一种阿比多尔、利巴韦林、氯喹的HPLC-MS/MS检测方法

摘要

本发明具体涉及一种阿比多尔、利巴韦林、氯喹的HPLC‑MS/MS检测方法。根据新冠肺炎诊断方案中指出阿比多尔、利巴韦林、氯喹等作为抗新冠肺炎的潜在药物，并且临床治疗过程中多采用三种及以下的抗病毒药物进行治疗。本发明目的在于提供一种血清中阿比多尔、利巴韦林、氯喹的HPLC‑MS/MS检测方法，通过调整前处理方式有效的去除了血清提取液中的基质效应，提高了检测的灵敏度和准确度，该检测方法应用于临床常规检测对于指导医生合理制定给药方案具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于抗新冠药物检测技术领域，具体涉及一种生物样本中阿比多尔、利巴韦林、氯喹的HPLC-MS/MS检测方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

新型冠状病毒感染的肺炎疫情仍在不断蔓延，治疗新冠肺炎迫在眉睫。目前抗新型冠状病毒药物研究取得重大进展，潜在治疗药物有阿比多尔、利巴韦林、氯喹等。阿比多尔是一种抗病毒药物，在10～30μmoL浓度下，能有效抑制新冠病毒达60倍。利巴韦林为广谱抗病毒药，能抑制肌苷酸-5-磷酸脱氢酶，阻断肌苷酸转化为鸟苷酸，从而抑制病毒的RNA和DNA合成，对DNA病毒和RNA病毒均有抑制复制作用。氯喹的作用机制，提高pH值以抑制病毒侵入细胞的过程，改变病毒包膜的糖基化抑制病毒在细胞内的复制，从而影响病毒侵入细胞。

抗新冠病毒药物使用通常会采用单个药物或者联合用药的诊疗方案。由于抗新冠病毒药物使用可能会产生药物不良反应，对用量要求特别严格，用量过高会产生毒副作用，用量过低药效不明显，因此，定时检测患者体内阿比多尔、利巴韦林、氯喹的浓度，指导医生合理制定给药方案，对患者实现获得最佳疗效具有重要意义。通过检测抗新冠病毒血药浓度还可以及时发现病人在治疗过程中是否停药、减量或者超量服药，帮助病人正确认识服用药物。

临床或实验室诊断方法有高效液相色谱法、液相色谱-荧光检测法、气相色谱法、免疫比浊法、化学发光法及均相酶免疫法等。上述传统检测方法操作过程繁琐，但所选取的试剂在检测过程中发现药物信号和灵敏度较低，甚至无法满足检测需要。高效液相串联质谱法具有样品量少、操作简便快速，通量高，灵敏度高，特异性好等特点，是临床常规检测的理想选择方法。

目前能够同时检测阿比多尔、利巴韦林、氯喹HPLC-MS/MS方法未有报道。由于血清成分复杂，在进行定量分析时，杂质严重影响检测结果的灵敏度和准确度，所以为了降低检测时的基质效应，需要对血清进行除杂。常规蛋白沉淀法通常只能够除去血清蛋白，对血清中的磷脂、胆固醇、脂肪酸等杂质不能有效去除，导致基质效应偏高，影响检测结果的灵敏度和准确度。

发明内容

基于上述技术背景，本发明目的在于提供一种用于检测生物样本中多种抗新冠肺炎治疗药物的检测方法，具体提供了一种阿比多尔、利巴韦林、氯喹的HPLC-MS/MS检测方法。

基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种阿比多尔、利巴韦林、氯喹的HPLC-MS/MS检测方法，所述检测方法包括对生物样本进行前处理获取待测样本及液相质谱检测步骤；所述前处理方法中，包括采用树脂及去磷脂物质处理所述生物样本提取液的步骤。

本发明针对血清中上述三种药物检测的研究中发现，上述药物检测过程中主要检测信号影响来源于血液中的基质成分，采用传统的过滤膜方式也无法消除蛋白沉淀提取液中的影响物质。本发明针对具有影响的杂质成分进行了明确，确定上述杂质主要为脂肪酸类物质。针对该技术问题，本发明采用大孔树脂及去磷脂板对上述蛋白沉淀提取液进行处理，消除了检测杂质的同时不引起对待测药物的吸附作用，能够有效的提高检测灵敏度和准确度。

