微生物在半纤维素衍生碳水化合物中生长的适应和工艺优化

摘要

本文提供了制备经修饰以相较于未经修饰的微生物增加木糖消耗的微生物的方法。所述方法包括提供消耗木糖的微生物，其包含两个或更多个拷贝的编码木糖异构酶的核酸序列和两个或更多个拷贝的编码木糖激酶的核酸序列；在包含木糖的培养基中培养微生物并收获一部分微生物。将这些步骤重复多次。然后分离微生物。与对照消耗木糖的微生物相比，分离的微生物具有增加的木糖消耗速率。还提供了通过所提供的方法制备的微生物群体。提供了培养微生物群体的方法和减少包含微生物群体的培养物中木糖醇产量的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年10月23日提交的美国临时申请第62/749,554号的优先权，所述美国临时申请通过引用以其整体并入本文。

背景技术

真核微生物可用于通过将培养基中提供的碳转化为脂质来产生脂质。然后可以从微生物中收获这些脂质，并以多种方式使用，包括生产营养油和生物燃料。通常，培养基中提供的碳是葡萄糖。然而，葡萄糖是昂贵的培养基成分。通过将纤维素和半纤维素组分转化为两个主要的流半纤维素葡萄糖流和半纤维素木糖流，可以从木质纤维素材料中获得更便宜的碳源。然而，在大多数情况下，木糖无法代谢，因此通常被视为废料。

发明内容

本文提供了制备经修饰以相较于未经修饰的微生物增加木糖消耗的微生物的方法。所述方法包括提供消耗木糖的微生物，其包含两个或更多个拷贝的编码木糖异构酶的核酸序列和两个或更多个拷贝的编码木糖激酶的核酸序列；在包含木糖的培养基中培养微生物并收获一部分微生物。将这些步骤重复多次。然后分离微生物。与对照消耗木糖的微生物相比，分离的微生物具有增加的木糖消耗速率。还提供了通过所提供的方法制备的微生物群体。提供了培养微生物群体的方法和减少包含微生物群体的培养物中木糖醇产量的方法。

附图说明

图1A、图1B、图1C、图1D、图1E和图1F是显示Iso-his#16、7-7、Gxs1 7-7、AspTx 7-7和51-7在各种培养基中的木糖耗竭的图，显示了相对于野生型(未修饰的)微生物的改进。关于菌株的描述，参见表1。图1A和图1B是分别显示当微生物在实验室级20g/L葡萄糖和20g/L木糖(2:2GX)上生长时，木糖消耗和木糖转化为木糖醇的量的图。图1C和图1D是分别显示当微生物在实验室级20g/L葡萄糖和50g/L木糖(2:5GX)上生长时，木糖消耗和木糖转化为木糖醇的量的图。图1E和图1F分别显示了当微生物在实验室级60g/L木糖(6％木糖)上生长时，木糖消耗和木糖转化为木糖醇的量。

图2A、图2B、图2C和图2D是显示添加木糖醇对7-7和51-7菌株使用葡萄糖和木糖的影响的图表，所述7-7和51-7菌株生长在浓度为2％葡萄糖、5％木糖或2:5葡萄糖：木糖的实验室级碳源中。图2A是显示在2％葡萄糖(2％G)、2％葡萄糖和1g/L木糖醇或2％葡萄糖和15g/L木糖醇中生长的7-7和51-7消耗的葡萄糖的图。图2B是显示在5％木糖、5％木糖和1g/L木糖醇或5％木糖和15g/L木糖醇中生长的7-7和51-7消耗的木糖的图。图2C和图2D是显示在2:5的葡萄糖：木糖(2:5GX)、2:5GX和1g/L木糖醇或2:5GX和15g/L木糖醇中生长的7-7和51-7所用的葡萄糖(2C)和所用的木糖(2D)的图。

图3A、图3B和图3C是显示在含有半纤维素木糖的培养基中用Gxs1 7-7和51-7发酵的图。图3A是显示在含有半纤维素木糖的培养基中生长的7-7和Gxs1 7-7的生物质积累的图。图3B和图3C是显示在含有半纤维素木糖的培养基中生长的51-7(3B)和Gxs1 7-7(3C)菌株的碳消耗和木糖醇积累的图。

