一种植物源农药川楝素的低温提取纯化工艺

摘要

本发明公开一种植物源农药川楝素的低温提取纯化工艺，属于生物技术领域。本发明采用低温提纯纯化川楝素，通过真空浓缩至标准密度，实现川楝子乙醇精提液的快速分层，在将上层浸膏再次醇提，实现川楝素的高效提取，所得川楝素母液的浓度≥1％。整个工艺过程不使用石油醚、壳聚糖等成分，大大减少有机溶剂使用带来的污染和不安全性，简化工艺流程并减少川楝素的流失，大幅降低植物源农药的生产成本，促进植物源农药是市场化应用，具有广阔的经济效益和社会效益。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种川楝素的低温提取纯化工艺。

背景技术

农药按其来源可分为生物源，矿物源，化学合成三大类。矿物源农药种类少，发展前途不大。化学农药有其高效的一面，可在病虫害大量发生时发挥作用，但化学农药在使用过程中产生的“三R”问题，即残留(Residue)，抗性(Resistance)及害虫再猖獗(Resurgence)日趋严重。世界各国对生产和使用化学农药逐步加以限制，加上开发化学农药新品种并使其商品化的难度越来越大，而病虫害抗药性的产生又缩短了这些化学农药的使用寿命，使化学农药的发展遇到越来越严重的困难。我国在停止生产六六六，DDT等有机氯农药品种，此后又先后禁止生产二溴氯丙烷、氟乙酰胺、毒鼠强、杀虫脒、除草醚等品种。生物源农药包括植物源农药和动物源农药，而又以植物源农药为主。植物农药，因其对哺乳动物选择性毒性符合安全标准，在环境中无持久性的残留，对防治对象的作用方式多属胃毒作用，无接触毒性，使非食植性的益虫免受伤害，病虫害不易产生抗性，开发和生产费用相对较低等优点，引起了世界各国对植物农药研究与开发的兴趣。因此，植物农药的研究与开发，不仅是维护环境、保护生态的需要，也是农药工业发展的一个方向。

川楝素(toosendanin)是在楝属植物中发现的一种降四环三萜化合物，其具有驱虫、抗癌、抗毒素、抗菌、阻断神经肌肉接头、抑制呼吸中枢、消炎等多种生物活性，是一种安全无公害的植物源农药产品。目前川楝素提取纯化的工艺，基本是在提取川楝素后，使用石油醚或者壳聚糖进行进一步的纯化，而石油醚属于闪点易燃液体，在人体内有蓄积性，为神经性毒剂。其蒸气或雾对眼睛、粘膜和呼吸道有刺激性，可引起周围神经炎，对皮肤有强烈刺激性。其次对环境有危害，对水体、土壤和大气可造成污染。并且石油醚能够对生产所需的有效成分造成灼伤，有效成分损失率在30％以上。用壳聚糖絮凝产生的絮凝物不易过滤，造成大量有效成分流失。使用石油醚和壳聚糖纯化造成的原料损失，其目前现有工艺中，最终得到的成品浓度均在0.5％以下，大量反复的提纯又会导致生产成本的大幅上升，很难满足实际的市场需求，这也是造成植物源农药川楝素难以实现大规模应用的关键所在。

发明内容

本发明为克服现有技术中缺陷，提供一种川楝素的低温提取纯化工艺，在纯化步骤中不使用石油醚壳聚糖等任何的有机溶剂，实现川楝素的高效提取和纯化，无污染无公害。为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：

一种植物源农药川楝素的低温提取纯化工艺，包括以下步骤：

(1)取川楝子果实干燥并粉碎，过筛，加入乙醇溶液充分浸泡，后进行逆流超声萃取，萃取温度不高于40℃，得到川楝子的乙醇粗提液；

(2)将乙醇粗提液进行过滤后，得到川楝子乙醇精提液，并置于储罐中存放；

(3)将川楝子乙醇精提液进行低温真空浓缩，真空度为-0.1MPa，真空浓缩至相对密度为1.2，得到川楝子浓缩液；

(4)将川楝子浓缩液置于冷凝罐中低温静置分层，静置时间不小于24h；

(5)静置分层后，将下层液体排出，储存备用；上层膏体按照1:10的固液比加入95％乙醇进行醇化，醇化时间为20分钟；醇化后的液体转移至醇沉罐再次静置分层，24小时后将下层絮凝物排出，上层乙醇清液回收；

