一种绒毛组织原位载玻片培养法及染色体制备方法

摘要

本发明属于绒毛组织培养与检测技术领域，具体公开了一种绒毛组织原位载玻片培养法及染色体制备方法。所述绒毛组织原位载玻片培养法包括前处理、消化、接种和培养步骤，成功在载玻片上原位培养了绒毛组织细胞，培养后载玻片可直接用来制备染色体，与现有的培养瓶法相比，无需通过胰酶消化或刮片转移收获细胞，简化操作的同时避免了一些因为实验操作引起的染色体丢失、细胞损耗等，为后续染色体制备提供优质原料。所述染色体制备方法以原位载玻片培养法为基础，该方法将细胞丢失减少到最小程度，获得的染色体分散性好，核型完整，有效提高核型分析的准确率。

说明书

技术领域

本发明属于绒毛组织培养与检测技术领域，具体涉及一种绒毛组织原位载玻片培养法及染色体制备方法。

背景技术

据统计，当前我国出生缺陷的发生率约4%~6%，每年有近百万的缺陷儿出生。为了降低出生缺陷率，在胎儿疾病产前诊断中，主要是在中孕期、晚孕期采取羊膜腔穿刺术、脐静脉穿刺术等方法进行检查。这些方法因孕周较大，发现胎儿严重异常并终止妊娠的时间较晚，引产并发症发生率较高，而且会对孕妇造成很大的生理及心理伤害。随着医疗技术水平的发展，现在还可以在早孕期采取绒毛活检术，绒毛活检术是指在超声引导下行穿刺术，取出胎盘内的绒毛组织进行染色体诊断，可以提早发现问题，降低伤害。

目前孕早期绒毛活检术中获得染色体的方法有绒毛细胞直接法和培养瓶法。绒毛细胞直接法即将新鲜取到的绒毛组织经清洗、去除其他组织并剪碎后直接制片染色获得染色体的方法，它是利用绒毛组织细胞相对分裂旺盛的特点，但未经培养的细胞，获得的染色体分裂相少，质量不高。而培养瓶法则是在无菌条件下，将绒毛组织清洗并剪碎后置于塑料材质的传统斜口细胞培养瓶中，加入培养基后在CO

发明内容

本发明的目的之一是提供一种绒毛组织细胞原位载玻片培养法，直接在载玻片上培养绒毛细胞，细胞分裂相多，形态好，贴壁性好；培养后载玻片可直接制片染色获得染色体，无需经过胰酶消化或刮片过程，有效减少细胞损耗，提高后续核型分析的准确率。

为达到上述目的，本发明采用的具体技术方案如下：

一种绒毛组织细胞原位载玻片培养法，包括以下步骤：

①前处理：无菌条件下取绒毛组织样本，对其进行冲洗，直至无可见血红色，剔除其他组织后加入双抗溶液（即青链霉素混合液），然后在二氧化碳培养箱中36-38℃温育0.5-1.5小时；

②消化：将绒毛组织样本剪碎，离心弃上清；再加入胎牛血清培养基洗涤，离心弃上清；然后加入组织消化液，在二氧化碳培养箱中36-38℃温育0.5-1.5小时；

③接种：将消化后样本离心，弃上清；加入胎牛血清培养基洗涤，离心弃上清；再加入胎牛血清培养基，混匀得到悬液，吸取悬液加至原位培养盒内的载玻片上，将原位培养盒平置于二氧化碳培养箱于36-38℃进行预培养；

④培养：预培养20-25h后在原位培养盒中加入胎牛血清培养基，培养20-25h后进行换液；培养20-25h后再次换液，再培养20-25h，得到具有绒毛细胞的载玻片。