图4是显示氮浓度影响野生型未修饰的ONC-T18、7-7和51-7菌株中的木糖醇产生的图。

图5A和图5B是显示7-7和AspTx 7-7菌株的传代导致在5％木糖(5A)和2:5葡萄糖：木糖(5B)中木糖使用增加的菌株的图。碳源是实验室级的。

图6A、图6B、图6C和图6D是显示在5％木糖(5％Xyl)和2:5葡萄糖：木糖(2:5％Glc:Xyl)浓度下，在实验室级碳源中生长的传代51-7菌株的木糖使用和木糖醇产生以及生物质产生的图。图6A是显示当传代菌株在5％木糖上生长时使用的木糖的图。图6B是显示当传代菌株在2:5葡萄糖：木糖上生长时使用的木糖的图。图6C是显示传代菌株产生木糖醇的图。图6D是显示在5％木糖或2:5葡萄糖：木糖上生长的传代菌株的生物质产生的图。

图7A和图7B是显示由51-7原始菌株和51-7传代菌株使用的木糖(7A)和产生的木糖醇(7B)的图。

图8A、图8B和图8C是显示在51-7传代菌株中的相对木糖异构酶和pirXK拷贝数的图像和图。图8A是Southern印迹的图像，其显示了木糖异构酶和pirXK基因以及IMP上样对照。图8B是来自Southern印迹的相对木糖异构酶强度的图。图8C是Southern印迹的相对pirXK强度的图。

图9A、图9B和图9C是显示提高半纤维素木糖浓度对51-7和51-7XP16(16次代后分离的菌株)培养物的影响的图。图9A是显示当菌株在20、30、40或50g/L半纤维素木糖中培养时使用的木糖量的图。图9B是显示当菌株在各种量的半纤维素木糖中培养时使用的葡萄糖量的图。图9C是显示当菌株在各种量的半纤维素木糖中培养时产生的木糖醇的量的图。

图10A和图10B是显示提高半纤维素葡萄糖浓度对51-7和51-7XP16培养物的影响的图。图10A是显示当菌株在30g/L、40g/L或50g/L的半纤维素葡萄糖中培养时使用的葡萄量的图。图10B是显示当菌株在30g/L、40g/L或50g/L的半纤维素葡萄糖中培养时使用的木糖量的图。

图11A、图11B和图11C是显示使用51-7XP16菌株的基准发酵的图。图11A是显示在以实验室级木糖和葡萄糖为原料的一式两份的容器(容器A和容器B)中生长的51-7XP16的生物质生长的图。图11B是显示容器A中的碳消耗量的图。图11C是显示容器B中的碳消耗量的图。

图12A和图12B是显示在实验室级碳水化合物上生长的容器A(12A)和容器B(12B)中51-7XP16的脂肪酸谱的表。

图13是显示51-7XP16的生物质生长的图，其中氮浓度以及半纤维素木糖和半纤维素葡萄糖加倍(51-7XP16 C5/C6)，或者氮和半纤维素木糖加倍(51-7XP16 C5)。

