兽药领域中可接受的，并且与活性成分相容。这些兽药组合物可以肠胃外、经口或通过任何其它所需途径进行施用。

与一种或多种赋形剂组合以产生单一剂型的本公开内容的化合物的量，必然取决于治疗的受试者、病症或病况的严重程度、施用速率、化合物的处置以及处方医师的判断而变。在一些实施方案中，本发明的化合物或化合物的混合物的施用在约0.001 mg/kg体重至约60 mg/kg体重/天之间发生。在另一个实施方案中，施用以0.5 mg/kg体重至约40 mg/kg体重/天之间的量发生。在一些情况下，低于上述范围的下限的剂量水平可能是绰绰有余的，而在其它情况下，仍可以采用更大的剂量，而不引起任何有害副作用，条件是首先将此类更大剂量分成几个小剂量，用于全天的施用。

在另一个方面，提供了制造物品或试剂盒，其含有可用于本文所述的治疗的材料。在一个实施方案中，试剂盒包括包含本公开内容的化合物的容器。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可以由各种材料例如玻璃或塑料形成。容器可以容纳对于治疗有效的本发明的化合物或其制剂，并且可以具有无菌的进入口。试剂盒可以进一步包括在容器上或与容器相关的标签或包装插页。包装插页可以含有照例包括在治疗产品的商业包装中的说明书，例如关于适应证、用法、剂量、施用、禁忌和/或涉及此类治疗产品使用的警告的信息。

试剂盒可以包括本公开内容的组合物和第二药物制剂。试剂盒还可以包括用于容纳分开的组合物的容器，例如分开的瓶或分开的箔包封，然而，分开的组合物也可以容纳在单个未分开的容器内。试剂盒可包括关于分开的组分的施用的指导。当分开的组分优选以不同的剂型（例如经口和肠胃外）施用，以不同的剂量间隔施用时，或者当处方医师需要滴定组合的个别组分时，试剂盒形式是特别有利的。

下述实施例示出了本发明的实施方案，但不应该视为限制本发明的范围。

实施例

实施例1

使许多小分子与PC4蛋白一起温育，并且评价DNA结合。仅鉴定为31的小分子（AG-1031）显示PC4-DNA结合的显著干扰（参见图5）。

实施例2

大鼠胶质母细胞瘤细胞系C6（A）和人非小细胞肺癌细胞H841（B）在适当的培养基中生长，并且用不同浓度的药物候选物AG-1031（P）和AG-1503（#3）进行处理。基于与以μM计的本发明所选小分子的浓度相比的活细胞数目，来计算细胞生长速率（参见图6A和6B）。

实施例3

在将A549接种到SHO小鼠后，每隔一天经由IP注射用AG-1031（20-40µg/小鼠）治疗小鼠，并且跟踪长达28天。结果显示于图7中。

实施例4

经过28天，在用AG-1031处理NSCLC细胞期间，测量了肿瘤体积。结果显示AG-1031抑制NSCLC肿瘤细胞的生长（参见图8）。

实施例5

在肿瘤细胞注射前两周，将AG-1031注射到小鼠内（参见图9）。与对照组相比较，AG-1031治疗组的肿瘤体积从302.9 mm

实施例6

在AG-1031施用于异种移植小鼠后，测量肿瘤体积35天。如图11A和11B中所示，AG-1031基本上降低了治疗小鼠中的肿瘤体积。

实施例7

图12显示了与未治疗的对照组相比，在AG-1031疫苗接种的小鼠中的实际肿瘤大小，如图解测量的。

实施例8

在A549细胞接种到SHO小鼠之前，每周一次（X2）用AG-1031 40ug/小鼠进行IP注射。评价AG-1031对A549异种移植小鼠中的肿瘤生长的作用。结果显示于图13中。

