一种将鸡卵黄免疫球蛋白制备成润喉保健产品的应用

摘要

本发明公开了一种将鸡卵黄免疫球蛋白制备成润喉保健产品的应用，每千克润喉保健产品中鸡卵黄免疫球蛋白的含量不小于1000mg，所述鸡卵黄免疫球蛋白中含有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌三种细菌的特异性抗体，且特异性抗体效价≥1:8。本发明将具有生物学抗体效价的鸡卵黄免疫球蛋白作为核心成分制成口腔润喉糖含片（药品或保健食品），能够有效抑制咽喉部的常见细菌，且不产生任何对软组织损伤的副作用，缓解咽喉不适的效果非常明显，填补了将鸡卵黄抗体应用于保健产品的技术空白，为以后鸡卵黄抗体的应用提供了新的发展方向。

说明书

技术领域

本发明涉及保健品技术领域，具体是指免疫球蛋白一种将鸡卵黄免疫球蛋白制备成润喉保健产品的应用。

背景技术

卵黄免疫球蛋白广泛存在于各种禽类的卵黄中，对产蛋母鸡注射抗原进行免疫接种，母鸡即可产生有针对性的特异性抗体，并可垂直传递保存于鸡卵黄中。通过提取鸡卵黄中的免疫球蛋白，即可获得特异性鸡卵黄抗体，可用于相应疾病的预防和治疗。

鸡卵黄免疫球蛋白是一种高产、优质的多克隆免疫球蛋白，而且鸡大规模工业化饲养成本低，经济方便，同时制备IgY的工艺相对简单。卵黄免疫球蛋白的研究和应用已有数十年的历史，广泛应用于农林畜牧业(如饲料添加、兽药)、诊断试剂(多抗)和药品中。但目前对鸡卵黄免疫球蛋白的应用还局限于疾病的预防，其应用潜力还有待进一步开发，尤其是在将其作为保健产品的应用方面，还未有相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡卵黄免疫球蛋白的在新领域方面的具体应用，及其具体的应用方法。

本发明通过下述技术方案实现：一种将鸡卵黄免疫球蛋白制备成润喉保健产品的应用，每千克润喉保健产品中鸡卵黄免疫球蛋白的含量不小于1000mg，所述鸡卵黄免疫球蛋白中含有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌三种细菌的特异性抗体，且抗体效价≥1:8。

本技术方案的工作原理为，人们感到咽喉不适，60％以上是由于咽喉部的条件致病菌引起的，最常见条件致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌，这三种细菌平常口腔中存在但不大量滋生，在人体免疫力正常时与这些细菌共生，当人体抵抗力下降时，这些细菌则大量繁殖滋生引起局部炎症感染，导致人体的咽喉不适。

经细菌性抗原(金葡球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌)免疫后的产蛋母鸡，其血清中会产生相应的抗体，这些抗体会垂直传递到鸡卵黄中，以卵黄免疫球蛋白的形式保存下来，这种鸡卵黄免疫球蛋白也称为鸡卵黄抗体(IgY)，可用于抑制人体口腔中的金葡球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌。

迄今为止尚无将卵黄免疫球蛋白应用于咽喉部常见细菌抑制和缓解咽喉不适中，原因主要有以下几点：(1)利用卵黄抗体的生物学活性作用于感染人体的病菌，跨越了生物制品和农林畜牧两个不同的行业，没有更多的科学工作者去关注和研究；(2)未经抗原免疫、或喂食抗生素的母鸡产下的鸡蛋中，针对咽喉部常见的金葡球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌的特异性卵黄抗体效价很低(一般检测不到)，难以发挥针对性抑菌作用；本发明利用三种混合的灭活细菌抗原免疫产蛋母鸡，收集其产下的鸡蛋，并通过检测特异性抗体进行筛选，保持产品中针对这三种常见细菌的特异性抗体效价≥1:8，使其具备了抑菌功能；(3)针对金葡球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌等鸡卵黄抗体效价的检测，目前并没有成熟的商业性检测试剂。本发明利用实验室开发的检测试剂进行特异性抗体检测，能够筛选出有抑菌功能的鸡卵黄免疫球蛋白，应用于口腔润喉保健时，能够有效抑制咽喉部的常见细菌(如金葡球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌等)，且不产生任何对软组织损伤的副作用，有效缓解咽喉不适。