图14A和图14B是显示在半纤维素木糖和半纤维素葡萄糖(14A)中以及仅在半纤维素木糖(14B)中生长的51-7XP16的脂肪酸谱的表。

图15是显示在半纤维素葡萄糖上以3200L规模生长的51-7XP16的生物质生长和脂肪酸谱的表。

图16是显示在半纤维素葡萄糖上以3200L规模生长的51-7XP16的葡萄糖和木糖消耗以及溶解氧分布的表。

图17是显示与在半纤维素葡萄糖上以3200L生长的野生型菌株ONC-T18相比，51-7XP16使用的木糖量的图。

具体实施方式

在自然界中，存在两种木糖代谢途径，即木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径和木糖异构酶/木酮糖激酶途径。破囊壶菌(Thraustochytrids)具有编码在两种途径中都具有活性的蛋白质的基因。然而，当在木糖培养基中生长时，木糖醇的积累证明了前一种途径似乎是主要的。因此，产生了如美国公开号2017/0015988(其通过引用以其整体并入本文)中所描述的过表达木糖异构酶、木酮糖激酶和/或木糖转运蛋白的菌株。如本文中所述，在含有木糖作为唯一碳源的培养基中或含有木糖和葡萄糖的培养基中使用实验室适应进一步优化了这些菌株。代表性传代菌株51-7XP16在含有实验室级葡萄糖和木糖的培养基中使用的木糖为未传代的原始菌株(51-7原始)的2.4倍，在仅包含实验室级木糖的培养基中使用的木糖为51-7的5.5倍(关于菌株的描述，参见表1)。如本文所用，实验室级碳源是包含95％或更多的碳源的碳源，例如，实验室级葡萄糖包含95％或更多的葡萄糖。在两种培养基中，51-7XP16产生的木糖醇也比原始菌株少约8倍。在含有半纤维素木糖的培养基中，取决于所提供的半纤维素木糖的量，51-7XP16使用的木糖比51-7原始菌株多1.2至8.8倍。另外，51-7XP16在含有半纤维素葡萄糖的培养基中使用葡萄糖的能力不受妨碍。

本文提供了制备木糖消耗增加的微生物的方法。所述方法包括(a)提供消耗木糖的微生物，其包含两个或更多个拷贝的编码木糖异构酶的核酸序列和两个或更多个拷贝的编码木糖激酶的核酸序列；(b)在包含木糖的第一培养基中培养微生物至少3天；(c)在培养步骤(b)之后，从第一培养基中收获一部分微生物；(d)将收获的部分微生物在包含木糖的第二培养基中培养至少3天；(e)在培养步骤(d)之后，从第二培养基中收获一部分微生物；(f)在第三培养基和第四培养基中重复培养和收获步骤(d)和(e)至少两次；和(g)分离从步骤(f)收获的微生物，其中与对照消耗木糖的微生物相比，所述分离的微生物具有增加的木糖消耗速率。

如本文中所述，对照或标准对照是指用作参考(通常是已知的参考)用于与测试样品、测量值或值进行比较的样品、测量值或值。例如，可将测试微生物(例如，通过所提供的方法制备的具有增加的木糖消耗和编码木糖代谢基因的微生物)与已知的正常(野生型)微生物(例如，标准对照微生物)或未经过所提供的方法处理的未传代的原始菌株(例如，对照木糖消耗微生物)进行比较。标准对照也可代表从微生物群体(例如，标准对照微生物)采集的平均测量值或值，所述微生物以木糖作为唯一碳源不能生长或生长不良，或者不具有木糖异构酶活性、木酮糖激酶活性和/或木糖转运活性或具有最低水平的木糖异构酶活性、木酮糖激酶活性和/或木糖转运活性。本领域技术人员将认识到，可以设计标准对照来评估许多参数(例如，RNA水平、多肽水平、特定细胞类型等)。

所提供的菌株具有编码参与木糖代谢的一种或多种基因的核酸。因此，本文提供了编码木糖异构酶、木酮糖激酶和木糖转运蛋白的核酸和多肽，用于修饰微生物使其能够代谢木糖并且/或者以木糖上作为唯一碳源生长。因此，提供了编码木糖异构酶的核酸。核酸序列对于微生物可以是内源的或异源的。木糖异构酶的示例性核酸序列包括但不限于来自梨囊鞭菌属某种(Piromyces sp.)、链球菌属某种(Streptococcus sp.)和破囊壶菌(Thraustochytrids)的那些木糖异构酶的核酸序列。例如，编码木糖异构酶的示例性核酸序列包括但不限于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4；以及木糖异构酶的示例性多肽序列包括但不限于SEQ ID NO:5。木酮糖激酶的示例性核酸序列包括但不限于来自大肠杆菌(E.Coli)、梨囊鞭菌属某种、酵母属某种(Saccharomyces sp.)和毕赤酵母属某种(Pichia sp.)的木酮糖激酶的核酸序列。例如，编码木酮糖激酶的示例性核酸序列包括但不限于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。编码糖转运蛋白例如木糖转运蛋白的示例性核酸序列包括但不限于来自曲霉菌属某种(Aspergillus sp.)、Gfx1、Gxs1和Sut1的那些。例如，编码木糖转运蛋白的示例性核酸序列包括但不限于SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11和SEQ ID NO:12。