优选的，步骤①中，所述绒毛组织样本为至少10mg的绒毛分枝样本。

优选的，步骤①中，绒毛组织样本用无菌生理盐水冲洗。

优选的，步骤②中，所述组织消化液为胰蛋白酶溶液或者胶原酶Ⅱ溶液。

优选的，所述载玻片包括夹取区和培养区，所述培养区表面经过硅化处理、多聚赖氨酸处理或者胶原蛋白处理。夹取区用于供镊子夹取载玻片，其设置可以避免对在取放载玻片时对细胞造成破坏，培养区经上述特殊处理可以促进细胞黏附，提高细胞在载玻片培养的成功率，并避免载玻片在后续染色体制备时发生细胞脱落现象。更加优选的，所述夹取区表面为磨砂面，以方便夹取；所述培养区表面为光滑面，以加快染色体制备过程所用溶液的去除速度（培养基、秋水仙碱溶液、低渗液、预固定液和固定液），减少这些溶液尤其是低渗液的残留，进而确保良好的染色体制备效果。

本发明的目的之二是提供一种绒毛组织细胞的染色体制备方法，是采用上述

绒毛组织细胞原位载玻片培养法得到具有绒毛细胞的载玻片，再将该载玻片直接制片染色获得染色体的方法，具体包括以下步骤：

（1）按照上述绒毛组织细胞原位载玻片培养法制得具有绒毛细胞的载玻片；

（2）在装有步骤（1）载玻片的原位培养盒内加入秋水仙碱溶液，与盒内培养基混匀后在36-38℃下静置25-35分钟；

（3）去除原位培养盒内液体，加入低渗液室温下静置25-30分钟；

（4）去除原位培养盒内液体，加入预固定液静置5-10分钟；

（5）去除原位培养盒内液体，加入固定液固定，再去除原位培养盒内液体，重复固定三次；

（6）取出载玻片，将其放入染色体分散仪中行分散；

（7）将载玻片在85-95℃下烘烤2.5-3.5h，然后在36-38℃下过夜老化；

（8）采用G显带染色法对载玻片上细胞进行染色体染色。

优选的，步骤（5）中，第一次固定时，加入固定液后静置时间不超过1分钟，最好是在加入固定液混匀后马上去除原位培养盒内液体，以去除残留的低渗液，残留的低渗液会使细胞过度膨胀而破裂；第二次与第三次固定时，加入固定液后静置10-20分钟，固定时间不够，固定不充分，低渗膨胀的细胞容易破碎，造成染色体丢失。

优选的，步骤（6）中，染色体分散仪设置的分散条件为温度23-26℃，湿度48-53%。更加优选的，分散条件为温度25℃，湿度50%，在该分散条件下，低渗后的细胞中染色体能够分散到最合适的程度。

所述低渗液、预固定液和固定液可以为常规染色体制片中所使用的试剂。优选的，所述低渗液为枸橼酸三钠溶液，所述预固定液为冰醋酸，所述固定液为甲醇-冰醋酸溶液。更加优选的，所述低渗液为1mg/ml枸橼酸三钠溶液，所述预固定液为5%冰醋酸，所述固定液中甲醇与冰醋酸的体积比为3:1。本发明具有以下有益效果：

1、本发明成功在载玻片上原位培养了绒毛组织细胞，培养后载玻片可直接用来制备染色体，与现有的培养瓶法相比，无需通过胰酶消化或刮片转移收获细胞，简化操作的同时避免了一些因为实验操作引起的染色体丢失、细胞损耗等，为后续染色体制备提供优质原料。

2、本发明还提出了以原位载玻片培养法为基础的染色体制备方法，该方法将细胞丢失减少到最小程度，获得的染色体分散性好，核型完整，有效提高核型分析的准确率。

3、本发明绒毛组织原位载玻片培养法及染色体制备方法稳定性好，操作简单，且成功率几乎100%；染色体制备后载玻片可直接上GSL-120染色体全自动扫描仪采图、分析，工作效率高。