实施例9

旷场研究显示了，已用AG-1503治疗的荷有神经胶质瘤的大鼠的焦虑和活动改善（参见图14A和14B）。

实施例10

AG-1031和AG-1503均显示了改善新物体识别能力的功效（参见图15）。

实施例11

电生理学测试显示了研究和记忆能力的改善（参见图16A和16B）。

实施例12

（A）肿瘤组织和（B）海马组织中的细胞凋亡相关蛋白的蛋白质印迹（参见图17A和17B）。

实施例13

在NSCLC-A549和NSCLC-14299细胞上的新化合物的筛选鉴定了AG-1601（参见图18A和18B）。

实施例14

在NSCLC-H841细胞（图19A）和神经胶质瘤C6细胞（图19B）上的新化合物的筛选鉴定了AG-1601和AG-1610（作为AG-1601的较低活性变体）。

实施例15

AG-1601是小分子，并且以5mg/ml溶解于DMSO中，且贮存于4C下，并且在使用前用PBS稀释至1 mg/mL的最终浓度。碱性TEVP缓冲液含有10 mM Tris·HCl（pH 7.5）、50mMNaF-50、5mM EDTA、5mM EGTA、1 mM苯甲脒、1 mM PMSF、2 µg/ml亮抑酶肽和以2 µg/ml的胃酶抑素。

成年雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠（称重200-250 g）由Laboratory AnimalCenter，Academy of Military Medical Science of People’s Liberation Army（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心）提供。大鼠在Medical School of NankaiUniversity（南开大学医学院）中的受控条件下（25 ± 2°C；12小时光/暗周期）圈养，伴随对食物和水的自由接近，并且在实验前适应环境一周。所有实验程序都由"NankaiUniversity（南开大学）"批准，并且根据由美国国立卫生研究院（National Institutes ofHealth）出版的实验动物护理和使用指南（Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals）的指导原则执行，并且努力将用于实验的动物数目和痛苦降到最低。

将Aβ1–42（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA；）以5μg/μl的浓度溶解于双蒸水中，并且在手术前在37°C下温育1周。将大鼠随机分成四组，即假手术（n=8）、假手术 + AG-1601（n=8）、Aβ1–42（n=8）和Aβ1–42 + AG-1601（n=8）。阿尔茨海默氏病大鼠模型通过Aβ1–42聚集物的侧脑室内（i.c.v.）注射来建立。用戊巴比妥钠（50mg/kg）的腹膜内注射将动物麻醉，并且置于立体定位仪（Narishige，日本）中。打开大鼠的头皮，并且按照以下坐标在颅骨的两侧上钻两个小孔：前囟后0.8 mm，矢状缝侧±1.4 mm，脑表面下4.0mm。通过微量注射器将Aβ1–42（2.0 μl/侧）从两侧注射到侧脑室内。在注射5分钟后拔出针，以确保聚集物完全输注。假手术组中的大鼠经历相同的操作过程，但注射相同体积的双蒸水代替Aβ1–42。在手术后，所有大鼠都在后肢肌肉中用青霉素（100,000 U）进行注射，以预防感染。在术后恢复一周后每天，假手术 + AG-1601和Aβ1–42 + AG-1601组的动物用AG-1601（1mg/kg）进行静脉内注射，而对于其它组应用相同体积的溶媒，共14天。

进行了旷场实验，以评估运动活动和探索行为。该实验如先前所述进行，伴随少许修改（Sugita等人，2015）。旷场实验由圆形仪器（直径80 cm，高30 cm）组成。圆形仪器分成中心区（活动场所中部直径30 cm）和同心外圈区。将大鼠个别地置于仪器的外圈中，并且允许自由探索5分钟。每只大鼠的路径由相机驱动的跟踪器系统（Ethovision2.0，Noldus，Wagenigen，荷兰）进行跟踪。分析了在测试期间进入中心区内的次数、总距离和行进速度。

