银杏叶滴丸HPLC-VWD-ELSD特征图谱的建立方法及其特征图谱

摘要

本发明涉及中药特征指纹图谱分析方法，具体涉及银杏叶滴丸HPLC‑VWD‑ELSD特征图谱的建立方法，及其所得到的特征图谱。本发明公开了一种银杏叶滴丸HPLC‑VWD‑ELSD特征图谱的建立方法，所述建立方法包括供试品溶液的制备、特征图谱测定条件的建立及测定，上述特征图谱通过对照品共指认了11个特征共有峰。本发明使用超滤管进行样品前处理，能够基本除去辅料聚乙二醇4000(PEG4000)，减少了其在ELSD色谱图中对内酯类成分响应的影响。

说明书

技术领域

本发明涉及中药特征指纹图谱分析方法，具体涉及银杏叶滴丸HPLC-VWD-ELSD特征图谱的建立方法，及其所得到的特征图谱。

背景技术

银杏叶滴丸收载于《中国药典》2020年版(第一部)，由银杏叶提取物与聚乙二醇4000加热溶化，混匀，滴入甲基硅油冷却剂中，除去表面油迹，或包薄膜衣制备而成，主要用于瘀血阻络引起的胸痹心痛、中风、半身不遂，舌强语謇；冠心病稳定性心绞痛、脑梗死见上述证候者。

中药特征指纹图谱是指中药材或其制剂经适当的处理后，通过一定的分析方法，得到能够反映其化学特征的色谱图或光谱图。色谱指纹图谱能够很好地反映中药的综合性和复杂性，是评价中药真实性和一致性的有效方法。

黄酮类及内酯类成分是银杏叶滴丸中的主要化学成分，也是《中国药典》中含量测定的指标成分，目前银杏叶滴丸的质量控制方法主要是对黄酮类及内酯类成分进行单独测定，或者建立单类成分的指纹图谱。因为黄酮类成分有很好的紫外吸收，但内酯类没有紫外吸收，所以使用紫外检测器与蒸发光散射检测器联用可以同时检测黄酮类和内酯类成分，建立银杏叶滴丸的HPLC-VWD-ELSD特征图谱，可以从整体角度对银杏叶滴丸的化学成分进行全面表征。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供银杏叶滴丸HPLC-VWD-ELSD特征图谱的建立方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：

超滤膜的预处理：取400μL的50％甲醇于密理博超滤管中(外管1.5mL，3K)中，15000r，离心20min，弃去滤出液，再将内管反置于外管中，1000r，离心1min，除净内管内液体。

取银杏叶滴丸适量，研细，取粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20mL，超声处理60min(40KHz,500W)，取出，冷却至室温，摇匀，15000r，离心20min，取400μL的上清液置于预处理过的超滤管中，15000r，离心20min，取滤出液收集管中的溶液，即得。

(2)对照品溶液的制备：取对照品白果内酯、银杏内酯J、银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、槲皮素-3-O-2"-(6"-p-香豆酰基)-葡萄糖基-鼠李糖苷及山奈酚-3-O-2"-(6"-p-香豆酰基)-葡萄糖基-鼠李糖苷适量，加50％甲醇制成适当浓度的母液，经适当稀释制成最终浓度介于10μg/mL～100μg/mL的混合对照品溶液。

(3)紫外-蒸发光散射检测器联用法测定：色谱柱：Agilent InfinityLabPoroshell 120EC-C18(3.0×150mm,2.7μm)；流动相：以0.05％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈-甲醇(8：2)为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速：0.4mL/min，柱温：35℃，检测波长：360nm；蒸发光散射检测器：N

(4)特征图谱的建立：将20批银杏叶滴丸分别按照上述步骤(1)制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，按照上述步骤(3)的色谱条件进行检测，分别记录色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件进行分析，得到银杏叶滴丸的VWD-ELSD标准指纹图谱(R)，确定了11个共有峰，内酯类以峰1(白果内酯)为参照峰，黄酮苷类以峰4(芦丁)为参照峰。

另外本发明还提供了银杏叶滴丸HPLC-VWD-ELSD特征图谱，如图8所示。

图谱11个特征共有峰，其中，峰1：白果内酯；峰2：银杏内酯J；峰3：银杏内酯C；峰4：芦丁；峰5：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；峰6：山柰酚-3-O-芸香糖苷；峰7：水仙苷；峰8：银杏内酯A；峰9：银杏内酯B；峰10：槲皮素-3-O-2"-(6"-p-香豆酰基)-葡萄糖基-鼠李糖苷；峰11：山奈酚-3-O-2"-(6"-p-香豆酰基)-葡萄糖基-鼠李糖苷。