任选地，所提供的消耗木糖的微生物包含至少两个拷贝的编码木糖异构酶的核酸序列和两个或更多个拷贝的编码木酮糖激酶的核酸序列。任选地，消耗木糖的微生物包含至少一种编码木糖转运蛋白的核酸序列。编码木糖异构酶、木酮糖激酶和/或木糖转运蛋白的核酸序列是任选的外源性核酸序列。任选地，编码木糖异构酶的核酸序列是内源核酸序列。任选地，编码木酮糖激酶和/或木糖转运蛋白的核酸序列是异源核酸。任选地，微生物包含至少两个拷贝的编码木糖异构酶的核酸序列、至少两个拷贝的编码木酮糖激酶的核酸序列和至少一个编码木糖转运蛋白的核酸序列。任选地，编码木糖异构酶的异源核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性。任选地，编码木酮糖激酶的异源核酸序列与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性。如上所述，任选地，编码木糖转运蛋白的核酸是异源核酸。任选地，由异源核酸编码的木糖转运蛋白是来自中型假丝酵母(Candida intermedia)的GXS1。任选地，由异源核酸编码的木糖转运蛋白是来自曲霉菌属某种的AspTX。任选地，编码木糖转运蛋白的异源核酸序列与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:9具有至少90％同一性。

如本文中所用，术语异源是指不是细胞天然具有的，即来自与细胞不同的生物体的核酸序列。术语外源的和内源的或异源的不是互相排斥的。因此，核酸序列可以是外源的和内源的，意味着所述核酸序列可以被引入细胞中，但具有与细胞中天然存在的核酸的序列相同或相似的序列。因此，核酸序列可以是外源的和内源的，意味着所述核酸序列可被引入细胞中，但具有不是细胞天然具有的序列，例如来自不同生物体的序列。如本文中所用，术语内源的是指细胞天然具有的核酸序列。

所提供的重组微生物不仅包含编码参与木糖代谢的基因的核酸序列，而且它们还可包含多个拷贝的此类序列。因此，微生物包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个拷贝的编码木糖异构酶的核酸序列。任选地，微生物包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40拷贝的编码木酮糖激酶的核酸序列。任选地，微生物包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个拷贝的编码木糖转运蛋白的核酸序列。多个拷贝或其子组任选地编码在单个序列中。另外，核酸序列任选地在其多个拷贝或子集之间包含一个或多个接头残基或序列。

如本文中所用，核酸是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物和互补物。所述术语包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。所述术语包括含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或键联的核酸，所述核苷酸是合成的，天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。此类类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。除非另有说明，否则可使用核酸序列的保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列来代替本文所述的特定核酸序列。具体而言，简并密码子取代可通过产生序列来实现，在所述序列中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸可操作地连接。例如，如果编码前序列或分泌前导序列的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该DNA与编码该多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至该编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位成便于翻译的话，则所述核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接意指被连接的序列彼此靠近，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读相中。然而，增强子不必是连续的。例如，与第二核酸序列可操作地连接的核酸序列直接或间接地共价连接至该第二序列，尽管任何有效的三维缔合都是可接受的。单个核酸序列可以与多个其它序列可操作地连接。例如，单个启动子可以指导多个RNA种类的转录。可通过在方便的限制性酶切位点连接来完成连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

在两种或更多种核酸或多肽序列的上下文中，术语同一的或同一性百分比是指两种或多种序列或子序列相同或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指定区域中进行比较和比对以获得最大对应性时，在指定区域具有约60％同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用利用下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或者通过手动比对和目测检查(参见，例如，NCBI网站等)测量的。然后，此类序列被认为是基本上相同的。该定义也涉及或者可用于测试序列的互补序列。所述定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。如下所述，优选算法可以考虑缺口等。优选地，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。

为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如果需要，指定子序列坐标和序列算法程序参数。优选地，可使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

如本文中所用，比较窗口包括对选自由20至600个、通常约50至约200个、更通常约100至约150个连续位置组成的组的连续位置的数量中的任一个的区段的引用，其中在两个序列最佳比对后，可将序列与具有相同数量的连续位置的引用序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法；通过这些算法的计算机化实现形式(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,WI)或通过手动比对和目测检查(参见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel等人，编辑，1995增刊))来进行。

