一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法

摘要

本发明公开了一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法，提供了一种用于体外培养小鼠腔前卵泡的试剂组合，该试剂组合包含：藻酸盐溶液、CaCl2凝胶液、卵泡分离液(DM)、卵泡平衡液(MM)、卵泡酶解液(EM)、卵泡生长液(GM)、卵泡成熟液(MM1)和透明质酸酶。采用该试剂组合建立了一种小鼠腔前卵泡三维培养体系，该三维培养体系以藻酸盐凝胶为基质，以藻酸盐与Ca2+形成的凝胶滴为卵泡发育提供立体结构，再通过在不同的培养基质中进行培养，得到发育成熟的卵泡，进一步得到成熟的卵母细胞。

说明书

技术领域：

本发明属于胚胎工程技术领域，具体涉及一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法和应用。

背景技术：

动物卵泡发育过程中不足1％的卵泡能发育并排卵，而绝大多数卵泡发生闭锁。在畜牧生产中，这种不仅会造成优秀母畜遗传资源的浪费，还阻碍了以优质卵母细胞为主要材料的胚胎工程技术的发展。母畜卵巢中腔前卵泡经生物材料包被后，外层形成保护膜，提供卵泡一个支撑力，维持了卵泡的立体结构和细胞间的通讯联系，保证旁分泌通路的正常运行，卵泡发育环境与体内类似，保证了充足的营养与能量供应，促进了其生长和成熟过程。鼠作为理想的模式动物是研究人与家畜资源的理想动物，建立成熟的小鼠卵泡三维培养体系，不仅可充分利用优良种母畜，加快畜生产中品种改良，还可以为深入研究环境因素对卵泡细胞发育的影响及其机制，为繁殖疾病例如PCOS提供更直接有效的研究模型。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种用于体外培养小鼠腔前卵泡的试剂组合及其应用，本发明采用该试剂组合建立了一种小鼠腔前卵泡三维培养体系，该三维培养体系以藻酸盐凝胶为基质，以藻酸盐与Ca

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种用于体外培养小鼠腔前卵泡的试剂组合，该试剂组合包含：藻酸盐溶液、CaCl

作为一种优选技术方案，所述藻酸盐溶液的浓度为0.8～1.2g/100ml；所述CaCl

作为一种优选技术方案，所述卵泡分离液(DM)的制备方法为：将L-15、双抗和FBS混匀，于4℃保存；所述L-15、双抗和FBS的体积比为200：1：2。作为一种具体的制备例：在50ml无菌离心管中加入30ml L-15、150μl双抗、300μl FBS，混匀，于4℃保存。

所述卵泡平衡液(MM)的制备方法为：将α-MEM、F-12和FBS混匀，于4℃保存；所述α-MEM、F-12和FBS的体积比为50：50：1。作为一种具体的制备例：在50ml无菌离心管中加入15mlα-MEM、15ml F-12、300μl FBS，混匀，于4℃保存。

所述卵泡酶解液(EM)的制备方法为：将L-15、双抗、collagenase和DNase混匀，于4℃保存；所述L-15、双抗、collagenase和DNase的体积比为500：5：1：1。作为一种具体的制备例：在10ml无菌离心管中加入5ml L-15、50μl双抗、10μl collagenase，10μl DNase，混匀，于4℃保存。

所述卵泡生长液(GM)的制备方法为：将α-MEM、F-12和100×ITS混匀后，称取fetuin 和BSA加入上述混合液，缓慢溶解，0.22μM过滤器过滤，加入FSH，混匀，于4℃保存；所述α-MEM、F-12、100×ITS和FSH的体积比为500：500：10：1；所述fetuin与α-MEM 的质量体积比为2mg/ml；所述BSA与α-MEM的质量体积比为6mg/ml。作为一种具体的制备例：在50ml无菌离心管中加入15mlα-MEM、15ml F-12、300μl ITS(100x)，称取30 mg fetuin、90mg BSA加入上述混合液，缓慢溶解，0.22μM过滤器过滤，加入30μl FSH，混匀，于4℃保存。

所述卵泡成熟液(MM1)的制备方法为：将α-MEM、EGF、hCG、FBS和FSH混匀，于 4℃保存；所述α-MEM、EGF、hCG、FBS和FSH的体积比为1000：2.5：1：100：1。作为一种具体的制备例：在10ml无菌离心管中加入5mlα-MEM、12.5μl EGF、5μl hCG、500μl FBS、5μl FSH，混匀，于4℃保存。

所述透明质酸酶的浓度为0.3％。作为一种具体的制备例：称取0.03g透明质酸酶，溶于10ml L-15，300μl/管，于-20℃保存。

上述的试剂组合在体外培养小鼠腔前卵泡中的应用。

一种体外培养小鼠腔前卵泡的方法，包括以下步骤：

(1)准备培养盘

向细胞培养板的每孔加入100μl卵泡生长液(GM)，再加入石蜡油封层，培养孔四周每孔加入100μl PBS，PBS的加入是为了防止在培养时水分蒸发，保持培养板中的水分平衡，最终保持卵泡生长液中各成分含量不变。

