凤尾鱼肽-儿茶素结合物在改善记忆中的应用

摘要

本发明公开了凤尾鱼肽‑儿茶素结合物在改善记忆中的应用。凤尾鱼肽‑儿茶素结合物的制备方法包括以下步骤：按凤尾鱼多肽与儿茶素的质量比5:1，将凤尾鱼多肽溶液和儿茶素溶液混合，在有氧气存在的情况下，反应24h以上，反应过程中不断搅拌；将反应后的样品低温透析并进行真空冷冻干燥，得到凤尾鱼肽‑儿茶素结合物。本发明对多酚的种类，及凤尾鱼肽与多酚的用量比进行了优选，所制得的凤尾鱼肽‑儿茶素结合物可提高模型小鼠的记忆损伤改善功效。

说明书

技术领域

本发明属于功能食品领域，具体涉及凤尾鱼肽-儿茶素结合物在改善记忆中的应用。

背景技术

蛋白质和多酚是食物中具有功能和营养特性的两大重要成分。多肽类物质是由20种氨基酸构成的具有多种功能活性的物质，可由生物酶解技术从食源性蛋白质中获得。多酚类物质是植物二级代谢产物，具有独特的酚羟基结构。

有研究表明，蛋白质/多肽能够与多酚类物质通过可逆的非共价键(氢键、范德华力、π键、疏水及离子相互作用力)或不可逆的共价键发生相互作用。由于多肽-多酚之间不可逆的共价结合更持久，因此，该反应更有利于其在食品工业中的发展。在氧气和碱存在的环境下，多酚类物质首先被氧化为醌，继而形成醌类二聚体或者与多肽侧链上的氨基及巯基侧链反应，从而改变多肽的结构及生物活性，例如抗氧化活性及抗肿瘤活性等。

现有技术研究结果表明凤尾鱼酶解产物具有较好的神经营养及辅助改善记忆功效。但蛋白肽-多酚结合物的辅助改善记忆功效仍有待证实。

中国发明专利ZL201510671224.X公开了一种具有改善记忆功效的凤尾鱼美拉德肽及其制备方法和用途，该发明采用生物酶解技术释放凤尾鱼蛋白中具有改善记忆作用的蛋白肽，通过美拉德反应进一步提升功效和改善风味。但有研究表明，体内美拉德反应产物即晚期糖基化终末产物(AGEs)或有加重阿尔茨海默症(老年痴呆症)患者脑内炎症的风险。使得人们在对美拉德反应产物的应用方面受到限制。

中国发明专利申请CN 111616355A公开了一种蛋白肽-多酚-鱼油乳浊液及其制备方法和用途，该发明通过凤尾鱼酶解产物与多酚反应，进一步提升其抗氧化能力，且具有较好的稳定鱼油乳液的作用。但是，该专利所宣称的“辅助改善记忆功效”仅是基于凤尾鱼酶解肽的改善记忆作用，该专利没有确切的改善记忆功效实验，没有证实所制得的蛋白肽-多酚-鱼油乳浊液是否具有怎样的改善记忆功效。

发明内容

本发明的目的在于提供凤尾鱼肽-儿茶素结合物在制备具有改善记忆功效的药品、保健品和食品中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种凤尾鱼肽-儿茶素结合物在制备具有改善记忆功效的药品、保健品和食品中的应用；

所述的凤尾鱼肽-儿茶素结合物可以按照现有技术方法制得；尤其是按照中国专利申请CN 111616355A中，制备凤尾鱼肽-多酚共价结合物的方法制得；

具体地，所述凤尾鱼肽-儿茶素结合物的制备方法包括以下步骤：

按凤尾鱼多肽与儿茶素的质量比5:1，将凤尾鱼多肽溶液和儿茶素溶液混合，在有氧气存在的情况下，反应24h以上，反应过程中不断搅拌，使得儿茶素氧化产物与多肽的侧链氨基酸等反应生成凤尾鱼肽-儿茶素共价结合物；将反应后的样品低温透析并进行真空冷冻干燥，得到凤尾鱼肽-儿茶素结合物；