通过使用在旷场实验后进行的NOR实验，来评估动物的短期和长期记忆功能。如先前所述（Sugita等人，2015），在用于旷场实验的同一活动场所中执行实验。该实验包括四个不同阶段：习惯阶段、训练阶段、短期记忆实验阶段和长期记忆实验阶段。旷场实验因此用作本研究中的习惯期。在旷场探索后二十四小时，将两个相同的塑料瓶（物体A1和A2）置于旷场的直径上。物体的间隔与彼此和墙壁等距。在训练阶段，允许大鼠自由探索活动场所5分钟。在1小时后，开始短期记忆实验。在熟悉物体之一替换为新物体B（三角形立方体）的存在下，大鼠探索场5分钟。通过TB/（TA+TB）（TA：探索熟悉物体A所花费的时间；TB：探索新物体B所花费的时间）的百分比，来计算识别指数。在训练后24小时给予长期记忆实验，允许大鼠在物体A和第三新物体C（金属管）的存在下探索活动场所5分钟，并且识别指数与短期记忆实验中相同地进行评估。训练阶段中50%的识别指数指示机会水平，并且实验阶段的较高识别指数反映了较好的物体识别记忆。本实验中使用的所有物体都应该太重，以致于大鼠无法移动，并且它们在每次试验之间用70%的乙醇溶液进行清洁。动物的行为通过摄像机进行捕获。

在30%氨基甲酸酯（0.4g/kg Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）的腹膜内注射后，将大鼠置于立体定位仪中。根据我们以前的方案（Gao等人，2015），在头皮上切开适当的切口以暴露头骨，并且钻一个小孔。将双极刺激电极置于Schaffer侧支途径中（前囟后4.2mm，侧3.8 mm，硬脑膜下2-3.5 mm），并且在CA1区域（前囟后3.5 mm，侧2.5 mm，硬脑膜下1.5-2 mm）的同侧植入单极记录电极。优化两个电极的深度，以获取适当的诱发电位幅度。随后，将一种单一刺激强度从0.1–1mA逐渐增加，以确定最大的场兴奋性突触后电位（fEPSP）斜率，并且选择诱发最大fEPSP斜率的70%的刺激强度，以在θ爆裂刺激（TBS）前后诱发fEPSP。每30秒给予一次测试刺激，以记录20分钟作为基线。然后通过TBS诱导LTP（以200Hz的12次脉冲的30次训练），并且每60秒记录一次，共60分钟。此后，进行低频刺激（LFS，1Hz，共15分钟）以诱导去强化（DEP），并且相同的单脉冲记录每60秒继续一次，共60分钟。将LTP的最后20分钟的fEPSP斜率取平均值，并且表示为DEP的基线。

根据先前描述的方案执行的Golgi-Cox染色方法用于确定在这项研究中的CA1锥体细胞的顶端树突棘的密度（Zhang等人，2016）。简言之，从麻醉的大鼠中取出新鲜的脑组织样品（n=3/组），并且切割成含有整个海马的冠状块。然后，将组织立即置于Golgi-Cox溶液（5%重铬酸钾、5%铬酸钾和5%氯化汞溶液）中，并且在室温下避光放置14天。同时每48小时更换Golgi-Cox溶液，共3次。此后，通过振动切片机（Leica-VT1000S，德国）将脑组织切片。将切片（厚度150 μm）转移到6%的碳酸钠溶液内20分钟。其后，将它们在蒸馏水中洗涤，并且用系列稀释的乙醇（70%、90%、100%）脱水，并且最后在二甲苯溶液中保持20分钟。最后，使用树脂介质用盖玻片覆盖切片。允许载玻片在室温下干燥，然后在显微镜（100 ×）下观察，用于细胞形态学分析。分析每只动物的海马CA1区域中的六个神经元。对于每只动物计算每10μm树突长度的平均树突棘密度。