使用卵泡平衡液(MM)在培养皿做滴并用石蜡油封层；将细胞培养板、培养皿、剩余卵泡平衡液(MM)、剩余卵泡生长液(GM)、CaCl

(2)卵巢的分离

取37℃加热的卵泡分离液(DM)到培养皿中；打开雌性ICR小鼠(约2周龄)腹腔，剪取卵巢放在卵泡分离液(DM)中；去除子宫、输卵管和脂肪，得到干净卵巢；

(3)卵泡的分离选取

将干净卵巢加入平衡过的卵泡酶解液(EM)中酶处理后；将卵泡酶解液(EM)中的卵巢移至卵泡分离液(DM)使用1ml的注射器进行卵泡分离；然后使用捡卵针将分离的卵泡移入卵泡分离液(DM)滴中，重复3-4次直至分离理想数目卵泡；

(4)卵泡的封装

在卵泡分离液(DM)滴中，挑选符合标准(形态结构良好、多层颗粒细胞完整、直径在 140μm左右)的卵泡，用藻酸盐溶液做两个滴，一个作为“洗滴”，一个作为“封装滴”，将符合标准的卵泡先移入洗滴清洗后，再移入封装滴形成由卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴；将卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴移入CaCl

作为一种具体实施例，将球滴移入CaCl

将卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴移入CaCl

(5)卵泡成熟培养

封装卵泡在37℃，5％CO

卵泡培养8天后，将符合成熟条件的卵泡(直径＞300μm)胶滴移入37℃加热的卵泡分离液(DM)中，随后使用吸卵针移入已平衡的卵泡成熟液(MM1)中，培养16-18h；

(6)收集成熟卵母细胞

在显微镜下观察经过成熟培养后的卵泡存活情况，剥开包被完好的卵泡胶滴将成熟的卵泡细胞置于卵泡分离液(DM)中，随后使用1ml注射器和镊子剥开卵泡将卵母细胞剥离；然后移入0.3％的透明质酸酶液滴中，脱去卵丘颗粒细胞后，得到成熟卵母细胞(MⅡ)，并统计成熟率，MⅡ卵母细胞可用于后续的各种试验。

本发明的有益效果：

动物卵泡发育过程中不足1％的卵泡能发育并排卵，而绝大多数卵泡发生闭锁。卵泡闭锁不仅造成优良母畜遗传资源的浪费，还阻碍了以优质卵母细胞为主要材料的胚胎工程技术的发展。本发明建立卵泡三维培养体系，不仅可以充分利用优良种母畜的卵泡资源，加快品种改良；还可以为深入研究环境因素对卵泡发育的影响及其机制和繁殖疾病(如PCOS)提供更直观有效的研究模型。

附图说明：

图1为14日龄雌鼠卵巢剥离示意图。

图2为卵泡封装示意图。

图3为藻酸盐与Ca

图4为鼠卵泡体外三维培养体系的培养效果图。

图5为不同批次试验获得的MⅡ卵母细胞。

具体实施方式：

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1卵泡体外三维培养体系的建立

1.实验动物

选取13-15日龄的ICR雌性小鼠，用小鼠专用颗粒饲料采用自由采食的方式饲喂，保证其充足的饮水，鼠房温度维持在25℃，相对湿度控制在70％左右，保证鼠房独立通风。

2.实验试剂

试验所需试剂见表1。

表1建立卵泡体外三维培养体系所需试剂

Table 1Reagents needed to establish 3-D culture system of folliclesin vitro

3.溶液配制

藻酸盐溶液(1g/100ml)：称取0.5g藻酸盐(Alginate sodium)于锥形瓶中，加入0.25 g活性炭粉末，50ml双蒸水；置于磁力搅拌器上，过夜搅拌；溶液通过0.22μM滤器去除活性炭，溶液-20℃保存。

CaCl

卵泡分离液(DM)：在50ml无菌离心管中加入30ml L-15、150μl双抗(Penicillin-Streptomycin)、300μl FBS，混匀，于4℃保存。

卵泡平衡液(MM)：在50ml无菌离心管中加入15mlα-MEM、15ml F-12、300μl FBS，混匀，于4℃保存。

卵泡酶解液(EM)：在10ml无菌离心管中加入5ml L-15、50μl双抗(Penicillin-Streptomycin)、10μl collagenase，10μl DNase，混匀，于4℃保存。