为了更好地实现本发明，进一步地，制备成的保健产品为润喉糖含片，每片润喉糖的重量为0.4～0.8g，其中包含鸡卵黄免疫球蛋白的含量为0.5～1.5mg。

为了更好地实现本发明，进一步地，所述润喉糖的组分为，按重量份计，包括主料和辅料，

所述主料为：鸡卵黄免疫球蛋白0.5～2.5份；

所述辅料为：食用甜味剂700～900份，胖大海提取物50～100份，天然薄荷脑0.3～0.7份，维生素C原粉10～30份，卵磷脂50～200份。

为了更好地实现本发明，进一步地，所述润喉糖的组分为，按重量份计，鸡卵黄免疫球蛋白1.5份，食用甜味剂880份，胖大海提取物50份，天然薄荷脑0.5份，维生素C原粉20份，卵磷脂50份。

为了更好地实现本发明，进一步地，所述食用甜味剂为木糖醇。

为了更好地实现本发明，进一步地，将鸡卵黄免疫球蛋白制备成润喉糖的具体过程，包括以下步骤：

(1)制备抗原：分别培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌，然后以甲醛溶液进行灭活，最后将三种灭活细菌混合后作为抗原备用；

(2)免疫产蛋母鸡：选择100天龄无抗生素饲养的产蛋母鸡，取0.5ml步骤(1)制得的抗原与和弗氏完全佐剂按体积比1:1乳化混合后，使用其对每只产蛋母鸡进行初次免疫；初次免疫后，第14天进行第二次加强免疫，第30天进行第三次加强免疫，两次加强免疫使用的免疫试剂，均由0.5ml步骤(1)制得的抗原与弗氏不完全佐剂按体积比1:1乳化混合后制得；

(3)收集鸡蛋：收集初次免疫30天后至第三次加强免疫后300天之间，免疫母鸡产下的鸡蛋；

(4)取1000～5000枚收集的鸡蛋，分离蛋清和蛋黄，将蛋黄混合，并搅拌均匀后，得到蛋黄混合液；

(5)检测蛋黄混合液中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌这三种细菌的特异性抗体，抗体效价≥1:8的蛋黄混合液作为合格原料备用，抗体效价＜1:8的蛋黄混合液弃用；

(6)将检测合格的蛋黄混合液在60～65℃条件下，进行离心喷雾烘干，烘干至含水量不大于5％的鸡蛋黄粉，该鸡蛋黄粉包含卵磷脂和上述三种细菌的特异性鸡卵黄抗体；

(7)将制备得到的含水量不大于5％的鸡蛋黄粉与辅料混合搅拌，待混合均匀后，进行干法制粒；

(8)将所制得的颗粒在温度不高于50℃的条件下，进行烘干，最后将烘干的颗粒进行压片，制得润喉糖。

将鸡卵黄免疫球蛋白制备成润喉糖的具体过程中，最为困难的技术点在于，将满足标准的鸡卵黄制成鸡蛋黄粉的过程。众所周知，离心喷雾干燥的温度至少在100℃，但是如此高温会使鸡卵黄抗体失活，如果降低离心喷雾干燥的温度，则需要时间过长，鸡卵黄则易滋生细菌，要实现无菌低温喷雾干燥，对于本领域技术人员来说，难以实现，是本领域技术人员不会考虑的干燥手段。本技术方案则克服了该技术偏见，通过定制专门的离心喷雾干燥设备，延长鸡蛋黄粉干燥的运行长度，从而延长鸡蛋黄粉的干燥时间，实现在相对短的时间内完成鸡蛋黄粉的制备过程，制备得到的鸡蛋黄粉，既能保持鸡卵黄抗体的生物学活性，又能使其保持较低的含水率，避免滋生细菌。

为了更好地实现本发明，进一步地，所述步骤(1)中，抗原的具体制备过程为：

(1.1)在37℃条件下，分别培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌，培养12-16小时，向培养皿加入1mLPBS，轻轻晃动培养皿，使PBS充分松脱菌落，然后用L棒轻轻刮取菌落，接着使用吸管吸取菌液移至另一灭菌容器，再取1mlPBS液冲洗1次，重复回收菌液；

(1.2)向回收的菌液加入质量分数为0.5％的甲醛溶液，置于37℃环境下灭活24～-48h；

(1.3)在6000rpm/min条件下离心10-15min，弃上层清液，再加入1mLPBS混匀；

(1.4)重复步骤(1.3)三次，取沉淀物；

(1.5)用分光光度计或浊度计将沉淀物中细菌含量调整至101-109CFU/mL，备用；

(1.6)加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，将三种细菌灭活菌液等比例混合保存，供免疫蛋鸡用。