随机选择每组的三只大鼠来处死，并且其海马组织立即在0℃下取出且贮存于负80℃下。对于亚细胞分级分离，使用100至200-mg重量的大鼠海马组织。该程序已得到描述（Yang等人，2017）。将组织在含有320 mM蔗糖的500 μl TEVP缓冲液中匀浆化30秒，并且获得匀浆物。将匀浆物（H）在4°C下以900 × g离心10分钟，并且将上清液（S1）在4°C下以10000 × g离心20分钟，以获得胞质/轻膜级分（S2）和粗突触体级分团块（P2）。将团块重悬浮于含有35.6 mM蔗糖溶液的TEVP缓冲液中，然后在4°C下以25,000 × g离心20分钟。将上清液贮存于负80°C下，并且称为突触囊泡级分（LS1）。将团块即突触质膜（LP1）重悬浮于含有1% Triton X-100的TEVP缓冲液中，并且在4℃下以330,000 × g离心30分钟。将称为Triton X-100可溶级分（TSF）的上清液贮存于负80°C下。将最后的团块即Triton X-100不溶性级分（TIF）在含有1% SDS的TEVP缓冲液中进行匀浆化。

通过BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime Biotechnology，中国）测量每种组分的浓度。组分最后用4×上样缓冲液在100°C下煮沸15分钟，并且贮存于负80°C下用于蛋白质印迹测定。

分析了总匀浆物（H）和突触体级分。经由10%或13% SDS-PAGE凝胶分离来自每种样品的等量的20 μg，随后转移到PVDF膜（Millipore，USA）上。将膜用5%脱脂奶粉在室温下封闭1小时，然后与一抗（抗突触素，1:1000，Abcam；抗NR 2A，1:2000，Abcam，抗NR 2B，1:2000，Abcam；抗PSD-95，1:2000，Abcam；抗CREB，1:2000，Abcam；抗CREB磷酸化，1:2000，Abcam；抗SIRT1，1:2000，Santa Cruz Biotechnology；抗β-肌动蛋白，1:5000，Santa CruzBiotechnology）一起在4°C下温育过夜。然后使膜与辣根过氧化物酶缀合的二抗（Promega）一起在室温下温育1小时。在用TBST缓冲液洗涤后，用HRP底物（Millipore，USA）显现信号，并且用化学发光试剂盒（Tanon 5500，Tanon Science & Technology，中国）进行检测。蛋白质条带的灰度值通过NIH Image J程序进行定量。

所有数据都表示为平均值 ± SEM（标准误平均值）。统计分析通过SPSS 19软件（Chicago，IL，美国）进行处理。应用具有LSD事后检验的单因素方差分析（ANOVA），以比较组间的数据。统计学显著性设定为

实施例16

确定了AG-1061对Aβ1–42诱导的认知损害的作用。在旷场实验期间观察大鼠的运动活动。与假手术组相比，Aβ1–42组显示出进入中心区内的次数明显减少（

NOR实验基于啮齿类动物探索新物体的自发趋势（Ennaceur和Delacour，1989）。短期和长期记忆能力两者均通过该实验进行检测。在训练阶段，四组大鼠花费可比较的时间探索两个相同的物体，并且每组的识别指数为约50%（

为了确定AG-1061对Aβ1–42诱导的LTP和DEP压制的作用，将海马突触分级分离，然后通过蛋白质印迹测定进行评价。通过NR2A、NR2B、PSD-95和SYP探测突触位置和突触外位置。SYP最终在TSF级分中富集。与SYP形成对比，NR2A、NR2B和PSD-95的表达在含有突触后致密区（PSD）的TIF级分中富集。发现Aβ1-42注射降低H（

海马中的突触丧失是AD的主要标志之一。确定AG-1061是否在海马中保护不受Aβ1–42诱导的突触毒性。在海马切片中执行Golgi-Cox染色，以显现且定量树突棘。相对于假手术组，Aβ1-42组大鼠显示出CA1区域中的树突棘密度中的显著减少（

为了进一步调查AG-1061阻止Aβ1–42诱导的认知损害的可能分子机制基础，确定了海马中的SIRT1和p-CREB水平。与假手术组相比较，SIRT1蛋白水平在Aβ1–42组中显著减少（

