一种贝莱斯芽胞杆菌及强化零添加酱油鲜味氨基酸的应用

摘要

本发明公开了一种贝莱斯芽胞杆菌及强化零添加酱油鲜味氨基酸的应用，从发酵1年的酱醪中筛选出合成氨基酸能力较强的贝莱斯芽胞杆菌JYB‑4菌株，具有较强的氨基酸合成和代谢能力，能够利用葡萄糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖以及蔗糖，菌株谷氨酰胺酶和天冬酰胺酶活较高，并且苦味氨基酸的分解能力较强；通过在发酵过程中接种JYB‑4菌株的方式，能够促进酱油中谷氨酸、天冬氨酸的生成，同时消耗酱油中苦味氨基酸，增加甜味氨基酸的含量，在保持氨基酸态氮总体稳定的情况下，实现了酱油氨基酸组分的重排，获得鲜味突出、口感协调、甜味适中、厚味绵长的零添加鲜味氨基酸酱油。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽胞杆菌及强化零添加酱油鲜味氨基酸的应用。

背景技术

钠盐形式存在的氨基酸决定着酱油的风味口感。特别是原汁原味的零添加酱油，由于不添加其他增鲜物质，完全靠生物工程技术来解决美味好吃又健康，就需要提高酱油中的氨基酸含量，其中，谷氨酸钠对鲜味贡献最大，其次为天冬氨酸钠。丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸等则赋予酱油一部分甜味，但是酱油中精氨酸、赖氨酸等含量的增加又会给酱油带来苦味，因此，增加零添加酱油鲜味氨基酸和甜味氨基酸，同时降低酱油中苦味氨基酸含量，能够提高酱油鲜味、提升酱油口感。

为了增加酱油的鲜味，酱油厂家会向酱油中添加谷氨酸钠，谷氨酸钠的加入虽然能够提升酱油鲜味，但是外源谷氨酸钠的加入破坏了酱油原有氨基酸组分的协调性，使得口感尖锐且厚重感不足。

专利201410368087.8公开一种提高谷氨酸含量的发酵工艺，通过在制曲过程中添加高谷氨酰胺酶活菌株，获得了谷氨酸含量超过30g/L的高鲜调味汁，但是该工艺在制曲过程中接种高谷氨酰胺酶菌株会带来挥发性盐基氮超标。同时，仅仅增加谷氨酸含量带来的鲜味刺激较为尖锐，口感不适宜。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供一种贝莱斯芽胞杆菌及强化零添加酱油鲜味氨基酸的应用，利用从发酵1年的酱醪中筛选出合成氨基酸能力较强的菌株，并在发酵过程中接种的方式，能够促进谷氨酸、天冬氨酸的生成，同时消耗酱油中苦味氨基酸，增加甜味氨基酸的含量，在保持氨基酸态氮总体稳定的情况下，实现了酱油氨基酸组分的重排，获得鲜味突出、口感协调、甜味适中、厚味绵长的零添加鲜味氨基酸酱油。

本发明通过下述技术方案实现：

一种贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)，所述贝莱斯芽胞杆菌为JYB-4，其保藏编号为：CGMCC No.21559，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为：2020年12月28日，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

本发明的贝莱斯芽胞杆菌JYB-4，能够利用葡萄糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖以及蔗糖，菌株谷氨酰胺酶和天冬酰胺酶活较高，而且苦味氨基酸的分解能力较强，能够在高盐环境下快速促进酱醪中谷氨酸、天冬氨酸的生成，同时消耗酱油中苦味氨基酸，增加甜味氨基酸如丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸等的含量。

一种贝莱斯芽胞杆菌JYB-4的选育方法，包括如下步骤：1)采集发酵1～2年的酱醪；2) 热处理杀灭不耐温细菌和真菌：将获取的酱醪45℃-50℃热处理15-40min；3)将热处理好的酱醪按照一定稀释倍数涂布到添加0.1-0.5％的纳他霉素LB培养基上；4)将35-40℃条件下培养2～4天的菌落挑出；5)将挑出的单菌落纯化并接种到酱油培养基中，于30-35℃、 150-250rpm条件下培养3-10天，其中酱油培养基成分为5-20％的酱油、2-6％的葡萄糖，其余为水；6)测定酱油培养基中的氨基酸成分，并与未接种菌落的空白培养基做对比；7)筛选出鲜味氨基酸含量提高、苦味氨基酸含量减少、甜味氨基酸增加的菌株；8)对获得的菌株提取基因组，并对16S基因进行PCR测序，经序列比对，确定筛选出的菌株JYB-4为贝莱斯芽胞杆菌。

