一种高效抗猪流行性腹泻单克隆抗体制备及工艺

摘要

本发明提供了一种高效抗猪流行性腹泻单克隆抗体制备及工艺，包括配置基液，配置抗原及混合配置等三个步骤。本发明制备工艺简单，且首次通过马来酰胺反应制备猪流行性腹泻抗体，极大的提高生产效率了抗体的有效性和安全性，同时有效的拓展了抗体的适应性和适用范围，从而有效降低了养殖工作中疫苗接种的的频率，成本及劳动强度及难度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效抗猪流行性腹泻单克隆抗体制备及工艺，属疫苗制剂生产技术领域。

背景技术

抗腹泻疫苗是当前养猪业中降低因腹泻造成的猪消化疾病及因腹泻造成死亡的重要方法，但在实际的工作中，当所使用的疫苗往往均采用的传统生产工艺，从而一方面导致疫苗生产效率低下，且难以有效实现大规模生产，进而造成当前该类疫苗市场缺口较大，且生产及使用成本均相对较高；另一方面当前疫苗的适应范围相对较小，往往仅能满足单一种类或相近类型病毒的免疫，且疫苗的免疫成功率的稳定性也相对较差，从而导致在实际养殖工作中需要进行频繁的疫苗接种，在增加疫苗接种成本的同时，也造成疫苗接种成本、劳动强度及难度随之增加。

因此针对这一现状，迫切需要开发一种全新的一种高效抗猪流行性腹泻单克隆抗体制备的方法和工艺，以满足实际使用和养殖工作的需要。

发明内容

本发明目的就在于克服上述不足，提供一种猪流行性腹泻抗体及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种高效抗猪流行性腹泻单克隆抗体制备及工艺，包括以下步骤；

S1，配置基液，首先将PLGA-COOH与NH2-PEG-COOH通过酸胺缩合反应连接生成PLGA-PEG-COOH，然后将促吞噬肽加入PLGA-PEG-COOH连接生成PLGA-PEG-Tf，最后将阿魏酸，氯仿及佐剂一同添加到PLGA-PEG-Tf中，经过超声波均质得到油相基液，并以10℃—25℃恒温环境保存；

S2，配置抗原，取猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株，然后对猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株的N、S基因序列进行PT-PCR方法进行扩增培养，得到重组的PcoldI-N和PcoldI-S，然后将PcoldI-N和PcoldI-S转入到Rosetta感受态细胞中，经IPTG诱导获得重组蛋白，最后用亲和柱对PcoldI-N和PcoldI-S进行纯化，并对纯化后的PcoldI-N和PcoldI-S进行灭活处理；

S3，混合配置，将S2步骤获得的灭活PcoldI-N和PcoldI-S混合并进行至少3次亚克隆，且每次亚克隆均得到一株PEDV N蛋白特异细胞株，然后将各PEDV N蛋白特异细胞株添加到S1步骤制备的基液中，然后进行纯化即可得到成品抗体。

进一步的，所述的S1步骤中，吞噬肽与PLGA-PEG-COOH通过马来酰胺反应，其浓度配比1:15—30。

进一步的，所述的S1步骤阿魏酸浓度为2~15mg/mL、PLGA-PEG-Tf浓度为10~100mg/mL。

进一步的，所述的S2步骤和S3步骤中纯化作业时，采用减压蒸发纯化，减压蒸发时的作业压力为0.01—0.05Mpa。

进一步的，所述的佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、RIBI佐剂系统、大肠杆菌不耐热肠毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的任意一种或几种共用。

本发明制备工艺简单，且首次通过马来酰胺反应制备猪流行性腹泻抗体，极大的提高生产效率了抗体的有效性和安全性，同时有效的拓展了抗体的适应性和适用范围，从而有效降低了养殖工作中疫苗接种的的频率，成本及劳动强度及难度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明制造工艺流程图；

具体实施方式

下面将结合本发明的附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1所述，一种高效抗猪流行性腹泻单克隆抗体制备及工艺，包括以下步骤；

S1，配置基液，首先将PLGA-COOH与NH2-PEG-COOH通过酸胺缩合反应连接生成PLGA-PEG-COOH，然后将促吞噬肽加入PLGA-PEG-COOH连接生成PLGA-PEG-Tf，最后将阿魏酸，氯仿及佐剂一同添加到PLGA-PEG-Tf中，经过超声波均质得到油相基液，并以10℃恒温环境保存；