确定了AG-1061对AD的大鼠模型中Aβ1–42诱导的认知损害的作用和可能机制。发现Aβ1–42注射损害大鼠中的学习和记忆以及海马突触可塑性，并且AG-1061通过增加由Aβ1–42降低的SIRT1和p-CREB的水平来挽救损害。AD患者中的认知下降与升高的脑Aβ1-42水平相关。在侧脑室内注射Aβ1–42后，啮齿类动物在几个行为测试中显示了行为障碍，包括学习和记忆损害（Zhang等人，2015）。在本研究中，采用旷场实验和新物体识别实验，以检查AG-1061对Aβ1–42大鼠中的认知功能障碍的有益作用。由于大多数认知行为测试都取决于一般的运动活动，因此执行旷场实验。在该实验中，当暴露于新环境时，动物显示了自发运动活动和探索行为。结果证实了，AG-1061改善由Aβ1–42导致的探索行为障碍。另外，该实验中的运动活动在任何组之间并无不同。已显示了Aβ暴露的大鼠显示出海马依赖性学习和记忆缺陷（Wang等人，2016）。NOR实验是研究AD大鼠模型的认知缺陷的最广泛使用的测试之一。这些结果证实了，Aβ1–42引起NOR实验性能中的短期以及长期学习和记忆缺陷，而AG-1061治疗可以显著逆转这些认知改变。此外，认知损害并不归于大鼠的运动活动的差异。突触可塑性可以被视为支持学习和记忆功能的机制。大量证据指示了，在AD患者以及AD模型动物的大脑中通常发现突触可塑性缺陷（Hémar和Mulle，2011；Ji和Strittmatter，2013）。LTP是海马中的突触可塑性的实验形式，被视为学习和记忆的细胞机制。在LTP之后诱导的DEP是逆转LTP过程中加强的突触强度的现象，并且涉及海马的新信息贮存（Qi等人，2013；Wagner和Alger，2015）。这项研究显示了，Aβ1–42显著损害海马中的LTP和DEP两者，并且与先前研究一致（Hu等人，2014；Wang等人，2016）。AG-1061改善了大鼠中由Aβ1-42诱导的LTP和DEP损害。

许多研究已集中于Aβ对N-甲基D-天冬氨酸受体（NMDAR）的神经毒性作用，因为NMDA受体依赖性可塑性很可能是突触记忆机制的基础（Cullen等人，1997；Kim等人，2001）。NMDAR由兴奋性突触的突触后膜处的突触支架蛋白突触后致密区蛋白95（PSD-95）进行稳定。使用亚细胞分级分离方法从大鼠海马中分离纯化的兴奋性PSD，发现NR2A、NR2B和PSD-95的水平通过Aβ1–42在总匀浆物（H）和TIF级分中降低，这可能导致对突触可塑性的明显抑制作用。位于突触囊泡膜上的突触素（SYP）与神经递质的释放有关（Chi等人，2003）。这项研究中的Aβ1–42大鼠的H和TSF中的SYP减少与先前研究一致（Ghumatkar等人，2018）。然而，突触前和突触后蛋白的水平降低通过AG-1061升高。结果得出，AG-1061上调了这些突触蛋白，以增强有助于学习和记忆的LTP和DEP。另外，突触丧失是AD海马中的神经病理学标志，其可能是学习和记忆缺陷的基础（Scheff等人，2006）。Aβ的沉积通过干扰突触信号传导途径并破坏树突棘而导致认知缺陷（Pozueta等人，2013）。证据还指示了，保护突触的形态和功能可以改善AD的动物模型中观察到的认知损害（Mcclean和Hölscher，2014；Wei等人，2015）。在这项研究中，树突棘的密度在Aβ诱导的大鼠中显著降低；然而，这种丧失通过AG-1061治疗得到减弱，这支持了突触可塑性和认知障碍的改善。另外，SYP和PSD-95（分别为突触前和突触后标记物）的增强水平也指示了AG-1061阻止Aβ1–42诱导的突触丧失。进一步评价了调控认知功能的SIRT1和CREB的表达。发现Aβ1–42降低海马中的SIRT1表达水平，而AG-1061治疗逆转了这种压制效果。SIRT1对AD中的学习和记忆功能的调节具有积极作用。Julien等人提供了第一个直接证据，即在AD患者的脑中的海马CA1和CA3区域中观察到减少的SIRT1转录物（Julien等人，2009）。另外，在R Wang等人的研究中观察到类似的结果，其显示了Aβ1–42压制脑中的海马SIRT1表达水平，并且导致大鼠的突触可塑性和空间学习记忆损害（Wang等人，2016）。此外，起因于白藜芦醇的学习和记忆形成与LTP诱导的增强效果在SIRT1突变小鼠中被阻断（Zhao等人，2013）。总的来说，这些研究指示了SIRT1与学习和记忆功能之间的正相关。结果显示了AG-1061阻止SIRT1的降低，以改善通过Aβ1–42诱导的突触可塑性和认知缺陷。最近的研究已证实了，SIRT1调控CREB（学习和记忆的转录调节物和介质）的翻译后修饰，以维持突触可塑性和认知功能（Gao等人，2010；Zhao等人，2013；Herskovits和Guarente，2014）。证实了在培养的海马神经元中，CREB激活在Aβ的暴露中是减少的（Matsuzaki等人，2006）。因此，在我们的研究中，在大鼠的海马中分析了CREB和p-CREB的表达。这些结果显示了，Aβ1–42抑制CREB和p-CREB的表达，并且AG-1061治疗挽救了降低。这些结果指示了，CREB激活的下调归于Aβ1–42毒性，其调控大鼠的突触可塑性和认知缺陷。同时，CREB激活的恢复阻止了由Aβ1–42诱导的损害。结果也与先前研究一致，即p-CREB的减少伴随着SIRT1的表达下调。在海马中，SIRT1通过与转录因子Yin Yang 1（YY1）协作，来压制微小RNA-134的表达，其导致CREB和脑源性神经营养因子（BDNF）的过表达，从而调控突触可塑性和记忆形成（Gao等人，2010）。此外，通过白藜芦醇的SIRT1和p-CREB水平上调可以改善AD大鼠的学习和记忆功能（Wang等人，2016）。总之，AG-1061的神经保护效果可归于SIRT1和p-CREB的表达升高。