本发明公开了一种银杏叶滴丸HPLC-VWD-ELSD特征图谱的建立方法，所述建立方法包括供试品溶液的制备、特征图谱测定条件的建立及测定，上述特征图谱通过对照品共指认了11个特征共有峰。

与现有技术相比，本发明的改进点在于：

1、使用超滤管进行样品前处理，能够基本除去辅料聚乙二醇4000(PEG4000)，减少了其在ELSD色谱图中对内酯类成分响应的影响。

2、使用紫外检测器和蒸发光散射检测器联用，能够同时检测出有紫外吸收(黄酮类成分)及没有紫外吸收(内酯类成分)的化合物，较全面的分析银杏叶滴丸中的化学成分。

3、本方法具有精密度、稳定性、重复性好的优点，所得银杏叶滴丸特征图谱相似性高，准确可靠，可较全面地反映银杏叶滴丸的化学组成的整体特征，可更全面的评价银杏叶滴丸的质量。

附图说明

图1供试品溶液制备方法不同参数选择对比图；

其中图1A不同提取条件，图1B不同提取溶剂，图1C不同提取时间，图1D不同料液比。

图2超滤膜过滤前后的色谱图(去除PEG4000前后)

图3本发明实施例采用三根不同的色谱柱的对比图。

图4本发明实施例采用不同流动相体系的对比图。

图5本发明实施例采用流动相体系中不同水相的对比图。

图6本发明实施例采用不同流速体系的对比图。

图7本发明实施例采用不同柱温体系的对比图。

图8银杏叶滴丸标准特征图谱(1-11为11个特征共有峰)

图9银杏叶滴丸对照品图谱

图10银杏叶滴丸20批特征图谱叠加图

其中，峰1：白果内酯；峰2：银杏内酯J；峰3：银杏内酯C；峰4：芦丁；峰5：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；峰6：山柰酚-3-O-芸香糖苷；峰7：水仙苷；峰8：银杏内酯A；峰9：银杏内酯B；峰10：槲皮素-3-O-2"-(6"-p-香豆酰基)-葡萄糖基-鼠李糖苷；峰11：山奈酚-3-O-2"-(6"-p-香豆酰基)-葡萄糖基-鼠李糖苷

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步地说明，以便对本发明作更详细的了解。

实施例1

1仪器与试药

1.1仪器

十万分之一分析天平(Sartorious)、万分之一分析天平(Sartorious)、Agilent1260InfinityVWD-ELSD联用、Milli-Q去离子水、高速冷冻离心机。

1.2试药

银杏叶滴丸由万邦德制药集团有限公司提供，样品批号见表1。甲醇、乙腈及甲酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

表1 银杏叶滴丸信息表

2方法与结果

2.1供试品溶液制备方法的考察

对供试品溶液制备方法进行考察，包括提取条件(超声、回流)、提取溶剂(水、25％甲醇及50％甲醇)、提取时间(20min、40min及60min)及提取料液比(1-40、1-80及1-120)，结果如图1可知，确定最终提取方法：称取0.25g样品，用20mL 50％甲醇超声提取60min(因超滤膜材质只能通过＜60％甲醇溶液，提取溶剂考察至50％甲醇溶液)。

供试品溶液的制备：

超滤膜的预处理：取400μL的50％甲醇于密理博超滤管中(外管1.5mL，3K)中，15000r，离心20min，弃去滤出液，再将内管反置于外管中，1000r，离心1min，除净内管内残留液体。

取银杏叶滴丸适量，研细，取粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20mL，超声处理60min(40KHz,500W)，取出，冷却至室温，摇匀，15000r，离心20min，取400μL的上清液置于预处理过的超滤管中，15000r，离心20min，取滤出液收集管中的溶液，即得。

超滤膜过滤前后的色谱图(去除PEG4000前后)，如图2所示。

2.2色谱方法的优化和选择

流动相考察了水-乙腈、酸水-乙腈-甲醇系统，色谱柱考察了Agilent ZORBAX SB-C18(2.1×100mm,1.8μm)，Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(2.1×100mm,2.7μm)及Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(3.0×150mm,2.7μm)三根色谱柱，选择Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(3.0×150mm,2.7μm)作为分析柱，考察了ELSD的参数部分，包括蒸发温度、雾化温度及N

色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(3.0×150mm,2.7μm)，流动相：以0.05％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈-甲醇(8：2)为流动相B，按下表进行梯度洗脱，流速：0.4mL/min，柱温：35℃，检测波长：360nm；蒸发光散射检测器：N