(6)将下称液体和回收所得乙醇清液进行加热浓缩，温度不得高于32℃，最后浓缩得到相对密度为1的高浓度成品川楝素溶液，密封存放。

优选的，步骤(1)为过40目筛。

优选的，步骤(1)中乙醇溶液的浓度为75％，固液比为1:10。

优选的，步骤(1)中逆流超声萃取的萃取时间不少于90min。

优选的，步骤(3)中采用冷凝水进行降温，冷凝水温度不高于-3℃。

冷凝水中可以添加乙二醇等防冻液成分，防止冷凝水结冰。

优选的，所述川楝素溶液的使用方法为将川楝素添加乳化剂等必要的辅料配置成0.5％的水乳剂进行使用。辅料可包括乳化剂、表面活性剂等辅助成分。

具体制备方法参考如下：

将川楝素溶液适量添加H77表面活性剂，渗透剂，柠檬烯在30℃温度条件下，每分钟7000－8000转高速乳化机乳化20分钟即可。

步骤(2)中过滤采用两步过滤的方式，首先采用600目不锈钢滤网进行过滤，再使用精密过滤器进行二次过滤。

本发明步骤(6)所得成品川楝素溶液浓度≥1％。

目前，现有技术中对于川楝素的纯化工艺均采用石油醚或者壳聚糖净化的方式，同等质量的川楝子，采用现有技术的纯化工艺，在纯化过程中会造成大量的成分流失，其最终达到的母液产品浓度远远达不到0.5％，而市场需求至少将川楝素配置为0.5％的水乳剂微乳剂等形式才能使用，那么为了提高母液的浓度，必然要加大川楝子的使用量，而本身植物源农药的售价就高于普通矿物源或者化学合成农药，这样大幅提升原料的用量，最终导致的就是安全无公害的植物源农药难以得到实际的应用的推广，长久停留在实验室研究阶段，实现不了其应有的经济价值和社会效益。

有益效果

本发明采用低温提纯纯化川楝素，通过真空浓缩至标准密度，实现川楝子乙醇精提液的快速分层，在将上层浸膏再次醇提，实现川楝素的高效提取，所得川楝素母液的浓度≥1％。整个工艺过程不使用石油醚、壳聚糖等成分，大大减少有机溶剂使用带来的污染和不安全性，简化工艺流程并减少川楝素的流失，大幅降低植物源农药的生产成本，促进植物源农药是市场化应用，具有广阔的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为本发明低温真空浓缩采用的冷凝器示意图；

图2为本发明植物源农药川楝素的低温提取纯化工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。

实施例1

一种植物源农药川楝素的低温提取纯化工艺，包括以下步骤：

(1)取川楝子果实干燥并粉碎，过筛，加入乙醇溶液充分浸泡，后进行逆流超声萃取，萃取温度25℃，得到川楝子的乙醇粗提液；

(2)将乙醇粗提液进行过滤后，得到川楝子乙醇精提液，并置于储罐中存放；

(3)将川楝子乙醇精提液进行低温真空浓缩，真空度为-0.1MPa，真空浓缩至相对密度为1.2，得到川楝子浓缩液；

(4)将川楝子浓缩液置于冷凝罐中低温静置分层，静置时间24h；

(5)静置分层后，将下层液体排出，储存备用；上层膏体按照1:10的固液比加入95％乙醇进行醇化，醇化时间为20分钟；醇化后的液体转移至醇沉罐再次静置分层，24小时后将下层絮凝物排出，上层乙醇清液回收；