所述的凤尾鱼多肽溶液，是将凤尾鱼多肽粉溶于去离子水中，调节pH值为8.0-10.0，形成凤尾鱼多肽溶液；

优选地，所述的儿茶素溶液和凤尾鱼多肽溶液都添加0.02％(W/V)叠氮钠，以抑制微生物的生长；

所述低温透析的方法为：将透析袋固定于装有去离子水的透析容器中，透析24-36h，温度为4℃，每隔3～5h换一次去离子水，确保未反应的游离多酚完全透析出去；

所述透析袋截留分子量为8000～10000道尔顿。

所述的凤尾鱼多肽粉，由以下步骤制得：

取凤尾鱼，预处理之后，加入蛋白酶酶解，然后离心，上清液做喷雾干燥，得到凤尾鱼多肽粉，其中蛋白质含量大于85％(W/W)；

凤尾鱼的前处理及酶解操作可以参照现有技术的做法，比如中国发明专利ZL201510671224.X中的做法；

所述的喷雾干燥，进风温度和出风温度分别为185℃及90℃，进料流速为20mL/min；

所述的儿茶素溶液由以下步骤制得：

将儿茶素(Catechin，CA)分散于适量甲醇后加入到去离子水中，调节pH值为8.0-10.0，在室温、氧气存在的情况下搅拌反应12h以上，使儿茶素充分氧化成醌类化合物，形成儿茶素溶液。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明中，凤尾鱼肽-儿茶素结合物的制备方法简单，不需要毒性化学试剂及高温高压条件，所有技术都在水相中进行，符合绿色环保要求。

2、本发明对多酚的种类，及凤尾鱼肽与多酚的用量比进行了优选，所制得的凤尾鱼肽-儿茶素结合物可提高模型小鼠的记忆损伤改善功效。

附图说明

图1是凤尾鱼肽-儿茶素结合物对神经损伤PC12细胞存活率的影响；

图2是凤尾鱼肽-儿茶素结合物对小鼠水迷宫训练期游泳速度的影响；

图3是凤尾鱼肽-儿茶素结合物对小鼠水迷宫训练期游泳距离的影响；

图4是凤尾鱼肽-儿茶素结合物对小鼠水迷宫训练期潜伏期的影响；

图5是凤尾鱼肽-儿茶素结合物对小鼠水迷宫训练期穿过目标象限次数的影响；

图6是凤尾鱼肽-儿茶素结合物对小鼠水迷宫训练期穿过平台次数的影响；

图7是凤尾鱼肽-儿茶素结合物对小鼠水迷宫测试期游泳距离、游泳速度及穿过目标象限的影响；

图8是凤尾鱼肽-儿茶素结合物对小鼠水迷宫测试期穿过平台次数及潜伏期的影响；

图9是凤尾鱼肽-儿茶素结合物对小鼠氧化应激水平的影响，结果分别为肝脏及血清的SOD含量(A)、GPx含量(B)、LDH水平(C)及MDA含量(D)；

图10是凤尾鱼肽-儿茶素结合物对小鼠炎症水平的影响，结果分别为小鼠肝脏及血清的IL-1β表达水平(A)及TNF表达水平(B)；

其中，Control-正常对照组，Model-模型组，其他为实验组。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中凤尾鱼肽-儿茶素结合物及对照组样品谷氨酸损伤的PC12细胞存活率的影响实验方法如下：

PC12细胞是一个常用的神经细胞株。本实验所用PC12细胞购自上海细胞库。采用PRIM 1640培养基培养，其中加入10％胎牛血清(FBS)及1％的青霉素及链霉素。细胞在培养箱中培养，条件设置：CO

CCK-8细胞活力检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。其中含有WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，在电子载体存在的情况下WST-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成水溶性的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。上述孵育实验结束后，向96孔板中每孔加入10μL CCK-8溶液，继续孵育1小时50分钟后，用酶标仪测定其在450nm处的吸光度。

本发明实施例中凤尾鱼肽-儿茶素结合物对痴呆鼠行为学指标的改善作用实验方法如下：

实验动物：SPF级Bablc小鼠，18～22g，48只，雄性；繁育单位：中山大学(实验动物中心东校区)，实验动物生产许可证号为：SCXK(粤)2016-0029；动物合格证号：No.44008500020224；

实验动物分组：取SPF级Bablc小鼠60只，雄性，18～22g，随机分为5组，每组12只，即正常对照组、模型组、凤尾鱼肽(APH)组、凤尾鱼肽-儿茶素结合物(APH-CA)组及儿茶素(CA)组；采用氢溴酸东莨菪碱进痴呆鼠造模，剂量为3mg/kg，腹腔注射容积为0.1mL/10g小鼠；样品组灌胃剂量为200mg/kg，每天灌胃一次；正常对照组和模型对照组灌胃给予无菌水，其他各组分别给予相应的样品，每天一次，连续14天。给药14天后进行Morris水迷宫测试，测试期间同时给予样品及东莨菪碱，测试结束后，将小鼠断颈处死并进行后续理化指标检验。