S2，配置抗原，取猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株，然后对猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株的N、S基因序列进行PT-PCR方法进行扩增培养，得到重组的PcoldI-N和PcoldI-S，然后将PcoldI-N和PcoldI-S转入到Rosetta感受态细胞中，经IPTG诱导获得重组蛋白，最后用亲和柱对PcoldI-N和PcoldI-S进行纯化，并对纯化后的PcoldI-N和PcoldI-S进行灭活处理；

S3，混合配置，将S2步骤获得的灭活PcoldI-N和PcoldI-S混合并进行3次亚克隆，且每次亚克隆均得到一株PEDV N蛋白特异细胞株，然后将各PEDV N蛋白特异细胞株添加到S1步骤制备的基液中，然后进行纯化即可得到成品抗体。

本实施例中，所述的S1步骤中，吞噬肽与PLGA-PEG-COOH通过马来酰胺反应，其浓度配比1:15。

本实施例中，所述的S1步骤阿魏酸浓度为2mg/mL、PLGA-PEG-Tf浓度为10mg/mL。

值得注意的，所述的S2步骤和S3步骤中纯化作业时，采用减压蒸发纯化，减压蒸发时的作业压力为0.01Mpa。

此外，所述的佐剂为铝胶佐剂。

实施例2

如图1所述，一种高效抗猪流行性腹泻单克隆抗体制备及工艺，包括以下步骤；

S1，配置基液，首先将PLGA-COOH与NH2-PEG-COOH通过酸胺缩合反应连接生成PLGA-PEG-COOH，然后将促吞噬肽加入PLGA-PEG-COOH连接生成PLGA-PEG-Tf，最后将阿魏酸，氯仿及佐剂一同添加到PLGA-PEG-Tf中，经过超声波均质得到油相基液，并以25℃恒温环境保存；

S2，配置抗原，取猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株，然后对猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株的N、S基因序列进行PT-PCR方法进行扩增培养，得到重组的PcoldI-N和PcoldI-S，然后将PcoldI-N和PcoldI-S转入到Rosetta感受态细胞中，经IPTG诱导获得重组蛋白，最后用亲和柱对PcoldI-N和PcoldI-S进行纯化，并对纯化后的PcoldI-N和PcoldI-S进行灭活处理；

S3，混合配置，将S2步骤获得的灭活PcoldI-N和PcoldI-S混合并进行至少3次亚克隆，且每次亚克隆均得到一株PEDV N蛋白特异细胞株，然后将各PEDV N蛋白特异细胞株添加到S1步骤制备的基液中，然后进行纯化即可得到成品抗体。

值得注意的，所述的S1步骤中，吞噬肽与PLGA-PEG-COOH通过马来酰胺反应，其浓度配比1: 30。

此外，所述的S1步骤阿魏酸浓度为15mg/mL、PLGA-PEG-Tf浓度为100mg/mL。

重点说明的，所述的S2步骤和S3步骤中纯化作业时，采用减压蒸发纯化，减压蒸发时的作业压力为0.05Mpa。

本实施例中，所述的佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、RIBI佐剂系统、大肠杆菌不耐热肠毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的任意一种或几种共用。

实施例3

如图1所述，一种高效抗猪流行性腹泻单克隆抗体制备及工艺，包括以下步骤；

S1，配置基液，首先将PLGA-COOH与NH2-PEG-COOH通过酸胺缩合反应连接生成PLGA-PEG-COOH，然后将促吞噬肽加入PLGA-PEG-COOH连接生成PLGA-PEG-Tf，最后将阿魏酸，氯仿及佐剂一同添加到PLGA-PEG-Tf中，经过超声波均质得到油相基液，并以20℃恒温环境保存；

S2，配置抗原，取猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株，然后对猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株的N、S基因序列进行PT-PCR方法进行扩增培养，得到重组的PcoldI-N和PcoldI-S，然后将PcoldI-N和PcoldI-S转入到Rosetta感受态细胞中，经IPTG诱导获得重组蛋白，最后用亲和柱对PcoldI-N和PcoldI-S进行纯化，并对纯化后的PcoldI-N和PcoldI-S进行灭活处理；

S3，混合配置，将S2步骤获得的灭活PcoldI-N和PcoldI-S混合并进行至少3次亚克隆，且每次亚克隆均得到一株PEDV N蛋白特异细胞株，然后将各PEDV N蛋白特异细胞株添加到S1步骤制备的基液中，然后进行纯化即可得到成品抗体。