为了更好地实现本发明，进一步地，所述步骤(2)中，对产蛋母鸡的具体免疫过程为，取制备好的混合灭活全菌体抗原在产蛋母鸡的双侧鸡翅下皮下注射，每侧注射1ml/羽。

为了更好地实现本发明，进一步地，所述步骤(5)中，采用酶联免疫吸附试验方法检测蛋黄混合液中的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌这三种细菌的特异性抗体效价。

为了更好地实现本发明，进一步地，所述步骤(7)中，鸡蛋黄粉与辅料混合搅拌过程通过搅拌机实现，搅拌时间为5～10分钟，搅拌速度为3000r/min。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

(1)本发明将具有生物学抗体效价的鸡卵黄免疫球蛋白作为核心成分制成口腔润喉糖含片(药品或保健食品)，能够有效抑制咽喉部的常见细菌，且不产生任何对软组织损伤的副作用，缓解咽喉不适的效果非常明显；

(2)本发明利用抗原免疫技术和有效的检测和筛选技术，实现了将三种常见细菌的特异性鸡卵黄抗体成功保留在润喉保健产品中，且保证其特异性抗效价≥1:8，使其在润喉保健产品中依旧发挥抑菌功能；

(3)本发明在润喉保健产品的制备过程中，全过程温度控制在50℃以下，离心烘干的短暂高温65℃时间不超过1分钟，能够保证鸡卵黄免疫球蛋白的生物学活性不受损失，保留了抗体的抑菌功能，填补了将鸡卵黄抗体应用于保健产品的技术空白，为以后鸡卵黄抗体的应用提供了新的发展方向。

具体实施方式

为使本发明的目的、工艺条件及优点作用更加清楚明白，结合以下实施实例，对本发明作进一步详细说明。此处所描述的具体实施实例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

本实施例具体提供了一种将鸡卵黄免疫球蛋白制备成润喉保健产品的应用，每千克润喉保健产品中鸡卵黄免疫球蛋白的含量不小于1000mg，所述鸡卵黄免疫球蛋白中含有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌三种细菌的特异性抗体，且抗体效价≥1:8。

人们感到咽喉不适，60％以上是由于咽喉部的条件致病菌引起的，最常见条件致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌，这三种细菌平常口腔中存在但不大量滋生，在人体免疫力正常时与这些细菌共生，当人体抵抗力下降时，这些细菌则大量繁殖滋生引起局部炎症感染，导致人体的咽喉不适。

为了验证本实施例中经抗原免疫和未经抗原免疫的母鸡所产鸡蛋其特异性抗体的差异，特别对不同的鸡蛋检测其金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌特异性抗体效价，具体如下：

(1)实验分组：

根据产蛋母鸡的情况，进行分组，具体分组情况如表1所示：

表一 根据产蛋母鸡情况分组表

取每组母鸡产下的鸡蛋各100枚，分离、收集蛋黄，经搅匀、酸化、盐析3步法提取鸡卵黄免疫球蛋白，分别检测各组提取物中的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌的特异性抗体的抗体效价。

(2)实验过程：

采用酶联免疫吸附实验(Elisa实验)，具体实验步骤如下：

a.从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4℃。

b.空白孔加标准品(自制)和标本稀释液，其余相应孔中加标本，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。

c.提前20分钟准备生物素化抗体工作液。

d.洗板5次。

e.空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。

f.提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25)℃放置。

g.洗板5次。

h.空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。

i.打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

j.洗板5次。

k.加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。

l.加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。

(3)实验结果如表二所示：

表2不同母鸡产蛋中的特异性鸡卵黄抗体效价：

根据表1内容可知，未经抗原免疫的母鸡，由于环境消毒和喂养抗生素原因，其受到细菌的刺激机会较少，基本不产生或产生很少量的特异性抗体。而经过灭活细菌性抗原免疫过的母鸡，会产生较高效价的特异性抗体。

实施例2：

鸡卵黄免疫球蛋白发挥润喉保健的原理在于，对咽喉处致病菌的抑制，因此，本实施例特别取用特异性鸡卵黄免疫球蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌这三种细菌的进行体外抑菌实验，具体如下：

