南松大小蠹的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针

摘要

本发明提供了一种南松大小蠹的检测方法，经试验筛选的特异性引物(NS‑F和NS‑R)和探针(NS‑P)组合在Taq‑Man实时荧光定量PCR方法中可达到鉴定南松大小蠹的目的。本发明适用于不同状态大小蠹的检疫鉴定，弥补了常规形态学鉴定方法的不足，与现有技术中运用的DNA条形码鉴定技术相比，引物和MGB探针特异性强、灵敏度高、实验操作简单、用时短；鉴定结果直观，观察扩增曲线即可得出结果。本研究不但能满足进出境原本的快速通关的要求，提高检出率，同时能够有效预防危险性大小蠹的入侵和扩散，对保护我国农林业生产和生态安全具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物物种分子鉴定技术领域，涉及一种大小蠹的实时荧光PCR检测方法，具体涉及南松大小蠹的实时荧光PCR检测方法及其应用；此外，本发明还涉及检测南松大小蠹的引物和探针。

背景技术

大小蠹属Dendroctonus隶属于鞘翅目Coleoptera、象甲科Curculionidae、小蠹亚科Scolytinae，是一类重要的森林生态系统蛀干害虫，其主要对松属、云杉属、黄杉属等林木造成危害，该属(非中国种)已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录。全世界大小蠹属已知共20种，其中中、北美洲分布18种，欧洲、亚洲现分布3种。大小蠹属非中国种害虫南松大小蠹Dendroctonus frontalis原产于美国，不仅是危害松类针叶树种的蛀干害虫，而且传播蓝霉菌，破坏传播水分的木质部，造成树木死亡。

研究结果表明，南松大小蠹在我国可能适宜定殖的地区范围较广，包括安徽中北部、湖北中北部、四川部分地区、云南部分地区、山西南部等。随着我国对外贸易的日益频繁，进口木材数量与日俱增，口岸截获的害虫种类和数量不断增加，故对其进行快速准确的检疫鉴定对预防检疫性种类入侵有重要的意义。

目前针对大小蠹属种类，基于外部形态特征进行鉴定仍是检疫系统最常用的方法。然而，形态学鉴定主要以成虫为研究对象，口岸截获的大小蠹中有相当一部分为幼虫，蛹或者部分破碎的成虫，使得形态学鉴定难以实现准确鉴定。不仅如此，大小蠹属害虫的种间形态相似，差异较小，鉴定较为困难，对鉴定人员经验和分类基础要求较高。因此，探索新的方法弥补形态鉴定的不足显得尤为重要和迫切。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，如DNA条形码技术、常规PCR检测技术、实时荧光定量PCR检测技术、限制性片段长度多态性(RFLP)技术及微卫星技术等多种技术逐渐应用于物种的分子鉴定方法当中。但国内对于大小蠹的分子鉴定技术研究报道仍旧较少，殷玉生等基于线粒体COI基因对我国口岸经常截获的6种大小蠹属昆虫快速鉴定的可行性和准确性进行了研究(详见：殷玉生，张帆，安榆林.基于线粒体COI基因鉴定大小蠹属昆虫[J].福建林业科技，2014，41(01)：63-67.)；花婧等通过线粒体COI基因867bp片段序列对大小蠹属17个种类进行序列分析，表明COI基因可作为大小蠹属昆虫分类的依据(详见：花婧，郑斯竹，安榆林，杨晓军.基于线粒体COⅠ基因的大小蠹属昆虫DNA条形码研究[J].江苏农业科学，2014，42(03)：30-32.)；田虎等基于DNA条形码技术表明mtDNA COI基因5'端和3'端序列均可有效区分红翅大小蠹与黑脂大小蠹(详见：田虎，于培文，娄巧哲，徐志彬，杨晓丽，王新军，郝常，郭扬振.基于DNA条形码的红翅大小蠹和黑脂大小蠹分子鉴定[J].植物检疫，2020，34(01)：30-34.)。但目前大小蠹分子鉴定尚未进行实时荧光PCR快速鉴定技术研究。