本发明第二方面，提供一种抗新冠病毒药物检测试剂盒，所述检测试剂盒中包括蛋白沉淀剂、大孔树脂及去磷脂板。

本发明的技术要点在于提供了一种提高消除血液基质中杂质影响的前处理方法，采用该前处理方法，本领域技术人员能够得到影响因素更少，提取更加充分的检测样品，基于该检测样品，本领域技术人员可通过常规检测手段，如液相、紫外分光检测等检测待测样品中药物的浓度。基于上述前处理方法，本发明提供一种用于抗新冠病毒药物检测试剂盒，该试剂盒主要用于血清的处理并获得待测样品。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

1)通过加入大孔树脂能够很好的除去血清中的杂质，减少基质效应的影响，提高信号；

2)通过去磷脂板过滤，能够有效去除磷脂，减少基质效应的影响，提高信号。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中所述100ng/mL阿比多尔质谱图；

图2为实施例1中所述100ng/mL利巴韦林质谱图；

图3为实施例1中所述100ng/mL利巴韦林质谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术尚未报道针对多种抗新冠肺炎药物进行检测的方法，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种阿比多尔、利巴韦林、氯喹的HPLC-MS/MS检测方法。

本发明第一方面，提供一种阿比多尔、利巴韦林、氯喹的HPLC-MS/MS检测方法，所述检测方法包括对生物样本进行前处理获取待测样本及液相质谱检测步骤；所述前处理方法中，包括采用树脂及去磷脂物质处理所述生物样本提取液的步骤。

优选的，所述生物样本为包括但不限于生物大分子、细胞、组织、器官等样本，包括人体器官组织、全血、血浆、血清、生物体液或经处理过的生物样本(DNA、RNA、蛋白)等。

进一步的，所述生物样本为血液样本，即全血、血浆、血清中的一种。

本发明较好的实施方式中，所述生物样本为血清。

本发明研究过程中发现，针对血清中阿比多尔、利巴韦林、氯喹三种药物的检测，主要检测杂质来源于血清中的脂肪酸、磷脂等物质。针对该技术问题，本发明联想到采用树脂等对提取液进行极性吸附，最终实现降低基质效应，提高了检测灵敏度和准确度。

优选的，前处理方法如下：向生物样本中加入乙腈的内标工作液充分混合获取提取液，并向其中加入大孔树脂处理，离心获取上清，通过磷脂吸附物质进一步处理所述上清得到待测样品。

进一步的，所述生物样本与乙腈的内标工作液的体积比为1：3～5。

进一步的，所述去磷脂物质包括但不限于通过物理去除、化学改性或酶改性方式去除磷脂的物质。

本发明提供效果较好的实施方式中，采用物理去除方法对上述提取液进行处理，去除效果良好，同时也不会再次引入杂质。所述物理去除方式为采用去磷脂板过滤所述提取液。

上述优选的技术方案的一种具体实施方式中，所述前处理方法步骤如下：向血清样本中加入3～5倍体积的乙腈内标工作液，涡旋4～8min，向其中加入大孔树脂继续涡旋4～8min；离心获取上清液，将所述上清液加入去磷脂板中，通过正压装置过滤获取待测样品。

优选的，所述液相的流动相参数如下：流动相A为甲酸铵的水溶液；流动相B为甲酸铵的乙腈溶液。

进一步的，所述流动相A为0.8～1.2mM的甲酸铵水溶液。

进一步的，所述流动相B为0.8～1.2mM的甲酸铵乙腈溶液。

优选的，所述液相流速为0.4～0.6mL/min。

优选的，所述色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料柱子。

优选的，所述柱温为35-45℃，进一步优选为40℃。

优选的，所述液相梯度洗脱分离，所述梯度洗脱程序如下：0～0.3min，75％A→2％A；0.3～2.0min，2％A→2％A；2.0～2.3min，2％A→75％A；2.3～4min，75％A→stop。