表2 洗脱梯度表

2.2.1不同色谱柱的考察

考察了三根不同的色谱柱，(柱1：Agilent ZORBAX SB-C18(2.1×100mm,1.8μm)、柱2：Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(2.1×100mm,2.7μm)及柱3：AgilentInfinityLab Poroshell 120 EC-C18(3.0×150mm,2.7μm))的分离效果，按表2梯度洗脱。由图3可知，柱3所得色谱图整体峰形及分离度较好，因此选择Agilent InfinityLabPoroshell 120 EC-C18(3.0×150mm,2.7μm)为分析柱。

2.2.2不同流动相体系的考察

2.2.2.1考察流动相体系—有机相-0.05％甲酸水

考察流动相体系中有机相的变化对色谱峰的影响，按表2梯度洗脱。综合考虑VWD及ELSD色谱图(图4)，以纯乙腈为有机相时，前10min的黄酮苷类分离效果较差；混合甲醇后，保留增强，分离度增加；进一步考察了乙腈和甲醇的比例，当乙腈：甲醇＝8：2时，各指认峰的分离度及峰形较好，洗脱时间适宜，因此选择乙腈：甲醇＝8：2作为有机相。

2.2.2.2考察流动相体系—乙腈：甲醇＝8：2-水相

考察流动相体系中水相的变化对色谱峰的影响，按表2梯度洗脱。通过在水相加入甲酸以改善峰形。由图5可知，水相中加入0.05％甲酸后，可提高峰7(水仙苷)的分离度；甲酸浓度提高到0.1％时，与0.05％甲酸无太大差别，因此在保证色谱仪及色谱柱酸度承受能力的情况下，选择使用乙腈：甲醇＝8：2-0.05％甲酸水溶液作为流动相。

2.2.3考察不同流速体系

采用安捷伦1260高效液相色谱仪，考察了不同流速(0.3mL/min、0.4mL/min及0.5mL/min)对各色谱峰分离度的影响，按表2梯度洗脱。实验结果表明(如图6)，在VWD色谱图中，峰4及峰7均包有小峰，另外ELSD色谱图中，0.4mL/min的流速获得了较好的分离度(峰2及峰3),综合考虑下，选择0.4mL/min的流速。

2.2.4考察不同柱温体系

采用安捷伦1260高效液相色谱仪，考察了不同柱温(30℃、35℃及40℃)对各色谱峰分离度的影响，按表2梯度洗脱。由图7可知，柱温为30℃及40℃时，峰4及峰11的分离效果不佳，35℃下各峰分离情况较好，在考虑到色谱柱的耐温程度后，选择35℃为检测温度。

2.2.5考察ELSD参数

考察ELSD的蒸发温度(60℃、70℃及80℃)、雾化温度(60℃、70℃及80℃)及N

3方法学考察

3.1精密度实验

取银杏叶滴丸(S12)0.25g，精密称定，按上述“供试品溶液制备方法”制备供试品溶液，精密吸取续滤液2μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录11个共有峰的保留时间及峰面积，计算相对保留时间、相对峰面积及其RSD值，结果见表3及表4。实验结果表明，该方法精密度良好。

表3 精密度考察结果(相对保留时间)

表4 精密度考察结果(相对峰面积)

3.2重复性实验

取同一批次银杏叶滴丸(S12)6份，每份0.25g，精密称定，按上述“供试品溶液制备方法”制备供试品溶液，精密吸取续滤液2μL，注入液相色谱仪，记录11个共有峰的保留时间及峰面积，计算相对保留时间、相对峰面积及其RSD值，结果见表5及表6。实验结果表明，该方法重复性良好。

表5 重复性考察结果(相对保留时间)

表6 重复性考察结果(相对峰面积)

3.3稳定性实验

取重复性项下一份供试品溶液，分别于0h，4h，6h，10h，12h及24h，精密吸取2μL，注入液相色谱仪，记录11个共有峰的保留时间及峰面积，计算相对保留时间、相对峰面积及其RSD值，结果见表7及表8。实验结果表明，该方法稳定性良好。

表7 稳定性考察结果(相对保留时间)

表8 稳定性考察结果(相对峰面积)

4.样品测定

将20批银杏叶滴丸按上述“供试品溶液制备方法”制备供试品溶液，按“色谱方法”进样分析，分别记录其色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件进行分析，中位数法生成对照图谱(图10)，得到银杏叶滴丸的HPLC-VWD-ELSD标准特征图谱(R)(图8)，确定了11个共有峰，内酯类以峰1为参照峰，黄酮苷类以峰4为参照峰，各峰的相对保留时间见表9，分析20批银杏叶滴丸色谱图与对照特征图谱的相似度，相似度数据见表10及表11，结果表明，不同批次的银杏叶滴丸与对照图谱的相似度较高(>0.9)。

表9 20批银杏叶滴丸中11个共有指纹峰的相对保留时间

表10 20批银杏叶滴丸相似度结果(VWD)

表11 20批银杏叶滴丸相似度结果(ELSD)