实时荧光定量PCR是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，因其技术具有准确、特异、灵敏和快速等优点，在近几年已被广泛应用于生物学、医学、农业、食品、环保等多个领域中。在昆虫检疫领域该方法也得到了广泛地应用，如陈岩等根据火蚁属COI基因序列，设计了对红火蚁具有特异性的引物与TaqMan探针，可对不同虫态的红火蚁进行鉴定(详见：陈岩，陈乃中，朱水芳，陈洪俊.红火蚁实时荧光分子检测方法[J].植物检疫，2005(04)：204-206.)；Feng等根据三叶草斑潜蝇的保守区序列设计了1对引物与特异性TaqMan探针并建立了三叶草斑潜蝇实时荧光定量PCR鉴定体系，可以准确鉴定各种虫态的三叶草斑潜蝇(详见：XianFeng，ChenNai-Zhong，Ma Jun，Zhu Shui-fang，HuXue-nan.Molecular identification of Liriomyza trifolii(Burgess)(Dipt.,Agromyzidae)based onreal-time PCR[J].Journal ofApplied Entomology，2007，131(8).)；姜帆基于DNA条形码序列，设计并筛选出27种我国主要检疫性实蝇种特异性引物和特异性TaqMan-MGB探针(详见：姜帆.我国检疫性实蝇分子鉴定技术体系的研究[D].中国农业大学，2015.)；徐浪等应用TaqMan实时荧光PCR方法实现了对新菠萝灰粉蚧和菠萝灰粉蚧进行快速准确鉴定(详见：徐浪，林伟，黄蓬英，张伟锋，卢小雨，汪莹，郑耘，焦懿，娄定风，余道坚.应用TaqMan MGB探针快速检测新菠萝灰粉蚧和菠萝灰粉蚧[J].植物检疫，2016，30(04)：38-41.)。

本发明人以南松大小蠹为研究对象，选取口岸经常截获的同属大小蠹害虫如黑脂大小蠹D.terebrans、红脂大小蠹D.valens、红翅大小蠹D.rufipennis、华山松大小蠹D.armandi、黄杉大小蠹D.pseudotsugae及另一小蠹科昆虫钝贵小蠹Gnathotrichusretusus作为对照，根据mtDNA COI基因序列设计特异性引物对和TaqMan探针，利用TaqMan实时荧光PCR技术建立了针对南松大小蠹的分子鉴定技术，得到了本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、准确的鉴定南松大小蠹的方法，为木材有害生物的检疫提供便利。

基于上述目的，本发明提供了一种南松大小蠹的检测方法，具体包括，

(1)设计引物和探针；

该引物和探针的序列为：

上游引物NS-F序列为：5'-AGCCTTATTGTTCGAACG-3'；

下游引物NS-R序列为：5'-GGCTCCTAATATTAGAGGAAC-3'；

探针引物NS-P序列为：5'-AACTCCAGGCAGACT-3'；

所述探针引物的5'端连接荧光基团FAM，3'端连接非荧光猝灭基团。

(2)提取南松大小蠹基因组DNA；

(3)采用步骤(1)中引物和探针进行实时荧光PCR检测，根据扩增曲线区分南松大小蠹和其他检疫性大小蠹昆虫。

作为本发明优选的技术方法，步骤(2)具体实施方法为：取供试南松大小蠹标本足或头胸部肌肉组织，进行基因组DNA的提取。

作为本发明优选的技术方法，步骤(3)所述实时荧光PCR检测方法反应体系组分包括：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)10μL、上游引物NS-F(10μM)0.4μL、下游引物NS-R(10μM)0.4μL、探针NS-P(10μM)0.8μL、ROX Reference Dye II(50×)0.2μL、DNA模板2μL、灭菌水6.2μL。

作为本发明优选的技术方法，步骤(3)所述实时荧光PCR检测方法反应程序为：95℃预变性30sec，95℃变性5sec，56℃退火30sec，变性-退火两个过程重复35个循环。

本发明采用的实时荧光PCR检测方法采用Taq-Man MGB探针。Taq-Man MGB探针是在普通Taq-Man探针基础上发展起来的一种新型探针，其与普通探针相比具有以下几个优点：3'端添加了Minor Groove Binder(MGB小型的凹槽结合物)分子，可与靶模板结合，增加了探针的Tm值，从而使其长度更短，仅13-18bp，显著降低了非特异性杂交的可能性；3'端采用本身不发光的猝灭基团且距离荧光报告基团更近，降低了非特异性的荧光本底信号，使实验结果更精确，同时提升了检测的灵敏度；检测组分的优化较为简单，减少检测体系建立的时间，提高了检测工作效率。