(6)将下层液体和回收所得乙醇清液进行加热浓缩，温度30-32℃，最后浓缩得到相对密度为1的高浓度成品川楝素溶液，密封存放。

步骤(1)为过40目筛。

步骤(1)中乙醇溶液的浓度为75％，固液比为1:10。

步骤(1)中逆流超声萃取的萃取时间不少于90min。

步骤(3)中采用冷凝水进行降温，冷凝水温度不高于-3℃。

所述川楝素溶液的使用方法为将川楝素添加乳化剂等必要的辅料配置成0.5％的水乳剂进行使用。

步骤(2)中过滤采用两步过滤的方式，首先采用600目不锈钢滤网进行过滤，再使用精密过滤器进行二次过滤。

实施例2

一种植物源农药川楝素的低温提取纯化工艺，包括以下步骤：

(1)取川楝子果实干燥并粉碎，过筛，加入乙醇溶液充分浸泡，后进行逆流超声萃取，萃取温度30℃，得到川楝子的乙醇粗提液；

(2)将乙醇粗提液进行过滤后，得到川楝子乙醇精提液，并置于储罐中存放；

(3)将川楝子乙醇精提液进行低温真空浓缩，真空度为-0.1MPa，真空浓缩至相对密度为1.2，得到川楝子浓缩液；

(4)将川楝子浓缩液置于冷凝罐中低温静置分层，静置时间24h；

(5)静置分层后，将下层液体排出，储存备用；上层膏体按照1:10的固液比加入95％乙醇进行醇化，醇化时间为20分钟；醇化后的液体转移至醇沉罐再次静置分层，24小时后将下层絮凝物排出，上层乙醇清液回收；

(6)将下层液体和回收所得乙醇清液进行加热浓缩，温度30-32℃，最后浓缩得到相对密度为1的高浓度成品川楝素溶液，密封存放。

步骤(1)为过40目筛。

步骤(1)中乙醇溶液的浓度为75％，固液比为1:10。

步骤(1)中逆流超声萃取的萃取时间不少于90min。

步骤(3)中采用冷凝水进行降温，冷凝水温度不高于-3℃。

所述川楝素溶液的使用方法为将川楝素添加乳化剂等必要的辅料配置成0.5％的水乳剂进行使用。

步骤(2)中过滤采用两步过滤的方式，首先采用600目不锈钢滤网进行过滤，再使用精密过滤器进行二次过滤。

实施例3

一种植物源农药川楝素的低温提取纯化工艺，包括以下步骤：

(1)取川楝子果实干燥并粉碎，过筛，加入乙醇溶液充分浸泡，后进行逆流超声萃取，萃取温度40℃，得到川楝子的乙醇粗提液；

(2)将乙醇粗提液进行过滤后，得到川楝子乙醇精提液，并置于储罐中存放；

(3)将川楝子乙醇精提液进行低温真空浓缩，真空度为-0.1MPa，真空浓缩至相对密度为1.2，得到川楝子浓缩液；

(4)将川楝子浓缩液置于冷凝罐中低温静置分层，静置时间24h；

(5)静置分层后，将下层液体排出，储存备用；上层膏体按照1:10的固液比加入95％乙醇进行醇化，醇化时间为20分钟；醇化后的液体转移至醇沉罐再次静置分层，24小时后将下层絮凝物排出，上层乙醇清液回收；

(6)将下层液体和回收所得乙醇清液进行加热浓缩，温度30-32℃，最后浓缩得到相对密度为1的高浓度成品川楝素溶液，密封存放。

步骤(1)为过40目筛。

步骤(1)中乙醇溶液的浓度为75％，固液比为1:10。

步骤(1)中逆流超声萃取的萃取时间不少于90min。

步骤(3)中采用冷凝水进行降温，冷凝水温度不高于-3℃。

所述川楝素溶液的使用方法为将川楝素添加乳化剂等必要的辅料配置成0.5％的水乳剂进行使用。

步骤(2)中过滤采用两步过滤的方式，首先采用600目不锈钢滤网进行过滤，再使用精密过滤器进行二次过滤。

本发明工艺步骤中，低温真空浓缩采用常规冷凝器，为通用设备，其结构示意图，如图1所示；罐身设置有进出水口，实现壳体的冷凝水冷却。罐体下部设置出料口，直通罐体内部，用于下层料液的排出。