适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的优选实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于在Altschul等人，Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)以及Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。利用本文描述的参数，使用BLAST和BLAST 2.0确定核酸或蛋白质的序列同一性百分比。如本领域已知的，用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中选定长度(W)的短单词来识别高评分序列对(HSP)，所述短单词在与数据库序列中相同长度的单词比对时，匹配或满足某一正值阈值分数T。T被称为邻近词得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻近词命中充当启动搜索以查找包含它们的较长HSP的种子。单词命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积比对分数为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的惩罚分数；总是<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。单词命中在每个方向上的扩展在以下情况下停止：累积比对分数从其最大实现值下降了数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积分数变为零或更低；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。期望值(E)表示分数等于或优于数据库搜索中偶然出现的预期值的不同比对的数量。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用为11的字长(W)、为10的期望值(E)、M＝5，N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用为3的字长、为10的期望(E)和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))、为50的比对(B)、为10的期望值(E)、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。

如本文中所用，术语多肽通常具有其本领域公认的至少三个氨基酸的聚合物的含义，并且意图包括肽和蛋白质。然而，所述术语也用于指多肽的特定功能类别，例如去饱和酶、延伸酶等。对于每种此类类别，本公开提供了此类多肽的已知序列的几个实例。然而，本领域普通技术人员将理解，术语多肽旨在具有足够的通用性，以不仅涵盖具有本文中(或在本文中特别提及的参考文献或数据库中)引述的完整序列的多肽，而且涵盖代表此类完整多肽的功能性片段(即，保留至少一种活性的片段)的多肽。此外，本领域技术人员理解蛋白质序列通常耐受一些取代而不破坏活性。因此，任何保留活性并与同一类别的另一个多肽共享至少约30-40％(通常大于约50％、60％、70％或80％)的整体序列同一性，并且还通常包括至少一个在一个或多个高度保守的区域中具有高得多(通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％)的同一性的区域(通常包含至少3-4个，通常多达20个或更多个氨基酸)的任何多肽，涵盖在本文所用的相关术语“多肽”内。本领域技术人员可通过分析本文所述的各种多肽的序列来确定具有相似性和/或同一性的其它区域。如本领域技术人员已知的，已知多种策略，并且可获得工具用于执行氨基酸或核苷酸序列的比较，以评估同一性和/或相似性的程度。这些策略包括例如手动比对、计算机辅助序列比对及其组合。用于执行序列比对的许多算法(通常是计算机实现的)是广泛可用的，或者可由本领域技术人员产生。代表性算法包括，例如Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.,1981,2:482)；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.,1970,48:443)的同源性比对算法；Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),1988,85:2444)；和/或通过这些算法的计算机实现(例如，Wisconsin遗传学软件包7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)。包含此类算法的现成的计算机程序包括例如BLASTN、BLASTP、Gapped BLAST、PILEUP、CLUSTALW等。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各个程序的默认参数。或者，从业者可根据他或她的实验要求和/或其它要求使用非默认参数(参见例如，URL为www.ncbi.nlm.nih.gov的网站)。

所提供的具有编码参与木糖代谢的基因的核酸和包含所述核酸的核酸构建体的消耗木糖的微生物包括但不限于藻类(例如，微藻)、真菌(包括酵母)、细菌或原生生物。微生物任选地选自长喙壶菌属(Oblongichytrium)、臭壶菌属(Aurantiochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)和吾肯氏壶菌属(Ulkenia)或其任何混合物。任选地，微生物群体包括破囊壶菌，如美国专利第5,340,594号和第5,340,742号(所述美国专利引用以其整体并入本文)中所述的破囊壶菌属。微生物可以是破囊壶菌属的种，诸如美国专利第8,163,515号(其通过引用以其整体并入本文)中描述的以ATCC登录号PTA-6245(即，ONC-T18)保藏的破囊壶菌属的种。因此，微生物可具有与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高(例如，包括100％)同一性的18s rRNA序列。任选地，所述微生物是破囊壶菌科的微生物。微生物可以是破囊壶菌属的种，诸如美国专利第8,163,515号(其通过引用以其整体并入本文)中描述的以ATCC登录号PTA-6245(即，ONC-T18)保藏的破囊壶菌属的种。所述微生物可以是ONC-T18。