此外，本发明还提供一种用于检测南松大小蠹的引物，具体序列为：

上游引物NS-F序列为：5'-AGCCTTATTGTTCGAACG-3'；

下游引物NS-R序列为：5'-GGCTCCTAATATTAGAGGAAC-3'；

此外，本发明还提供一种用于检测南松大小蠹的探针，具体序列为：

5'-AACTCCAGGCAGACT-3'，其中，5'端连接荧光基团FAM，3'端连接非荧光猝灭基团。

此外，本发明还提供了一种用于检测南松大小蠹的试剂盒，该试剂盒包括引物和探针，所述引物和探针的具体序列如下：

上游引物NS-F序列为：5'-AGCCTTATTGTTCGAACG-3'；

下游引物NS-R序列为：5'-GGCTCCTAATATTAGAGGAAC-3'；

探针引物NS-P序列为：5'-AACTCCAGGCAGACT-3'；

所述探针的5'端连接荧光基团FAM，3'端连接猝灭基团。

本发明还提供了所述南松大小蠹的实时荧光PCR检测方法在木材有害生物检疫中的应用，具体的是用于松属Pinus类木材有害生物的检疫。

本发明提供的南松大小蠹的检测方法与现有技术相比，具有以下有益效果或者优点：

本发明提供了一种南松大小蠹的检测方法，经试验筛选的特异性引物(NS-F和NS-R)和探针(NS-P)组合在Taq-Man实时荧光定量PCR方法中可达到鉴定南松大小蠹的目的。本发明适用于不同状态大小蠹的检疫鉴定，弥补了常规形态学检疫鉴定方法的不足，与现有技术中运用的DNA条形码鉴定技术相比，引物和MGB探针特异性强、灵敏度高、实验操作简单、用时短；鉴定结果直观，观察扩增曲线即可得出结果。本研究不但能满足进出境原本的快速通关的要求，提高检出率，同时能够有效预防危险性大小蠹的入侵和扩散，对保护我国农林业生产和生态安全具有重要意义。

附图说明

图1为本发明中特异性引物(NS-F和NS-R)和探针(NS-P)在南松大小蠹mtDNA上的位置示意图。

图2为南松大小蠹引物(NS-F和NS-R)和探针(NS-P)组合实时荧光定量PCR特异性检测结果。

图中，A为黄杉大小蠹、B为红脂大小蠹、C为红翅大小蠹、D为华山松大小蠹、E为南松大小蠹、F为黑脂大小蠹、G为钝贵小蠹、H为ddH

图3为南松大小蠹实时荧光PCR检测方法灵敏度检测结果。

图中，A、B、C、D、E、F对应模板DNA浓度分别为8.8ng/μL、0.88ng/μL、0.088ng/μL、0.0088ng/μL、0.00088ng/μL，G对应表模板为ddH