对比例1

一种植物源农药川楝素的低温提取纯化工艺，包括以下步骤：

(1)取川楝子果实干燥并粉碎，过筛，加入乙醇溶液充分浸泡，后进行逆流超声萃取，萃取温度40℃，得到川楝子的乙醇粗提液；

(2)将乙醇粗提液进行过滤后，得到川楝子乙醇精提液，并置于储罐中存放；

(3)将川楝子乙醇精提液进行低温真空浓缩，真空度为-0.1MPa，真空浓缩至相对密度为0.8，得到川楝子浓缩液；

(4)将川楝子浓缩液置于冷凝罐中低温静置分层，静置时间24h；

(5)静置分层后，将下层液体排出，储存备用；上层膏体按照1:10的固液比加入95％乙醇进行醇化，醇化时间为20分钟；醇化后的液体转移至醇沉罐再次静置分层，24小时后将下层絮凝物排出，上层乙醇清液回收；

(6)将下层液体和回收所得乙醇清液进行加热浓缩，温度不得高于32℃，最后浓缩得到相对密度为1的高浓度成品川楝素溶液，密封存放。

步骤(1)为过40目筛。

步骤(1)中乙醇溶液的浓度为75％，固液比为1:10。

步骤(1)中逆流超声萃取的萃取时间不少于90min。

步骤(3)中采用冷凝水进行降温，冷凝水温度不高于-3℃。

所述川楝素溶液的使用方法为将川楝素添加乳化剂等必要的辅料配置成0.5％的水乳剂进行使用。

步骤(2)中过滤采用两步过滤的方式，首先采用600目不锈钢滤网进行过滤，再使用精密过滤器进行二次过滤。

本对比例工艺步骤基本同实施例3，唯一不同的是步骤(3)真空浓缩至相对密度为1。

对比例2

本对比例工艺步骤基本同实施例3，唯一不同的是步骤(3)真空浓缩至相对密度为1.5。

对比例3

本对比例工艺步骤基本同实施例3，唯一不同的是步骤(3)真空浓缩至相对密度为1.8。

对比例4

本对比例选用与本发明实施例和对比例等质量的川楝子，但采用现行石油醚提取纯化。可参照CN201710888534.6中所述方法。

一、性能测试

对本发明实施例1-3以及对比例1-4所得川楝素母液进行性能测试，测试方法参考企业标准《1％川楝素母药》Q/LYKN 001-2019、《0.5％川楝素水乳剂》Q/LYKN 002-2019。

液相色谱法

方法提要

试样用甲醇溶解，以乙腈+水＝30+70(V/V)为流动相，使用以C18为填充物的不锈钢柱和可变波长紫外检测器，对试样中的川楝素进行高效液相色谱分离和测定，外标法定量。

试剂

甲醇：色谱纯；

乙腈：色谱纯；

水：新蒸二次蒸馏水；

川楝素标样：已知准确质量分数，ω≥99.9％。

仪器

高效液相色谱仪：具有可变波长紫外检测器；

色谱工作站；

色谱柱：250mm×4.6mm(i.d.)不锈钢柱，内装C18填充物，粒径5μm；

微量进样器：20μL；

定量进样管：10μL；

过滤器：滤膜孔径约0.45μm；

超声波清洗器。

液相色谱操作条件

流动相：乙腈+水＝30+70(V/V)，经滤膜过滤，并进行脱气；

流速：1.0mL/min；

柱温：35℃；

检测波长：210nm；

进样体积：10μL；

保留时间：川楝素约为22.6min，川楝素的异构体28.7min。

标准曲线

标样溶液的制备

称取0.01g川楝素标样(精确至0.00001)，置于20mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，备用。

试样溶液的制备

称取含川楝素0.01g(精确至0.0001g)的试样，置于20mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，过滤，滤液备用。

测定

上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻两针川楝素峰面积的相对响应值变化小于1.5％，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

计算

将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中川楝素峰面积分别进行平均。试样中川楝素的质量分数按式(1)计算：

式中：

ω

A

m

ω——标样中川楝素的质量分数，以％表示；

A

m

pH值的测定

按GB/T 1601-1993进行。

丙酮不溶物质量分数的测定

按GB/T 19138-2003进行。

性能测试结果如表1所示：

表1母液性能测试

二、大田应用试验

将本发明实施例3配制成0.5％的水乳剂，验证其防治蔬菜烟粉虱、黄曲条跳甲的药效。

1试验条件

1.1试验对象和作物：烟粉虱(黄瓜)、黄曲条跳甲(青菜)。

1.2环境或设施栽培条件试验设在山东寿光市某蔬菜地大棚内，大棚栽培，黄瓜处于结果期、青菜处于叶片6-7叶期。

2试验设计和安排

2.1.1供试药剂：0.5％川楝素水乳剂(AS)，临沂康农生物科技有限公司产品。

2.1.2对照药剂：

烟粉虱:1.8％阿维菌素乳油(EC)，上海悦联化工有限公司产品；

黄曲条跳甲：25克/升联苯菊酯乳油(EC)，山东邹平县绿大药业有限公司产品；

40％啶虫脒水分散粒剂(WG)，青岛瀚生生物科技有限公司产品。

另设空白对照。

表2供试药剂实验设计(烟粉虱)