Morris水迷宫测试：本实验Morris水迷宫由直径80cm、迷宫臂高出水面20cm，高47cm圆形水池及直径为7.5cm的圆形安全平台(表面粗以利于动物抓住)构成，液面高平台1.5cm，水温维持在21℃左右。整个实验过程分为定向航行实验(hidden-platformacquisition training)和空间探索实验(probe trial testing)两部分。

将水池分为1、2、3、4四个象限，将安全平台置于其中一个象限里，加入墨汁使水变浑浊。每次定向航行前30min，正常对照组小鼠腹腔注射给予生理盐水，其他各组腹腔注射氢溴酸东莨菪碱3mg/kg制备记忆获得障碍模型，然后进行定位航行实验。

①设置好水迷宫，在其壁上标记好东(E)西(W)南(S)北(N)四个方向点，将其分成四个象限。将逃生台放在水迷宫四个象限的其中一个象限的中心，逃生台没于水下1.5厘米，其中心点距离水迷宫的盆壁20厘米。在实验室的墙壁上布置好显而易见的几何图形标记。另外，在实验过程中，实验者不得随意走动。

②每天的同一时间段对小鼠进行训练。以E、W、S、N四个点作为训练小鼠时的投放点。将小鼠头朝向盆壁从其中的一个投放点轻轻的放入水中，记录小鼠找到逃生台的时间。设定时间上限为90秒。在最初的几次训练中，如果小鼠在90秒内还没找到逃生台，人为引导小鼠到逃生台。

③让小鼠呆在逃生台上15秒。在开始训练的时候，小鼠有可能从逃生台跳下来，如果这样，再次引导小鼠到逃生台，让其在台上累计呆上15秒。

④将小鼠拿起，用毛巾擦干放回饲养笼置于40W白炽灯下取暖。

⑤每天对小鼠进行2轮训练，每轮对应一个投放点，每天放入2个投放点的顺序应该是随机的，以保证小鼠真正是靠空间坐标来记忆逃生台的位置。

⑥连续训练4d，直到小鼠表现稳定，发现逃生台的平均时间在30秒左右。

最后一次训练24小时后，撤去逃生台，将小鼠从逃生台的对角象限的点放入水迷宫，让其自由游动90秒，然后将小鼠拿出。录制下整个过程，分析小鼠在目标象限游动的时间和距离及穿越安全平台区域的次数等指标。记录水迷宫训练期潜伏期、测试期游泳距离、游泳速度、穿越平台所在象限次数、平台所在象限累计持续时间、穿越平台次数。

本发明实施例中凤尾鱼肽-儿茶素结合物对痴呆鼠肝脏及血液指标的改善作用实验方法如下：

行为学实验结束后，将小鼠取血断头处死，解剖后取大脑及肝脏等部位，保存至-80℃；血浆经离心处理后得到血清。根据测定指标试剂盒的操作说明进行检测。测定指标为：超氧化物歧化酶(SOD)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)含量、乳酸脱氢酶(LDH)水平、MDA含量、IL-1β表达水平及TNF的表达水平变化情况。

实施例

凤尾鱼肽-儿茶素结合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)以去头、去内脏的凤尾鱼为原料，经绞肉机搅碎制成肉糜。称取适量加入相同比例去离子水，然后加入三种蛋白酶(Alcalase 2.4L，木瓜蛋白酶以及胰酶，蛋白/底物分别为0.15％，0.1％和0.25％，w/w)对凤尾鱼肉糜进行酶解。酶解温度为55℃，酶解时间为8h。酶解结束后，在95℃下加热15min进行灭酶。灭酶后酶解产物于离心力5000×g，温度4℃下离心20min，收集上清液，真空浓缩，并进行喷雾干燥，得到凤尾鱼多肽(APH)粉末。

喷雾干燥的进风温度和出风温度分别为185℃及90℃，进料流速为20mL/min。喷雾干燥后的粉末贮存在-20℃备用。该产物蛋白质含量大于85％。

(2)分别称取0.8g儿茶素(CA)，分散于适量甲醇中，加入去离子水，定容至200mL，得到多酚溶液；利用1mol/L的氢氧化钠溶液将多酚溶液pH值调为9.0，并加入0.02％(w/v)抑制微生物生长；在有氧气存在的条件下，将该溶液恒速搅拌12h，使儿茶素充分反应，得到儿茶素反应后溶液；

(3)称取4g凤尾鱼多肽(APH)粉末，溶于200mL去离子水中；利用1mol/L的氢氧化钠溶液将多酚溶液pH值调为9.0，并加入0.02％(w/v)抑制微生物生长，得到凤尾鱼多肽溶液；