如本文中所用，术语破囊壶菌属是指破囊壶菌目的任何成员，其包括破囊壶菌科。描述为破囊壶菌(thraustochytrids)的菌株包括以下生物体：目：破囊壶菌目(Thraustochytriales)；科：破囊壶菌科；属：破囊壶菌属(物种：种，arudimentale、金黄色破囊壶菌(aureum)、benthicola、球破囊壶菌(globosum)、金尼破囊壶菌(kinnei)、动孢破囊壶菌(motivum)、多增殖性破囊壶菌(multirudimentale)、厚皮破囊壶菌(pachydermum)、层出破囊壶菌(proliferum)、粉红破囊壶菌(roseum)、纹带破囊壶菌(striatum))、吾肯氏壶菌属(物种：种，变形吾肯氏壶菌(amoeboidea)、科格伦吾肯氏壶菌(kerguelensis)、小吾肯氏壶菌(minuta)、深海吾肯氏壶菌(profunda)、辐射吾肯氏壶菌(radiata)、塞仑氏吾肯氏壶菌(sailens)、沙氏吾肯氏壶菌(sarkariana)、斯佐凯氏吾肯氏壶菌(schizochytrops)、威瑟氏吾肯氏壶菌(visurgensis)、优肯氏破囊壶菌(yorkensis))、裂殖壶菌属(物种：种，聚生裂殖壶菌(aggregatum)、黎姆氏裂殖壶菌(limnaceum)、红树林裂殖壶菌(mangrovei)、微小裂殖壶菌(minutum)、八孢裂殖壶菌(octosporuni))、日本壶菌属(Japoniochytrium)(物种：种，海日本壶菌(marinum))、不动壶菌属(Aplanochytrium)(物种：种，haliotidis、科格伦不动壶菌(kerguelensis)、普罗弗达不动壶菌(profunda)、斯托凯不动壶菌

在所提供的制备具有增加的木糖消耗的菌株的方法中，可将微生物培养一天或多天。任选地，在一个或多个培养步骤中将微生物培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。任选地，在一个或多个培养步骤中将微生物培养3至7天。在特定培养步骤中培养微生物的天数可以与任何其它培养步骤中的培养天数相同或不同。例如，微生物可以在第一培养基中培养3天，并且可以在第二培养基中培养4天。

在所提供的方法中，重复培养和收获步骤多次。例如，可将培养和收获步骤重复3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次、25次、26次、27次、28次、29次或30次。任选地，在第四至第二十五种培养基中将培养和收获步骤(d)和(e)重复4-25次。

多种培养基中的任一种都适合用于培养本文所述的微生物。任选地，培养基为微生物提供各种营养成分，包括碳源和氮源。因此，任选地，培养基中的一种或多种还包含葡萄糖。例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七培养基等中的一种或多种培养基还可包含葡萄糖。

当培养基包含多种碳源时，可以以特定的浓度比提供碳源。例如，培养基中一种或多种的葡萄糖与木糖的浓度比可以为2:2至2:5或2:2与2:5之间的任何比率。任选地，培养基中的一种或多种包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的木糖重量/体积。任选地，培养基中的一种或多种包含5％的木糖重量/体积。任选地，培养基中的一种或多种包含20至200g/L木糖或20至200g/L木糖内的任何值或范围。

任选地，木糖是半纤维素木糖。通常，半纤维素木糖原料主要包含木糖和一定的葡萄糖。举例来说，半纤维素木糖原料可包含200至450g/L的木糖和20至60g/L的葡萄糖。

当一种或多种培养基还包含葡萄糖时，所述葡萄糖可以是半纤维素葡萄糖。通常，半纤维素原料主要包含葡萄糖和一定的木糖。举例来说，半纤维素木糖原料可包含40至100g/L的木糖和500至600g/L的葡萄糖。

任选地，培养基中的一种或多种可包含另外的碳源。碳源的实例包括脂肪酸(例如，油酸)、脂质、甘油、三甘油(triglycerols)、碳水化合物、多元醇、氨基糖以及任何种类的生物质或废物流。碳水化合物包括但不限于纤维素、半纤维素、果糖、葡萄糖、木糖、乳果糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、糖原、明胶、淀粉(玉米或小麦)、乙酸酯、间肌醇(例如，源自玉米浆)、半乳糖醛酸(例如，源自果胶)、L-岩藻糖(例如，源自半乳糖)、龙胆二糖、葡糖胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸酯(例如，源自葡萄糖)、纤维二糖、糊精、α-环糊精(例如自淀粉)和蔗糖(例如，来自糖蜜)。多元醇包括但不限于麦芽糖醇、赤藓糖醇和阿东糖醇。氨基糖包括但不限于N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺和N-乙酰基-β-D-甘露糖胺。