4、绒毛组织细胞的原位培养一直是无法实现孕早期产前诊断的一个瓶颈，本发明突破这一瓶颈，有效提高诊断时效性，能够尽早地发现缺陷，给孕妇带来的伤害降到最低。

附图说明

图1：本发明实施例中原位培养盒的示意图；

图2：本发明实施例中显带染色后的载玻片示意图；

图3：本发明实施例中绒毛细胞染色体核型图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例

本实施例提供一种绒毛组织细胞的染色体制备方法，包括以下步骤：

（1）绒毛组织细胞原位载玻片培养

①前处理：无菌条件下取15mg绒毛分枝样本作为绒毛组织样本，将其放入无菌培养皿中，用无菌生理盐水对其进行冲洗，直至无可见血红色；用组织小剪刀和镊子对绒毛进行检查，剔除其他组织，保证留下的为绒毛分枝样本；在样本中加入5ml双抗溶液，然后在二氧化碳培养箱中37℃温育1小时；

②消化：取出培养皿，用组织小剪刀和镊子将绒毛组织样本剪碎，尽可能碎，然后用无菌一次性吸管将绒毛转移至无菌离心管中，离心（1500rpm、8分钟），弃上清；再加入胎牛血清培养基（BI）4ml混匀洗涤绒毛一次，离心（1500rpm、8分钟），弃上清；加入胶原酶Ⅱ溶液3mL，混匀后置于二氧化碳培养箱中37℃温育1小时，每隔20分钟混匀一次，直至大部分绒毛已消化；

③接种：将消化后样本离心，弃上清；加入胎牛血清培养基洗涤两次，离心弃上清；再加入胎牛血清培养基，混匀得到悬液，吸取1ml悬液加至原位培养盒内的载玻片上，分别接种两个，两线同步培养，将原位培养盒平置于二氧化碳培养箱于37℃进行预培养；

④培养：预培养24h后在原位培养盒中加入3ml的胎牛血清培养基进行长期培养；培养24h后进行换液；培养24h后再次换液，再培养24h；

（2）在原位培养盒内加入0.1mg/ml秋水仙碱溶液40ul，与盒内培养基混匀后放入37℃培养箱静置30分钟；

（3）低渗：用吸管吸去原位培养盒内液体，加入5ml低渗液（1mg/ml的枸橼酸三钠溶液），室温下静置28分钟；

（4）预固定：用吸管吸去原位培养盒内液体，加入5ml预固定液（5%冰醋酸）静置7分钟；

（5）固定：吸管吸去原位培养盒内液体，加入5ml固定液（甲醇与冰醋酸的体积比为3:1的甲醇-冰醋酸溶液），混匀后立即吸去原位培养盒内液体；加入5ml固定液进行第二次固定，静置15min，吸去原位培养盒内液体；然后加入5ml固定液进行第三次固定，静置15min，吸去原位培养盒内液体；

（6）分散：将THERMOTRON染色体分散仪CDS-5调至温度25℃，湿度50%，用镊子夹起原位培养盒中的载玻片，放入分散仪中进行分散，待分散完成即可取出；

（7）烤片：将载玻片放入90℃烤箱中烤3小时，然后转移至37℃培养箱中过夜老化；

（8）显带染色：采用G显带染色法对载玻片上细胞进行染色体染色，具体操作参照常规的羊水染色体G显带染色。

所述的原位培养盒如图1所示，包括盒体和上盖，盒体内具有一载玻片，打开上盖即可向盒体内加换液以及取放载玻片，所述载玻片包括夹取区和培养区；所述夹取区表面为磨砂面，所述培养区为光滑面且经过多聚赖氨酸处理。

完成显带染色的载玻片如图2所示，可以看到，载玻片上具有多个固定细胞，制片效果好，体现原位细胞培养成功；将该载玻片放入GSL-120染色体全自动扫描仪，进行采图、分析，得到如图3所示的绒毛细胞染色体核型图，可以看到，染色体分散性好，核型完整，显带清晰，分析可靠性高。

本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在本发明权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。