(4)在恒速搅拌条件下，按凤尾鱼多肽与儿茶素5:1的质量比，将凤尾鱼多肽溶液与儿茶素溶液混合，形成反应体系；然后在室温下，恒温搅拌24h反应；将反应后的样品在4℃下透析48h，每隔3h换水一次，除去未反应的儿茶素，然后对透析袋内剩余的液体进行冷冻干燥，得到凤尾鱼肽-儿茶素结合物。

图1显示的是经由实施例凤尾鱼肽-儿茶素结合物及对照组样品处理的谷氨酸损伤的PC12细胞存活率。由结果可知，谷氨酸处理24h后，细胞存活率为54.78％，表明细胞经由谷氨酸孵育后，其细胞存活率显著下降。

继续由不同组别样品处理后，细胞存活率有所提升。其中，APH-CA 5:1处理组(本发明实施例)显著提升了谷氨酸损伤后PC12细胞的存活率，到达91.15％，且高于其他处理组。由此可知，APH-CA 5:1处理组(本发明实施例)对谷氨酸诱导的神经细胞损伤具有较好的改善作用。

举例说明图1中的对照组样品，APH-GA 10:1是在实施例步骤(4)中，以没食子酸替代儿茶素，凤尾鱼多肽与没食子酸的质量比为10:1。TA为单宁酸。GA为没食子酸。APH-M为中国发明专利ZL201510671224.X实施例1制得的凤尾鱼美拉德肽。

图2-图6为各处理组别小鼠水迷宫训练期相关指标变化情况及水迷宫实验结果。图7-图8显示的是各组别处理小鼠水迷宫实验测试结果。

图2为水迷宫训练5天期间各处理组别水迷宫训练游泳速度变化情况，随着训练时间的延长，各处理组别游泳速度无显著变化；处理组第1、3、4天，模型组游泳速度显著低于正常组小鼠游泳速度(P<0.05/0.01)；处理组第3、4、5天，APH、APH-CA 5:1(本发明实施例)及CA处理组别游泳速度显著高于模型组小鼠游泳速度(P<0.05/0.01)。

由图3所示，随着训练时间的延长，各组游泳距离有所缩短，其中第1、4、5天，模型组小鼠游泳距离显著长于正常组小鼠游泳距离(P<0.05/0.01)；值得注意的是，训练第1、3、4、5天，APH-CA 5:1(本发明实施例)小鼠游泳距离显著短于模型组小鼠游泳距离(P<0.05/0.01)，说明APH-CA 5:1(本发明实施例)能够用更短的游泳距离找到平台。

由图4所示，随着训练时间的延长，小鼠找到平台的潜伏期有所降低，其中第3、4、5天模型组潜伏期显著长于正常组潜伏期，说明随着东莨菪碱的注射，模型组小鼠对平台位置的记忆能力显著下降(P<0.05/0.01)；训练第3、4、5天，APH-CA 5:1(本发明实施例)小鼠潜伏期显著短于模型组小鼠潜伏期(P<0.05/0.01)，APH及CA处理组别小鼠在训练第3、4天潜伏期显著短于模型组小鼠潜伏期(P<0.05/0.01)。

由水迷宫训练穿过目标象限次数结果(图5)可知，随着训练时间的延长，模型组小鼠穿过目标象限次数显著低于正常组穿过目标象限次数(P<0.05/0.01)，而APH-CA 5:1(本发明实施例)能够在训练期间显著增加痴呆鼠穿过目标象限次数(P<0.05/0.01)；APH及CA处理组别分别可以在训练后3天及4天显著增加痴呆鼠穿过目标象限次数(P<0.05/0.01)。

由小鼠水迷宫训练穿过平台次数结果(图6)可知，训练期第2、3、4、5天，模型组小鼠穿台次数显著少于正常组小鼠穿台次数(P<0.05/0.01)，而处理组别在训练第3、4、5天显著增加痴呆鼠穿台次数(P<0.05/0.01)，CA组别第五天除外。

水迷宫训练结束后，各处理组别小鼠进行水迷宫测试实验。结果如图7所示，与正常组相比，模型组的游泳距离(cm)显著增加，游泳速度(cm/s)及穿过目标象限次数(n)显著降低，而APH、APH-CA 5:1(本发明实施例)及CA处理组能够显著降低痴呆鼠游泳距离(P<0.05)，显著增加其游泳速度(P<0.01)，但仅CA处理组可显著提升其穿过目标象限次数。

由图8可知，与正常组小鼠相比，模型组小鼠水迷宫测试的穿台次数显著减少且潜伏期显著增强(P<0.05)，APH-CA 5:1组(本发明实施例)及CA处理组小鼠可显著增加痴呆鼠穿台次数，而仅APH-CA 5:1组(本发明实施例)可显著降低痴呆鼠水迷宫潜伏期(P<0.05)。