(1)实验分组：

提取1g不同组别母鸡所产鸡蛋中的鸡卵黄抗体，加入10ml生理盐水配成混合溶液。另外取1g市售润喉糖1粉碎后加10mL生理盐水配成混合溶液和10mL生理盐水，作为阴性对照。具体分组情况见表3所示：

表三 分组情况

(2)实验过程：

①抑菌片的制备：分组取无菌并干燥的滤纸片，根据分组情况每片滴加20μl相应的实验液，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平面皿内，开盖置温箱(37℃)中烤干，或置室温下自然干燥后备用。阴性对照组抑菌片的制备：取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水20μl，干燥后备用。

②接种细菌：分别接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌，三种细菌的培养皿，具体接种过程为：用无菌棉拭子蘸取浓度为5×10

③抑菌片贴放：每次贴放一个染菌平板，每个平板贴放抑菌片和1片阴阳对照抑菌片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面，各样片中心之间相距30mm以上，与平板的周缘相距25mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面，盖好平皿，置于37℃温箱内培养16～18h，用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录，实验重复三次。

(3)实验结果：

具体实验结果，如表4所示，

表四 不同抗体效价的体外抑菌实验结果

根据表4内容可知，鸡卵黄免疫球蛋白仅在特异性抗体效价≥1:8时，才对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌具有显著抑制效果，生理盐水无抑菌效果，市面常见的润喉糖抑菌种类少，抑菌效果较差。

实施例3：

本实施例为了验证上述实施例中鸡卵黄免疫球蛋白发挥效果的最优浓度，特别设计如下实验：

(1)实验分组：

取特异性抗体效价为1:8的鸡卵黄免疫球蛋白，分成5组，每组分别加入20mg、15mg、10mg、5mg、1mg鸡卵黄免疫球蛋白，以无菌生理盐水溶解，溶解后溶液总量为10ml；阴性对照为无菌生理盐水。分组情况如表5所示：

表五 分组情况

(2)实验过程：

①抑菌片的制备：取无菌并干燥的滤纸片，各片滴加各组溶液，每片滴加20μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平面皿内，开盖置温箱(37℃)中烤干，或置室温下自然干燥后备用。阴性对照：取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌生理盐水20μl，干燥后备用。

②接种细菌：分别接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌，三种细菌的培养皿，具体接种过程为：用无菌棉拭子蘸取浓度为5×10

③抑菌片贴放：每次贴放一个染菌平板，每个平板贴放抑菌片和1片阴阳对照抑菌片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面，各样片中心之间相距30mm以上，与平板的周缘相距25mm以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面，盖好平皿，置于37℃温箱内培养16～18h，用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录，实验重复三次。

(3)实验结果如表6所示：

表六 蛋白含量对抑菌效果的影响

根据表6内容可知，特异性抗体效价≥1:8的鸡卵黄免疫球蛋白含量仅在≥1mg/ml时，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌具有抑制效果；鸡卵黄免疫球蛋白含量仅小于0.5mg/ml时无抑菌效果。

实施例4：

本实施例提供一种由鸡卵黄免疫球蛋白制备成的润喉糖，每片润喉糖的重量为0.4～0.8g，其中包含鸡卵黄免疫球蛋白的含量为0.5～1.5mg。

其具体制备方法包括以下步骤：

(1)制备抗原：分别培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌，然后以甲醛溶液进行灭活，最后将三种灭活细菌混合后作为抗原备用；

(2)免疫产蛋母鸡：选择100天龄无抗生素饲养的产蛋母鸡，取0.5ml步骤(1)制得的抗原与和弗氏完全佐剂按体积比1:1乳化混合后，使用其对每只产蛋母鸡进行初次免疫；初次免疫后，第14天进行第二次加强免疫，第30天进行第三次加强免疫，两次加强免疫使用的免疫试剂，均由0.5ml步骤(1)制得的抗原与弗氏不完全佐剂按体积比1:1乳化混合后制得；

(3)收集鸡蛋：收集初次免疫30天后至第三次加强免疫后300天之间，免疫母鸡产下的鸡蛋；

(4)取1000～5000枚收集的鸡蛋，分离蛋清和蛋黄，将蛋黄混合，并搅拌均匀后，得到蛋黄混合液；

(5)检测蛋黄混合液中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型溶血性链球菌这三种细菌的特异性抗体，抗体效价≥1:8的蛋黄混合液作为合格原料备用，抗体效价＜1:8的蛋黄混合液弃用；

