大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的重组载体、基因工程菌及其应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体公开了一种大熊猫轮状病毒CH‑1毒株VP7蛋白的重组载体、基因工程菌及其应用。本发明的重组载体，含有大熊猫轮状病毒CH‑1毒株VP7蛋白的编码基因。含有本发明重组载体的工程菌表达的大熊猫轮状病毒CH‑1毒株VP7蛋白具有良好的生物活性和免疫原性，蛋白表达量大，极大降低了生产成本，为大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus，GPRV)CH‑1毒株的检测试剂盒的研制奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的重组载体、基因工程菌及其应用。

背景技术

大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus，GPRV)CH-1毒株首次由王成东等于2009年首次从大熊猫腹泻粪便中检测并分离出。该毒株可以引起幼龄大熊猫(5～11月龄)发生传染性及顽固性腹泻，导致多器官衰竭死亡，对大熊猫种群的扩大产生一定的影响。目前尚无有效疫苗和特效药物对GPRV感染进行防治，这对大熊猫的健康造成了严重威胁。

轮状病毒属于呼肠弧病毒科、轮状病毒属，其基因组含11个节段的dsRNA。该病毒的形态呈车轮状，无囊膜，由三层蛋白衣壳组成，分别是VP7、VP4和VP6蛋白。VP7是由基因9(或7、8)编码的一种糖蛋白，是轮状病毒的重要保护抗原。VP7蛋白能够独立诱导机体产生中和抗体，决定病毒的G血清型。但目前，关于大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus，GPRV)CH-1毒株的体外快速检测试剂盒尚无，因此建立大熊猫轮状病毒(giant pandarotavirus，GPRV)CH-1毒株VP7蛋白的体外表达系统对大熊猫轮状病毒(giant pandarotavirus，GPRV)CH-1毒株的快速检测方法研制至关重要。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的重组载体、基因工程菌及其应用，含有本发明重组载体的基因工程菌表达的大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白具有良好的生物活性和免疫原性。

本发明的第一方面，提供了一种重组载体，其中，含有大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的编码基因。

作为本发明所述重组载体的优选实施方式，所述重组载体为将所述大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的编码基因插入到出发载体上得到的重组载体。所述的出发载体可以为本领域常规的载体，如市售的质粒、噬菌体或病毒载体等。

作为本发明所述重组载体的优选实施方式，所述出发载体为质粒。所述质粒优选为pColdⅡ。

本发明的第二方面，提供了一种表达大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的基因工程菌，基因工程菌含有大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的编码基因。

作为本发明所述基因工程菌的优选实施方式，所述基因工程菌为将含有大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白编码基因的重组载体导入宿主菌得到的。

作为本发明所述基因工程菌的优选实施方式，所述宿主菌为大肠杆菌。所述宿主菌优选为大肠杆菌pTf16/BL21(DE3)感受态。

作为本发明所述基因工程菌的优选实施方式，所述大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因。

作为本发明所述基因工程菌的优选实施方式，所述大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白为氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的蛋白质，或SEQ ID NO:2经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白活性的蛋白质。

本发明的第三方面，提供了一种表达大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将上述的重组载体导入到宿主菌中。

本发明的第四方面，提供了一种大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的制备方法，其特征在于，利用上述的基因工程菌诱导表达，收集菌体并破碎，收集包涵体，然后将获得的包涵体溶解复性，即得。

本发明的第五方面，提供了一种大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白在制备检测试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明采用大肠杆菌表达系统表达大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus，GPRV)CH-1毒株VP7蛋白，蛋白表达量大，纯化方法简单，极大降低了生产成本，有利于推进之后的大批量生产；

2)本发明利用大肠杆菌原核表达系统，以包涵体的形式表达了大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株VP7蛋白，该蛋白具有较好的生物活性和免疫原性，极大降低了生产成本，为大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株的检测试剂盒的研制奠定了基础。

附图说明

图1为大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株VP7蛋白纯化后SDS-PAGE胶染色图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中的大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