具体实施方式

下面，结合附图对本发明的技术方案进行进一步的解释说明，但是，本发明并不限于下述的实施方式。

一种南松大小蠹的实时荧光PCR检测方法，具体包括如下步骤：

(1)设计引物和探针

下述为本发明所述南松大小蠹的检测方法所用特异性引物和探针的设计与合成过程。

利用MEGA6.0软件，将南松大小蠹D.frontalis、黄杉大小蠹D.pseudotsugae、红脂大小蠹D.valens、红翅大小蠹D.rufipennis、华山松大小蠹D.armandi、黑脂大小蠹D.terebrans、间大小蠹D.adjunctus、墨西哥松大小蠹D.approximatus、西部松大小蠹D.brevicomis、黑材松大小蠹D.jeffreyi、云杉大小蠹D.micans、深沟大小蠹D.murrayanae、山松大小蠹D.ponderosae、粗点大小蠹D.punctatus、落叶松大小蠹D.simplex、小墨西哥松大小蠹D.mexicanus、平行大小蠹D.parallelocollis、嗜根大小蠹D.rhizophagus的mtCOI基因(线粒体DNA)序列进行比对。根据比对结果人工寻找南松大小蠹的特异性位点并在特异性位点上下游设计种特异性引物。利用Primer Premier 5.0软件检查设计好的引物是否存在错配、二聚体和发夹结构，并用NCBI中提供的Blast程序检查是否存在同源序列。随后在南松大小蠹的特异性引物范围内(包括引物序列)，人工寻找能与其他物种区分开的突变位点；结合TaqMan-MGB探针设计原则，通过Primer Express 3.0软件(AppliedBiosystems)，在种特异性位点所在的位置设计探针。所设计的探针5'端荧光报告基团标记为FAM(羧基荧光素)。本发明所用特异性引物和MGB探针均由北京擎科生物科技有限公司合成。

本发明经筛选后获得一组可用于鉴定南松大小蠹的特异性引物和探针引物，其在南松大小蠹mtDNA上的位置如图1所示，具体序列如下：

上游引物NS-F序列为：5'-AGCCTTATTGTTCGAACG-3'；

下游引物NS-R序列为：5'-GGCTCCTAATATTAGAGGAAC-3'；

探针引物NS-P序列为：5'-AACTCCAGGCAGACT-3'；

其中，探针引物的5'端连接荧光基团FAM，3'端连接非荧光猝灭基团。

(2)提取南松大小蠹基因组DNA

具体的，本发明中供试昆虫均来自于口岸截获以及科研交流获得的大小蠹标本，具体信息如表1所示，所有标本于无水乙醇中浸泡并保存于-20℃冰箱：

表1供试虫源采集信息一览表

对试虫进行清洗并吸干表面水分后，利用电动组织研磨器(天根)对试虫进行充分研磨，采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)对供试昆虫进行基因组DNA的提取，根据实际情况使用方法有所改动。其具体过程如下：

1)移液枪吸取20μL缓冲液GA于干净的1.5mL离心管中；

2)剪取试虫的足，用灭菌水中冲洗后吸干多余水分，放置于1)中离心管，利用电动组织研磨器充分研磨，用180μL缓冲液GA清洗研磨棒并加入离心管中；

3)加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后56℃水浴至少3h，待组织完全溶解后简短离心；

4)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心；

5)加入20μL无水乙醇并充分振荡混匀15sec，简短离心；

6)将4)所得溶液全部加入至一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

7)加入500μL缓冲液GD到吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管；

8)加入600μL漂洗液PW到吸附柱中，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

9)重复步骤8)；

10)12000rpm空转2min，倒掉废液，将吸附柱置于室温下10min以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液；

11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50μLddH

12)将11)所得溶液再次加至吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集所得溶液；

13)标记好所得DNA溶液，分别取1μL用于琼脂糖凝胶电泳检测和核酸浓度测定仪的浓度测定，剩余溶液置于-20℃保存备用。

(3)实时荧光PCR检测

本发明人通过对实时荧光反应体系和扩增条件的不断优化，最终建立了南松大小蠹TaqMan-MGB探针两步法实时荧光PCR鉴定技术方法，其反应体系如下：

Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)10μL、上游引物NS-F(10μM)0.4μL、下游引物NS-R(10μM)0.4μL、探针NS-P(10μM)0.8μL、ROX Reference Dye II(50×)0.2μL、DNA模板2μL、灭菌水6.2μL。

其反应程序如下：

95℃预变性30sec，95℃变性5sec，56℃退火30sec，变性-退火两个过程重复35个循环。

采用本发明设计的TaqMan MGB探针NS-P和引物NS-F/NS-R组合，进行实时荧光定量PCR检测。如图2所示，仅南松大小蠹的扩增曲线存在特异性扩增，CT值为21.39，即从第21个循环开始荧光信号以指数形式增长，而其他种大小蠹和钝贵小蠹及ddH

实时荧光定量灵敏度检测结果如图3所示，当模板浓度分别为8.8ng/μL、0.88ng/μL、0.088ng/μL、0.0088ng/μL、0.00088ng/μL时，CT值分别为16.80、20.45、24.14、27.33、30.49，即当模板DNA浓度≥0.0088ng/μL时，有南松大小蠹特异性荧光信号产生。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围。