抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白的单克隆抗体制备及鉴定

摘要

猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)是引起猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)的病原体，在临床上主要表现为猪的水样腹泻、呕吐、脱水。该病传播迅速，发病率高，而且对哺乳仔猪致死率高，给世界养猪业带来了严重的经济损失。
　　纤突蛋白（Spike，S）是PEDV的一个重要结构蛋白及表面抗原，可以人为地划分为S1和S2蛋白，其中S1蛋白在识别宿主细胞上的入胞受体，促进病毒囊膜与细胞膜的融合，介导病毒的入侵过程中扮演着重要的角色，且含有主要的中和抗原表位。本研究采用RT-PCR的方法从江苏东台市某猪场的病料中克隆了PEDV S1基因部分区域(1318-2343 nt)，并将其分别构建到pET-28a、pET-32a以及pGEX-4T-1这三个原核表达载体上，采用1 mM IPTG诱导剂诱导重组蛋白在表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中表达。结果显示3个重组载体均能够表达目的蛋白，但是表达量均不是很高，综合各种因素，最后选取pET-28a-PEDV-rS1这个重组载体进行目的蛋白的大量诱导表达，并利用尿素变性纯化目的蛋白，并验证获得的蛋白与His鼠单抗的反应性。
　　以纯化的PEDV-rS1重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，并利用细胞融合以及有限稀释的方法筛选阳性杂交瘤细胞株，最终获得3株抗PEDV-rS1蛋白的特异性单克隆抗体，分别命名为2F4、3E5、4G11。单克隆抗体亚型鉴定显示，2F4的重链为IgM，3E5的重链为IgG1，4G11的重链为IgG2α，但它们的轻链均为κ链。Western Blot分析显示，这3株单抗都能与原核表达的重组rS1蛋白发生特异性反应。间接免疫荧光实验显示，单克隆抗体2F4、4G11可以与PEDV CV777感染的Vero细胞发生反应。

目录

声明

本论文创新点

摘要

第一部分 文献综述

1 猪流行性腹泻病毒的分类学地位

2 猪流行性腹泻病毒的形态结构

3 猪流行性腹泻病毒的理化学特性

4 猪流行性腹泻病毒的抗原性

5 猪流行性腹泻病毒的病原性

6 猪流行性腹泻病毒的基因组结构及复制特点

6．1 猪流行性腹泻病毒的基因组结构

6．2 猪流行性腹泻病毒基因组的复制特点

7 猪流行性腹泻病毒基因组编码的蛋白及其功能

7．1 非结构蛋白

7．2 结构蛋白

8 猪流行性腹泻病毒的体外培养

8．1 猪流行性腹泻病毒的体外培养研究进展

8．2 猪流行性腹泻病毒适应细胞的分子机制

第二部分 研究内容

第一章 猪流行性腹泻病毒rS1蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二章 猪流行性腹泻病毒rS1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