贝莱斯芽胞杆菌JYB-4在强化零添加酱油鲜味氨基酸的应用，在酱油发酵过程中按照 10

贝莱斯芽胞杆菌JYB-4在强化零添加酱油鲜味氨基酸的应用，具体步骤如下：1)JYB-4 菌株种子液的制备：将JYB-4接种到灭菌并冷却下来的酱油培养基中(5-20％的酱油、2-6％的葡萄糖，其余用水补足)，30-35℃培养24-48h，使得菌落数达到1×10

步骤2)中盐水为含生原油的盐水，其中NaCl浓度为22-23％，氨基酸态氮含量为0.3-0.6g/100mL。

所述蛋白原料为大豆、脱脂大豆、小麦蛋白粉、玉米、玉米蛋白粉或者多种混合物。

所述淀粉原料为小麦、面粉或者两种混合物。

本发明选育的贝莱斯芽胞杆菌JYB-4具有较强的氨基酸合成和代谢能力，通过在发酵过程中接种JYB-4菌株实现了酱油中原有氨基酸组分的重排，从而促进了谷氨酸、天冬氨酸的生成，同时消耗了酱油中的苦味氨基酸，增加了甜味氨基酸的含量。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明一种贝莱斯芽胞杆菌，具有较强的氨基酸合成和代谢能力，能够利用葡萄糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖以及蔗糖，菌株谷氨酰胺酶和天冬酰胺酶活较高，并且苦味氨基酸的分解能力较强，能够在高盐环境下快速促进酱醪中谷氨酸、天冬氨酸的生成；

2、本发明一种贝莱斯芽胞杆菌的选育方法，利用现代生物技术，从发酵1年的酱醪中筛选获得代谢和合成氨基酸能力较强的菌株，相比于高谷氨酰胺酶活菌株来说，不仅仅单纯的提高酱油中谷氨酸含量，同时能够消耗酱油中苦味氨基酸，增加甜味氨基酸如丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸等的含量；

3、本发明一种贝莱斯芽胞杆菌及强化零添加酱油鲜味氨基酸的应用，将JYB-4菌株在发酵第一天接种到酱醪中，增加了鲜味氨基酸、甜味氨基酸所占比例、降低了苦味氨基酸百分比，使得酱油氨基酸组分发生了重排，在不额外添加谷氨酸钠的情况下让零添加酱油口感鲜美、味道柔和、甜味适中、厚重感浓厚。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明酱油酿造路线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

JYB-4菌株对酱油培养基中氨基酸组分的影响

将本发明筛选得到的JYB-4菌株提取基因组并将16S基因进行PCR测序，在NCBI数据库进行序列比对，发现该菌株与贝莱斯芽胞杆菌相似度大于99％，因此认为该菌株为贝莱斯芽胞杆菌亚种。

将JYB-4菌株接种到LB固体培养基斜面上(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl10g/L)，35℃培养48h进行活化培养；将活化好的JYB-4菌株挑取一环接种到酱油液体培养基中(10％酱油原油，4％的葡萄糖，其余用水补足)，37℃、200rpm条件下培养5d，然后测定发酵液的氨基酸组分，用不接种菌株的酱油培养基作为空白对照，结果如表1所示。

表1接种JYB-4菌株对于酱油培养基中氨基酸组分的影响

其中，甜味氨基酸为丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸含量的总和；苦味氨基酸为精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的总和。

从表1中可知，接种JYB-4菌株并经5d培养后，酱油中的氨基酸组分发生了很大变化，其中以谷氨酸和天冬氨酸为代表的鲜味氨基酸较对照有了明显提升，并且甜味氨基酸也获得了增加，而接种JYB-4菌株后苦味氨基酸较对照组有了显著降低，总的氨基酸同对照相比也增加了。这主要是由于接种JYB-4菌株后，该菌株利用自身的酶系分解代谢了某些氨基酸，同时产生了另外一些氨基酸，从而造成了酱油氨基酸组分的重排，同时保证了氨基酸态氮的总量。