还提供了通过所提供的产生木糖消耗增加的微生物的方法制备的分离的微生物群体。通过所提供的方法制备的微生物群体比它们的亲本对应物(例如，对照消耗木糖的微生物)更加能够使用半纤维素原料。微生物群体可在包含半纤维素木糖作为唯一碳源的培养基中消耗至少2g/L/h的半纤维素木糖。任选地，微生物群体可在包含半纤维素木糖和半纤维素葡萄糖的培养基中消耗至少3g/L/h的半纤维素木糖。任选地，与对照消耗木糖的微生物相比，所述微生物群体具有降低的木糖醇产量。任选地，所述微生物群体包含3个、4个、5个或6个拷贝的木糖激酶，其可以是pirXK或任何其它合适的木糖激酶。

如所描述的，可在产生所需水平的目标化合物例如脂肪酸或特定脂肪酸的条件下培养通过本文提供的制备具有增加的木糖消耗速率的微生物的方法制备的分离的微生物。培养可以进行一至数天。任选地，所述方法还包括从微生物中提取油。所提供的方法包括根据本领域已知的方法培养微生物，从中获得油或进一步精制油的额外步骤或可与所述额外步骤结合使用。

提供了生长通过所提供的方法(其用于产生木糖消耗增加的微生物，即，具有增加的木糖消耗的微生物)产生的分离的微生物或微生物群体的方法。所述方法包括在包含1:10至1:1的葡萄糖：木糖比率和高浓度氮源的生长培养基中培养微生物。

还提供了减少培养物中木糖醇产量的方法，所述培养物包含通过所提供的方法(其用于制备木糖消耗增加的微生物)产生的分离的微生物或微生物群体。所述方法包括在包碳源和高浓度氮源的生长培养基中培养分离的微生物。任选地，碳源包含葡萄糖和木糖。任选地，生长培养基包含1:10至1:1的葡萄糖：木糖比率。任选地，葡萄糖是半纤维素葡萄糖，并且木糖是半纤维素木糖。

培养基可包含20至200g/L木糖或20至200g/L木糖内的任何值或范围。任选地，所述木糖是半纤维素木糖。通常，半纤维素木糖原料主要包含木糖和一定的葡萄糖。举例来说，半纤维素木糖原料可包含200至450g/L的木糖和20至60g/L的葡萄糖。任选地，所述葡萄糖可以是半纤维素葡萄糖。通常，半纤维素原料主要包含葡萄糖和一定的木糖。举例来说，半纤维素木糖原料可包含40至100g/L的木糖和500至600g/L的葡萄糖。因此，所提供的方法包括在以1:10至1:1的比率包含半纤维素葡萄糖：半纤维素木糖的生长培养基中培养微生物。

如本文中所用，高浓度的氮源意指生长培养基包含至少30g/L的氮源。任选地，生长培养基包含20至40g/L的氮源或30至40g/L的氮源。所述培养基可包含多种氮源中的任一种。示例性氮源包括铵溶液(例如，NH

任选地，不对半纤维素碳源进行预处理。如本文中所用，术语预处理(pretreat)、预处理的(pretreated)或预处理(pretreatment)是指去除可能在物理上或生物学上影响培养物生长的杂质。预处理的实例包括化学处理以沉淀和去除杂质，调节pH以匹配培养环境的pH，过滤或离心以去除悬浮的固体。

任选地，培养基中的一种或多种可包含如本文所述的另外的碳源。

本文所用的培养基中的一种或多种可包括盐水或盐，所述培养基包括在制备木糖消耗增加的微生物的方法中以及培养通过所提供的方法制备的微生物群体并在所述微生物群体中降低木糖醇消耗的方法中。所选择的培养基任选地包括NaCl、天然或人造海盐和/或人造海水。破囊壶菌可在例如盐浓度为约0.5g/L至约50.0g/L、约0.5g/L至约35g/L或约18g/L至约35g/L的培养基中培养。任选地，本文所述的破囊壶菌可在低盐条件(例如，盐浓度为约0.5g/L至约20g/L或约0.5g/L至约15g/L)下生长。