(6)将检测合格的蛋黄混合液在60～65℃条件下，进行离心喷雾烘干，烘干至含水量不大于5％的鸡蛋黄粉，该鸡蛋黄粉包含卵磷脂和上述三种细菌的特异性鸡卵黄抗体；

(7)将制备得到的含水量不大于5％的鸡蛋黄粉与辅料混合搅拌，待混合均匀后，进行干法制粒；

(8)将所制得的颗粒在温度不高于50℃的条件下，进行烘干，最后将烘干的颗粒进行压片，制得润喉糖。

其中，所述润喉糖的组分为，按重量份计，所述主料为：鸡卵黄免疫球蛋白1.5份，食用甜味剂880份，胖大海提取物50份，天然薄荷脑0.5份，维生素C粉20份，卵磷脂50份。

针对上述制备的润喉糖，进行实验者实验，具体如下：

志愿者选择标准：随机选择患者3000例，选择的标准是：符合西医诊断标准和中医辩证标准、年龄在18～55岁之间，受凉后咽喉不适者，其中，女性1500例，男性1500例。随机将上述病例分成实施例组和对比例组，各1500人，男女各半，实验组和对比组润喉效果。

实验组：每组润喉糖连续含服5片。

对比组：仅喝水。

第二天收集受试者感受，进行疗效判定。

疗效判定标准：

有效：咽喉不适有所改善；

效果显著：咽喉不适明显改善；

无效：咽喉不适无改善。

(3)实验结果：

结果见表7：

表七 实验组与对比组润喉结果

根据表7内容可知：实验组为润喉糖服用组，有效率为96.65％，无效率为3.35％，作用效果显著，说明本实施例提供的润喉糖具有明显的润喉效果，能够明显改善咽喉不适。

实施例5：

在制备上述实施例所述润喉糖的过程中，使用干法制粒制得的颗粒，根据本领域公知常识可知，若要成功压片，其颗粒的含水率保持在3～5％，然而在将鸡蛋黄粉与辅料混合之前，鸡蛋黄粉的含水率则至关重要。具体原因为，理论上，鸡蛋黄粉的含水率越低越好，其含水量如果过高，则鸡蛋黄粉容易被细菌污染，但是在鸡蛋黄粉的干燥过程中，鸡蛋黄粉的有效成分——特异性鸡卵黄抗体为蛋白质，在高温环境下干燥容易失活变质，因此，对蛋黄混合液干燥的过程中，必须采用60～65℃的低温干燥，但是低温干燥过程中，要制得较低含水率的鸡蛋黄粉，有需要较长时间，这个长时间的干燥过程中，蛋黄混合液又容易被细菌污染，因此，本实施例要探究，蛋黄混合液在60～65℃条件下，干燥后的鸡蛋黄粉不易被细菌污染的最低含水率。该含水率的鸡蛋黄粉能够稳定保存，不易被细菌污染，且干燥时间相对较短，避免低温干燥过程中被细菌污染，因此在制备上述润喉糖的过程中，需要对鸡蛋黄粉的极限含水率进行实验，具体实验过程如下：

(1)实验分组：

以“直接干燥法”测定鸡蛋黄粉中的水分含量，制作一批水分含量为1％的鸡蛋黄粉；分别加入不同量的无菌蒸馏水、混匀，使鸡蛋黄粉的水分含量分别为1％、2％、3％、4％、5％、7％、10％、15％、20％，阴性对照为无菌蒸馏水，分成10组。分组情况如表八所示：

表八 分组情况

(2)实验过程：

①取每组鸡蛋黄粉样品各500克，在37℃恒温箱中放置；

②分别于放置的当天(0天)、1天、2天、3天、5天取样，每组各取样25克进行菌落总数测定，观察样品污染情况；

③样品菌落总数测定方法按照标准“GB4789.2-2016”操作。

(3)实验结果如表九所示：

表九 鸡蛋黄粉含水量在不同时间中菌落生长情况

*当菌落数＞10000CFU/克时，则视为鸡蛋黄粉被细菌污染。

根据表九的内容可知，当鸡蛋黄粉的水分含量≤5％时，不易被细菌污染，能够较长时间保存产品不变性；当鸡蛋黄粉的水分含量≥7％时，很容易被细菌污染，且水分含量越高越容易被污染，产品不易保存。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。