其中，所述的S1步骤中，吞噬肽与PLGA-PEG-COOH通过马来酰胺反应，其浓度配比1:25。

同时，所述的S1步骤阿魏酸浓度为8mg/mL、PLGA-PEG-Tf浓度为40mg/mL。

本实施例中，所述的S2步骤和S3步骤中纯化作业时，采用减压蒸发纯化，减压蒸发时的作业压力为0.03Mpa。

本实施例中，所述的佐剂为油包水乳剂。

实施例4

如图1所述，一种高效抗猪流行性腹泻单克隆抗体制备及工艺，包括以下步骤；

S1，配置基液，首先将PLGA-COOH与NH2-PEG-COOH通过酸胺缩合反应连接生成PLGA-PEG-COOH，然后将促吞噬肽加入PLGA-PEG-COOH连接生成PLGA-PEG-Tf，最后将阿魏酸，氯仿及佐剂一同添加到PLGA-PEG-Tf中，经过超声波均质得到油相基液，并以15℃恒温环境保存；

S2，配置抗原，取猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株，然后对猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株的N、S基因序列进行PT-PCR方法进行扩增培养，得到重组的PcoldI-N和PcoldI-S，然后将PcoldI-N和PcoldI-S转入到Rosetta感受态细胞中，经IPTG诱导获得重组蛋白，最后用亲和柱对PcoldI-N和PcoldI-S进行纯化，并对纯化后的PcoldI-N和PcoldI-S进行灭活处理；

S3，混合配置，将S2步骤获得的灭活PcoldI-N和PcoldI-S混合并进行至少3次亚克隆，且每次亚克隆均得到一株PEDV N蛋白特异细胞株，然后将各PEDV N蛋白特异细胞株添加到S1步骤制备的基液中，然后进行纯化即可得到成品抗体。

本实施例中，所述的S1步骤中，吞噬肽与PLGA-PEG-COOH通过马来酰胺反应，其浓度配比1:18。

同时，所述的S1步骤阿魏酸浓度为9mg/mL、PLGA-PEG-Tf浓度为12mg/mL。

此外，所述的S2步骤和S3步骤中纯化作业时，采用减压蒸发纯化，减压蒸发时的作业压力为0.02Mpa。

本实施例中，所述的大肠杆菌不耐热肠毒素。

实施例5

一种高效抗猪流行性腹泻单克隆抗体制备及工艺，包括以下步骤；

S1，配置基液，首先将PLGA-COOH与NH2-PEG-COOH通过酸胺缩合反应连接生成PLGA-PEG-COOH，然后将促吞噬肽加入PLGA-PEG-COOH连接生成PLGA-PEG-Tf，最后将阿魏酸，氯仿及佐剂一同添加到PLGA-PEG-Tf中，经过超声波均质得到油相基液，并以23℃恒温环境保存；

S2，配置抗原，取猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株，然后对猪流行性腹泻病毒S1单元和灭活的猪流行性腹泻病毒HN301株的N、S基因序列进行PT-PCR方法进行扩增培养，得到重组的PcoldI-N和PcoldI-S，然后将PcoldI-N和PcoldI-S转入到Rosetta感受态细胞中，经IPTG诱导获得重组蛋白，最后用亲和柱对PcoldI-N和PcoldI-S进行纯化，并对纯化后的PcoldI-N和PcoldI-S进行灭活处理；

S3，混合配置，将S2步骤获得的灭活PcoldI-N和PcoldI-S混合并进行至少3次亚克隆，且每次亚克隆均得到一株PEDV N蛋白特异细胞株，然后将各PEDV N蛋白特异细胞株添加到S1步骤制备的基液中，然后进行纯化即可得到成品抗体。

需要说明的，所述的S1步骤中，吞噬肽与PLGA-PEG-COOH通过马来酰胺反应，其浓度配比1:22，所述的S1步骤阿魏酸浓度为12mg/mL、PLGA-PEG-Tf浓度为78mg/mL。

值得注意的，所述的S2步骤和S3步骤中纯化作业时，采用减压蒸发纯化，减压蒸发时的作业压力为0.02Mpa。

本实施例中，所述的佐剂为铝胶佐剂、油包水乳剂以1:2比例混合。

本发明制备工艺简单，且首次通过马来酰胺反应制备猪流行性腹泻抗体，极大的提高生产效率了抗体的有效性和安全性，同时有效的拓展了抗体的适应性和适用范围，从而有效降低了养殖工作中疫苗接种的的频率，成本及劳动强度及难度。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。