卵泡生长液(GM)：在50ml无菌离心管中加入15mlα-MEM、15ml F-12、300μl ITS(100x)，称取30mg fetuin、90mg BSA加入上述混合液，缓慢溶解，0.22μM滤器过滤，加入30μl FSH，混匀，于4℃保存。

卵泡成熟液(MM1)：在10ml无菌离心管中加入5mlα-MEM、12.5μl EGF、5μl hCG、500μl FBS、5μl FSH，混匀，于4℃保存。

0.3％透明质酸酶：称取0.03g透明质酸酶，溶于10ml L-15，300μl/管，于-20℃保存。

4.实验仪器

试验仪器见表2。

表2建立卵泡体外三维培养体系所需仪器

Table 2Apparatus needed to establish 3-D culture system of folliclesin vitro

5.实验方法

5.1.准备培养盘

用紫外灯提前照射超净台杀菌，向96孔板每孔加入100μl卵泡生长液(GM)，上面用200μl枪加入3滴石蜡油封层，培养孔四周每孔加入100μl PBS；剩余卵泡生长液(GM)保留。

使用卵泡平衡液(MM)在30mm培养皿做滴，50μl/滴，一般做4滴，上面用石蜡油封层，剩余卵泡平衡液(MM)保留。将96孔板、培养皿、剩余卵泡平衡液(MM)、剩余卵泡生长液(GM)、3ml CaCl

5.2.卵巢的分离

取3ml 37℃加热的卵泡分离液(DM)到30mm培养皿中；脊椎脱臼处死2周龄雌性ICR小鼠，使用酒精消毒腹部，打开腹腔，在肾下侧找到卵巢，剪取，放在卵泡分离液(DM) 中；在显微镜下，使用胰岛素注射器针头去除子宫、输卵管和脂肪，得到完整的干净卵巢 (如图1)。

5.3.卵泡的分离选取

将干净卵巢加入平衡过的卵泡酶解液(EM)中，酶处理40min；将卵泡酶解液(EM)中的卵巢移至卵泡分离液(DM)后，使用1ml的注射器分离卵泡，左手握针将组织固定在皿底部，右手握针轻轻分离卵泡。尽量在不刺破卵泡的情况下切除周围的大部分基质，将分离卵泡使用捡卵针移入卵泡分离液(DM)滴中，重复3-4次直至分离理想数目卵泡。

5.4.卵泡的封装

在卵泡分离液(DM)滴中，挑选符合标准(形态结构良好、多层颗粒细胞完整、直径在 140μm左右)的卵泡。用藻酸盐溶液做两个滴，一个作为“洗滴”，一个作为“封装滴”，先将符合条件的卵泡移入洗滴清洗后，再移入封装滴形成由卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴(如图 2)；用移液枪将卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴移入CaCl

5.5.卵泡成熟培养

封装卵泡在37℃，5％CO

首先将卵泡分离液(DM)放入37℃水浴锅中加热，然后将卵泡成熟液(MM1)加入96孔板中，100μl/孔，上面用200μl枪加入3滴石蜡油封层，培养孔四周每孔加入100μl PBS，置入37℃培养箱中平衡20min。

卵泡培养8天后，将符合成熟条件的卵泡(直径＞300μm)胶滴移入37℃加热的卵泡分离液(DM)液滴中，随后使用吸卵针移入已平衡的卵泡成熟液(MM1)中，成熟培养16-18h。

5.6.收集成熟卵泡

在显微镜下观察经过成熟培养后的卵泡存活情况，将包被完好的卵泡胶滴用胰岛素注射器和镊子剥开胶滴(左手持镊子固定胶滴，右手持胰岛素注射器剥开胶滴，注意不要划伤卵泡细胞)，之后将成熟的卵泡细胞置于卵泡分离液(DM)中，随后使用1ml注射器和镊子剥开卵泡将卵母细胞剥离；然后移入0.3％的透明质酸酶液滴中，脱去卵丘颗粒细胞后，得到成熟卵母细胞(MⅡ)，并统计成熟率，MⅡ卵母细胞可用于后续的各种试验。

5.7.实验设计

本试验共计收集60枚卵泡细胞(分6次，10枚/每次，分批次培养与观察成熟情况(见图5)。

6.结果

6.1.卵泡体外三维培养体系的建立

本次实验成功利用海藻酸盐与钙离子发生交联时形成的水凝胶包埋分离好的卵泡建立了小鼠卵泡体外三维培养体系(图4)。在培养8天后，转入成熟滴，成熟培养16-18h后，成功剥开卵泡后得到了MⅡ卵母细胞(图4F)。

6.2.卵泡体外三维培养体系中卵母细胞的成熟率情况

共从小鼠分离出的卵巢中选取了60枚符合要求的卵泡进行封装。37℃、5％CO

表3卵泡体外三维培养体系中卵母细胞的成熟率

Table 3Oocyte maturation rate in three-dimensional follicular culturesystem in vitro