这些发现指示了，Aβ1-42损害在行为、体内海马CA1区域中的突触可塑性和树突棘密度方面显示的学习和记忆。AG-1061通过增加由Aβ1–42降低的SIRT1和p-CREB表达水平来逆转缺陷，这可能阐明了AG-1061对学习和记忆以及突触可塑性的神经保护效果。

实施例17 AG-1601和阿尔茨海默氏病

AG1601改善Aβ42诱导的认知损害。确定了AG-1601在Aβ

NOR实验基于啮齿类动物探索新物体的自发趋势。在短期记忆实验中，识别指数在假手术组中显著高于50%机会水平。然而，Aβ42组动物在短期记忆实验中未能将新物体与熟悉物体区分开，并且识别指数显著低于假手术组（图20B，P<0.01）。此外，与Aβ42组相比，AG1601治疗的组显示了识别指数的显著增加（图20C，P<0.05）。在长期记忆实验中观察到相似的效果（图20D，P<0.05）。

AG1601逆转了Aβ42诱导的动物中的海马LTP和DEP的压制。体内电生理学用于记录中，以评价动物的CA1区域中的海马突触可塑性，如图21A中所示。基于最后20分钟的记录数据，与假手术组相比较，LTP（长时程增强）的场兴奋性突触后电位（fEPSP）斜率在Aβ

AG1601增强了Ab42诱导的动物中的海马突触蛋白的表达。为了调查AG1601如何影响Aβ

AG1601上调SIRT1和磷酸化CREB的水平。SIRT1在成年脑中广泛表达，并且参与许多复杂的生理过程，包括神经发生和神经保护。已报道SIRT1对于突触可塑性和认知功能是必要的。SIRT1的过表达可以保护不受AD。CREB（cAMP应答元件结合蛋白）是众所周知的核转录因子，并且CREB磷酸化（p-CREB）在突触可塑性中起关键作用。长时程增强（LTP）是一种突触强化现象，被认为是学习和记忆的细胞机制，CREB敲除小鼠显示了在LTP和长期记忆两者的缺陷，而LTP和记忆通过表达CREB的活性形式得到增强。许多研究已报道，AD患者的记忆功能受损与CREB激活的降低密切相关。