实施例2

不同比例的酱油原油对于JYB-4菌株生长情况的影响。

考察了酱油原油加入量对于JYB-4菌株生长情况的影响，按照实施例1所示将JYB-4菌株在斜面培养基上活化；而后将活化好的菌株分别挑取一环接种到含有不同比例的酱油培养基中(酱油比例分别为5％，10％，15％和20％，葡萄糖比例均为4％，其余用水补足)；而后在30℃、200rpm条件下培养24h；培养结束后，将培养液吸出并对菌体个数进行计数。

表2不同比例酱油对JYB-4菌株生长的影响

从表2可知，酱油加入量为10％时菌株的生长状况最好，当酱油加入量超过10％以后，菌株生长受到抑制，这可能是由于酱油中其他菌株发酵产生的次级代谢产物超过一定量之后就会抑制JYB-4菌株的生长。

实施例3

不同培养时间的JYB-4菌株对于零添加酱油发酵氨基酸组分的影响

制备工艺流程图如图1所示，其具体包括以下步骤：

(1)配制酱油培养基(酱油原油10％，葡萄糖4％，其余用水补足)，121℃灭菌20min，待冷却后接入JYB-4菌株，通气量1.5v/v·min、30℃，培养时间为24或36或48或60h。

(2)将大豆、小麦、小麦蛋白粉、玉米按照6：3：2：1混合制曲，然后曲料和22％的盐水(盐水中加入生原油调整盐水氨基酸态氮含量为0.5g/100mL)按照1：1.6混匀；

(3)将(1)步中获得的不同培养时间的JYB-4培养液分别按照10

(4)将(3)步中的酱醪16℃培养15d，然后每天升温1摄氏度直至升温至30℃后接种鲁氏酵母和球拟酵母，再30℃恒温培养直至总发酵时间达到6个月；

(5)将(4)步中的酱醪经压榨、灭菌、过滤、分装等工序获得成品酱油。

表3不同培养时间的JYB-4培养液对于发酵6个月零添加酱油氨基酸组分的影响

从表3结果可知，随着培养时间的增加，JYB-4培养48h后接入发酵第1天的酱醪中鲜味氨基酸、甜味氨基酸增加最多，苦味氨基酸降低最为明显，同时氨基酸总量较对照组也增加了6.70％，而随着时间再继续增加，鲜味氨基酸、甜味氨基酸反而减小。

实施例4

JYB-4菌株不同接种量对于零添加酱油发酵氨基酸组分的影响

制备工艺包括以下步骤：

1)配制酱油培养基(酱油原油10％，葡萄糖4％，其余用水补足)，121℃灭菌20min，待冷却后接入JYB-4菌株，通气量1.5v/v·min、30℃，培养时间为48h。

2)将大豆、小麦、小麦蛋白粉、玉米按照6：3：2：1混合制曲，然后曲料和22％的盐水(盐水中加入生原油调整盐水氨基酸态氮含量为0.5g/100mL)按照1：1.6混匀；

3)将步骤1)中获得的不同培养时间的JYB-4培养液分别按照10

4)将步骤3)中的酱醪16℃培养15d，然后每天升温1摄氏度直至升温至30℃后接种鲁氏酵母和球拟酵母，再30℃恒温发酵1个月后常温酿造6个月结束；

5)将步骤4)中的酱醪经压榨、灭菌、过滤、分装等工序获得成品零添加酱油。

表4 JYB-4菌株不同接种量对于发酵6个月零添加酱油氨基酸组分的影响

从表4可知，接种10

本发明接种JYB-4菌株后酿造的成品零添加酱油，经过11人感官鉴评人员鉴评，一致认为其鲜味突出，色泽红状，口感柔和，香气浓郁。

以上实施例中零添加酱油氨基酸含量测定均采用《GB 5009.124-2016食品中氨基酸的测定》中的方法来进行测定。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。