表3供试药剂实验设计(黄曲条跳甲)

3.2小区安排

3.2.1小区排列-本试验为趋势试验，不设重复，烟粉虱在黄瓜上试验，用目测法；黄曲条跳甲在青菜上试验了二次，一次用联苯菊酯做对照，另一次用啶虫脒做对照。

3.3施药方法

3.3.1使用方法、喷雾。

3.3.2施药器械﹑山东卫士植保机械有限公司生产的卫土牌WS-16型背负式行动手动喷雾器，喷孔直径0.7mm。

3.3.3施药时间和次数施药时间:烟粉虱、黄曲条跳甲在成虫发生盛期，施药时黄瓜处于结果期、青菜处于6-7叶期。

施药次数:烟粉虱只施药一次，黄曲条跳甲用联苯菊酯做对照的那次用药一次；用啶虫脒做对照的施药二次，二次施药之间的间隔时间为6天。

3.3.4使用容量﹑按试验规定的剂量喷至叶面微滴水为度。

3.3.5防治其他病虫害的药剂资料，试验前10天和试验期间未用其它药剂防治过其它病虫害。

4调查方法、时间和次数

4.1调查时间和次数﹐药前调查虫口基数，药后1、3、7天3次调查残虫量。

4.2调查方法﹐每处理五点取样法，每点2株，每小区共查10株，烟粉虱每株调查3张叶片，黄曲条跳甲调查整株青菜上的成虫量。药前查基数，药后调查残留活虫数，与空白区比较计算防效。

4.2.3药效计算方法

虫口减退率(％)＝(施药前虫数-施药后虫数)/施药前虫数×100％

校正防治(％)＝(施药区虫口减退率-空白对照区虫口减退率)/(100-空白对照区虫口减退率)×100％

表4防治黄瓜烟粉虱趋势性实验结果

表5防治青菜黄曲跳甲趋势性实验结果(施药1次)

表5防治青菜黄曲跳甲趋势性实验结果(施药2次)

结果与评价

黄瓜烟粉虱：0.5％川楝素AS使用2000倍液、1000倍液两个剂量防治黄瓜烟粉虱，防效随用药量的增加而提高，速效性较好、持效期较长，第一次药后1天分别为80.59％、86.50％；药后3天分别为79.07％、83.57％；药后7天的防效分别为72.40％、79.26％；对照药剂1.8％阿维菌素EC使用800倍，第一次药后1、3、7天的校正防效分别为79.77％、73.53％、66.04％。

青菜黄曲条跳甲∶0.5％川楝素AS使用2000倍液、1000倍液两个剂量防治青菜黄曲条跳甲防效随用药量的增加而提高，速效性较好、持效期较长。

1次施药的校正防效，药后1天分别为80.87％、83.20％；药后3天分别为75.90％、78.96％，药后7天分别为68.06％、71.47％；对照药剂25克/升联苯菊酯EC使用1667倍，药后1、3、7天的校正防效分别为77.68％、68.59％、60.70％。2次施药，第2次药后5天的校正防效为80.67％、84.42％，对照药剂40％啶虫胀WG使用2次，第2次药后5天的校正防效为76.96％。

安全性：供试药剂在试验剂量范围内对三种作物安全，无药害症状。

结论：烟粉虱和黄曲条跳甲是为害蔬菜的猖獗性害虫，本地区周年发生，在重发性季节每5-7天用药1次，现生产上常规药剂的防效为70％左右。本次供试的0.5％川楝素AS使用1000-2000倍的防效在80％左右，与本地常规药剂的防效相当，速效性较好、持效期较长，对作物安全。

需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。