实施例1、表达大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的基因工程菌表达载体的构建

1.目的基因合成

委托广州艾基生物技术有限公司合成大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白编码基因序列(如SEQ ID NO:1所示)，并在大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白编码基因序列的5’端加XhoI酶切序列(CTCGAG)，3’端加EcoRI酶切序列(GAATTC)。随后用XhoI酶(TaKaRa)和EcoRI酶(TaKaRa)分别双酶切pColdⅡ质粒和EcoRI酶切序列，用PCR产物纯化回收试剂盒分别回收双酶切产物。回收后用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化感受态E.coli DH5a。提取质粒经测序鉴定正确后，得到表达大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株VP7蛋白的重组载体，将重组质粒命名为pColdⅡ-GPRV-CH-1-VP7。

2.基因工程菌的筛选

将步骤(1)获得的质粒pColdⅡ-GPRV-CH-1-VP7转化入大肠杆菌感受态pTf16/BL21(DE3)；获得表达大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株VP7蛋白的基因工程菌，将其命名为E.coli-GPRV-CH-1-VP7；

3.包涵体诱导表达：将步骤2获得的基因工程菌E.coli-GPRV-CH-1-VP7进行培养，利用IPTG诱导表达蛋白；

4.包涵体纯化：离心收集步骤3获得的基因工程菌，超声破碎菌体，离心弃上清，刮去沉淀上层的菌泥，收集包涵体；

5.包涵体变性及复性：用包涵体溶解液溶解包涵体，将溶解后的包涵体缓慢加入包涵体复性液进行稀释复性，4℃搅拌48h；其中复性液的配方为：50mM Tris-HCl，400mM L-精氨酸，pH调至8.0；

6.浓缩纯化：将置换液缓慢加入包涵体复性液中，4℃浓缩，最后得到浓缩的大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株VP7蛋白；其中，置换液的配方为：20mM Tris-HCL，50mM NaCl，pH调至8.0。

其中，大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株VP7蛋白纯化后SDS-PAGE胶染色图如图1所示。

实施例2、动物实验

将80μg大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株VP7蛋白与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化后,采用背部皮下四点注射Balb/C小鼠，三周后用100μg大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株VP7蛋白与弗氏不完全佐剂混合后同法进行第二次免疫，以后每两周免疫一次，免疫3次后，血清效价达到1：640000以上。

将600μg大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株VP7蛋白与等量弗氏完全佐剂混合,完全乳化后，采用背部皮下四点和腿弯胭淋巴结两点注射大白兔，三周后用800μg大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株VP7蛋白与弗氏不完全佐剂混合后同法进行第二次免疫，以后每两周免疫一次，共免疫5次，5免血清效价达到1：1280000以上。

经动物实验验证，用本发明制备的大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)CH-1毒株VP7蛋白免疫小鼠和兔，均可产生高水平抗体，为检测方法的建立奠定了基础。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州优迪生物科技股份有限公司

<120> 大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的重组载体、基因工程菌及其应用

<130> 2020.12.29

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 1042

<212> DNA

<213> 大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白的编码基因

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ctatattatt tacagatttc tattaataac ggcagcacta cttgcattta caaaagcaca 180

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<212> PRT

<213> 大熊猫轮状病毒CH-1毒株VP7蛋白

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Ile Leu Phe Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Val Thr Arg Thr Met Asp Tyr

20 25 30

Ile Ile Tyr Arg Phe Leu Leu Ile Thr Ala Ala Leu Leu Ala Phe Thr

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50 55 60

Thr Ala Tyr Ala Asn Ser Thr Gln Glu Glu Thr Phe Leu Thr Ser Thr

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Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Ser Ser Ile Val Asp Phe Ser

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Asp Gln Asn Leu Glu Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu

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Ile Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Thr Leu Gly Ile Gly Cys Gln

195 200 205

Thr Thr His Val Asp Ser Phe Glu Ile Val Ala Glu Asn Glu Lys Leu

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Ala Ile Val Asp Val Val Asp Gly Ile Asp His Lys Ile Asn Leu Thr

225 230 235 240

Thr Thr Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu

245 250 255

Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Ser Asp Ile Leu Asp Ile Thr

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Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asn Ala Ala

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Ala Phe Tyr Tyr Arg Val

325