优选的，所述质谱采用电喷雾ESI源正负离子混合扫描模式。

优选的，所述离子源温度为280～320℃，具体为300℃。

优选的，所述喷雾电压为4300～4700V，具体为4500V。

优选的，所述质谱采用MRM模式采集数据，具体参数如下：

本发明第二方面，提供一种抗新冠病毒药物检测试剂盒，所述检测试剂盒中包括蛋白沉淀剂、大孔树脂及去磷脂板。

优选的，所述试剂盒中，还包括血液样本采集装置，进一步的，所述血液样本采集装置包括但不限于采血针和/或采血管。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1.样品前处理

1)首先用乙腈配制内标工作液，备用。

2)向1.5mL离心管中加入100uL的血清样本，再加入400uL的乙腈内标工作液，涡旋5min；

3)向离心管中加入0.01mg大孔树脂，涡旋5min；

4)12000r/min离心5min；

5)取上清液200uL加入96孔去磷脂板中，利用正压装置将液体压入96孔板中；

6)覆上铝箔封膜，供色谱进样分析。

2.仪器方法

包括液相方法和质谱方法，具体为：

a液相方法：

流动相A：含1mM的甲酸铵水溶液；流动相B：含1mM甲酸铵的乙腈；流速0.5/min，进样量5μL，柱子型号为Discovery C18,5μm，50×2.0mmI.D.，柱温：40℃。梯度洗脱程序如表1所示。

表1梯度洗脱程序

b质谱方法：采用电喷雾ESI源正负离子混合扫描模式，离子源温度300℃，喷雾电压为4500V；采用MRM模式采集数据，条件如下：

表2质谱条件

3.实验结果

a.①由于大孔树脂有可能会吸附阿比多尔、利巴韦林、氯喹降低药物检测的信号，因此对比了乙腈溶解混标与乙腈溶解混标后加入大孔树脂(涡旋5min)的峰面积，如表3所示。发现添加大孔树脂对阿比多尔、利巴韦林、氯喹几乎没有吸附。

表3乙腈溶解混标与乙腈溶解混标后加入大孔树脂的峰面积对比表

②对比了蛋白沉淀法与蛋白沉淀法后加入大孔树脂(涡旋5min)的基质效应，如表4所示。发现添加大孔树脂能减少基质效应对阿比多尔、利巴韦林、氯喹的影响。

表4蛋白沉淀法与蛋白沉淀法后加入大孔树脂的基质效应对比表

③由于去磷脂板有可能会吸附阿比多尔、利巴韦林、氯喹降低药物检测的信号，因此对比了乙腈溶解混标与乙腈溶解混标过去磷脂板的峰面积，如表5所示。发现去磷脂板对阿比多尔、利巴韦林、氯喹几乎没有吸附。

表5乙腈溶解混标与乙腈溶解混标过去磷脂板的峰面积对比表

④对比了蛋白沉淀法与蛋白沉淀法后过去磷脂板的基质效应，如表6所示。发现添加蛋白沉淀法后过去磷脂板能减少基质效应对阿比多尔、利巴韦林、氯喹的影响。

表6蛋白沉淀法与蛋白沉淀法后加入大孔树脂的基质效应对比表

⑤通过蛋白沉淀法加入大孔树脂再过去磷脂板的基质效应，如表7所示。发现通过蛋白沉淀法加入大孔树脂再过去磷脂板基质效应几乎接近1，表明了杂质对阿比多尔、利巴韦林、氯喹的影响很小，血清去除杂质很干净。

表7蛋白沉淀法加入大孔树脂再过去磷脂板的峰面积和基质效应表

b标曲线性：

向牛血清中添加混标，使阿比多尔、利巴韦林、氯喹浓度依次为500ng/mL、500ng/mL、500ng/mL。采用用牛血清为稀释液依次对牛血清混标液按1:1等比稀释，共6个浓度梯度，用蛋白沉淀法提取样本，上级检测。

用数据处理软件对数据处理，所得标曲线性为：阿比多尔：y＝0.9976x-0.1648，R

c.定量限

空白血清中分别添加阿比多尔、利巴韦林、氯喹浓度1.5ng/mL、2.0ng/mL、0.05ng/mL时，重复测试10次，经过样品预处理和上机检测。分析后的数据可满足信噪比≥10，重复性Cv≤20％，准确性偏差15％的判定标准。

本发明通过对蛋白沉淀法的改进，解决蛋白沉淀法信号和灵敏度低的问题，提升了信号强度以达到检测要求。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。