以上结果显示，与正常组小鼠相比，东莨菪碱处理后小鼠出现空间记忆及学习能力下降等现象，与文献报道一致。而APH、APH-CA 5:1(本发明实施例)及CA处理后小鼠均可一定程度改善痴呆鼠记忆损伤，其中APH-CA 5:1(本发明实施例)在学习及空间记忆能力改善等方面均具有较好的改善作用。

取实施例中的凤尾鱼肽-儿茶素结合物，测定其对痴呆鼠肝脏及血液氧化应激水平的影响：

为进一步探究APH、APH-CA 5:1(本发明实施例)及CA对东莨菪碱诱导的痴呆鼠肝脏及血清氧化应激指标的影响，本研究在上述行为学测定结束后的22天，取各处理组别小鼠肝脏及血清测定其超氧化物歧化酶(SOD)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)含量、乳酸脱氢酶(LDH)水平及丙二醛(MDA)含量的变化情况。

SOD是生物体内一种重要的抗氧化酶，如图9A所示，与正常组相比，模型组小鼠肝脏中SOD含量与正常组及样品处理组无显著性差异(P>0.05)，模型组小鼠血清中SOD含量显著低于正常组SOD含量，但样品处理组无显著提高血清SOD含量的作用。

GPx可以清除活细胞内过氧化物，在保护细胞免受自由基损伤过程中起着关键作用。如图9B所示，与正常组相比，模型组小鼠肝脏及血清中GPx含量显著低于正常组小鼠肝脏及血清中GPx含量(P<0.05)，但仅APH-CA 5:1(本发明实施例)小鼠血清中GPx含量与模型组相比显著提升(P<0.05)。

细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的LDH，因此，检测LDH含量可初步评估细胞凋亡或坏死情况。由LDH水平检测结果可知(图9C)，各处理组别小鼠肝脏中LDH水平无显著差异(P>0.05)，而模型组血清中LDH含量与正常组相比显著上调，APH、APH-CA 5:1(本发明实施例)及CA处理组别显著降低痴呆鼠血清中LDH释放水平(P<0.05)。

丙二醛是一种生物体脂质氧化的天然产物。动物或植物细胞发生氧化应激时，会发生脂质氧化。一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括MDA。此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。由图9D结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肝脏及血清中MDA含量显著上升，但仅APH及APH-CA 5:1(本发明实施例)能够显著降低肝脏中的MDA含量(P<0.05)，其中APH-CA 5:1(本发明实施例)组MDA含量较APH组别中MDA含量更低。

取实施例中的凤尾鱼肽-儿茶素结合物，测定其对痴呆鼠肝脏及血液氧化应激水平的影响：

为进一步探究APH、APH-CA及CA对东莨菪碱诱导的痴呆鼠肝脏及血清炎症指标的影响，本研究在上述行为学测定结束后的22天，取各处理组别小鼠肝脏及血清测定其白介素-1β(IL-1β)表达水平及肿瘤坏死因子(TNF)的表达水平变化情况。

组织及血清中IL-1β及TNF的表达水平体现了组织炎症应激程度，由图10A可知，模型组小鼠肝脏及血清中IL-1β的表达量显著高于正常组小鼠肝脏及血清中IL-1β的表达量，APH-CA 5:1(本发明实施例)处理可显著下调痴呆鼠肝脏及血清中IL-1β的表达量(P<0.05)。

由图10B所示，与正常组相比，模型组小鼠肝脏及血清中TNF表达量显著上升，而APH、APH-CA 5:1(本发明实施例)及CA处理组别可显著降低肝脏中的TNF表达量，APH及APH-CA 5:1(本发明实施例)处理可显著下调痴呆鼠血清中的TNF表达量。

以上结果表明，东莨菪碱诱导的小鼠记忆损伤，同时会导致痴呆鼠肝脏及血清氧化应激及炎症应激症状。APH-CA 5:1(本发明实施例)及APH处理组能够显著改善痴呆鼠肝脏及血清中氧化及验证水平，且多肽-多酚相互作用可提高APH对痴呆鼠肝脏及血清损伤的修复作用。

由本发明结果可知，APH、APH-CA 5:1(本发明实施例)及CA处理组在水迷宫训练期间及测试期间均能够在不同程度上改善痴呆鼠空间学习及记忆能力。其中APH-CA 5:1(本发明实施例)的改善效果较其他两组更为明显，由此可知，APH-CA 5:1(本发明实施例)能够提升APH对痴呆鼠的记忆提升能力

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。