AG-1601还能够阻止AD大鼠模型的CA1区域中的树突棘密度中Aβ

实施例18细胞培养和细胞增殖测定

U251、SF539、SF295的人神经胶质瘤细胞系得自NCI/DTP，而U87得自ATCC。U251、SF539和SF295细胞在RPMI（Gibco）培养基中生长；U87细胞在EMEM培养基（ATCC）中生长，所有细胞培养基都含有10% FBS和100单位/ml的青霉素-链霉素，并且使细胞在37°C/5%CO

实施例19 GBM异种移植小鼠模型建立和体内功效研究

雌性SHO小鼠（Crl:SHO-

实施例20

细胞用指示含量的AG-1601处理48小时，然后随后为细胞活力测定的执行。AG-1601在大鼠细胞中的功效（参见图24A和B），AG-1601在人神经胶质瘤细胞中的功效（参见图25A和25B），不同分批的AG6601在C6和U251细胞中的功效（参见图26A和26B），AG-1601在C6和U87细胞中的功效（参见图27A和27B），AG-1601、TMZ和卡莫斯汀在U251细胞中的功效（参见图28A和28B），以及AG-1601、TMZ和卡莫斯汀在U87细胞中的功效（参见图29A和29B）。与TMZ和卡莫斯汀相比较，AG1601显示在体外对神经胶质瘤细胞更好的功效。在用DMSO、TMZ、AG-1601和TMZ加上AG-1601处理后，在T98G细胞和U251细胞中测定细胞活力（图30）。

如测定的，AG-1601在U251细胞（参见图31A和31B）和U87细胞（参见图32A和32B）中加强了TMZ的效果。

实施例21

AG1601显示了对SF295异种移植肿瘤小鼠模型的功效（参见图33A-D）。

实施例22

AG1601显示了对C6异种移植肿瘤大鼠模型的功效（参见图34A（治疗）和图34B（对照））。

实施例23

用10 µl的DMEM培养基（假手术和假手术(small)+AG-1601）、以及10 µl的1x10

假手术和假手术+AG1601组中的体重在2周期间增加，而无明显差异。神经胶质瘤和神经胶质瘤+AG1601组中的体重在2周期间减少，并且在它们之间发现显著差异（参见图35、36、37、38A、38B和39）。如图33-35中所示的编号1604-1615是动物编号。

将神经胶质瘤和神经胶质瘤+AG1601组的肿瘤与脑分开并称重。与神经胶质瘤组相比，体积和重量在神经胶质瘤+AG1601组中相应地降低。这些结果指示了AG1601可以压制神经胶质瘤生长。

用AG1601治疗的神经胶质瘤组中的大鼠存活时间长于无治疗的神经胶质瘤组。

假手术和假手术+AG1601组中的体重在2周期间增加，而无明显差异。神经胶质瘤和神经胶质瘤+AG1601组中的体重在2周期间减少，并且在它们之间发现显著差异。将神经胶质瘤和神经胶质瘤+AG1601组的肿瘤与脑分开并称重。显示了与神经胶质瘤组相比，体积和重量在神经胶质瘤+AG1601组中相应地降低，提示了AG1601可以压制神经胶质瘤生长。用AG1601治疗的大鼠的存活时间长于无治疗的。

考虑到本文公开的本发明的说明书和实践，本发明的其它实施方案和用途对于本领域技术人员将是显而易见的。本文引用的所有参考文献，包括所有出版物、美国专利和外国专利以及专利申请，都明确地且整体地引入作为参考。每当使用时，术语包含预期包括术语由……组成和基本上由……组成。此外，术语包含、包括和含有并不预期是限制性的。预期说明书和实施例仅视为示例性的，而本发明的真实范围和精神由下述权利要求指示。