或者，培养基可包含具有或不具有NaCl的不含氯化物的钠盐作为钠源。适用于本发明方法的用途的非氯化钠盐的实例包括但不限于苏打灰(碳酸钠和氧化钠的混合物)、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠及其混合物。参见，例如，美国专利第5,340,742号和第6,607,900号，所述美国专利通过引用完全并入本文。例如，总钠的相当一部分可以由非氯化物盐提供，使得培养基中少于总纳的约100％、75％、50％或25％是氯化钠。

培养基任选地包含磷酸盐，诸如磷酸钾或磷酸钠。培养基中的无机盐和微量营养素可包括硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰氯化钙和EDTA。可包括诸如盐酸吡多辛、盐酸硫胺素、泛酸钙、对氨基苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素B12等维生素。

可以在适当的情况下使用酸或碱和/或使用氮源将培养基的pH调节至3.0至10.0，包括3.0至10.0。任选地，可对培养基进行灭菌。

通常，用于微生物培养的培养基是液体培养基。然而，用于微生物培养的培养基可以是固体培养基。除了本文论述的碳源和氮源以外，固体培养基还可包含一种或多种可提供结构支撑和/或使培养基呈固体形式的组分(例如琼脂或琼脂糖)。

可将通过培养通过所提供的方法制备的分离的微生物或微生物群体而产生的所得生物质巴氏消毒以使生物质中存在的不希望的物质失活。例如，可对生物质进行巴氏消毒以灭活降解化合物的物质，诸如降解酶。生物质可存在于发酵培养基中或从发酵培养基中分离出来用于巴氏消毒步骤。巴氏消毒步骤可通过将生物质和/或发酵培养基加热至高温来进行。例如，可将生物质和/或发酵培养基加热至约50℃至约95℃(例如，约55℃至约90℃或约65℃至约80℃)的温度。任选地，可将生物质和/或发酵培养基加热约30分钟至约120分钟(例如，约45分钟至约90分钟，或约55分钟至约75分钟)。巴氏消毒可使用合适的加热方式进行，例如通过直接蒸汽注入。

可根据多种方法，包括本领域技术人员当前已知的那些方法来收获生物质。例如，可使用例如离心(例如，使用固体喷射离心机)和/或过滤(例如，错流过滤)从发酵培养基中收集生物质。任选地，收获步骤包括使用用来加速收集细胞生物质的沉淀剂(例如，磷酸钠或氯化钙)。

生物质任选地用水洗涤。可将生物质浓缩至约20％的固体。例如，可将生物质浓缩为约1％至约20％的固体，约5％至约20％，约7.5％至约15％的固体或在所述范围内的任何范围的固体。

在生物质处理之后，可从由提供的方法制备的分离的微生物或微生物群体中提取油。任选地，可将油例如通过冬化(winterization)进一步加工。在冬化之前，使用多种方法中的一种或多种，包括本领域技术人员目前已知的方法，从生物质或微生物中获得或提取油或多不饱和脂肪酸。例如，在美国专利第8,163,515号(其通过引用以其整体并入本文)中描述了分离油或多不饱和脂肪酸的方法。或者，如美国公布第2015/0176042号(其通过引用以其整体并入本文)中所述，分离油或多不饱和脂肪酸。任选地，所述一种或多种多不饱和脂肪酸选自由以下组成的组：α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ亚麻酸、亚油酸、亚麻酸及其组合。

从提供的分离的微生物或微生物群体中获得的油、脂质或其衍生物(例如，多不饱和脂肪酸(PUFA)和其它脂质)可用于利用其生物学、营养或化学特性的多种应用中的任一种。因此，油、脂质或其衍生物可用于生产生物燃料。任选地，油、脂质或其衍生物用于药物、营养制品、食品补充剂、动物饲料添加剂、化妆品等。

任选地，可将所述油或生物质掺入最终产品(例如，食品或饲料补充剂、婴儿配方食品、药物、燃料等)中。任选地，可将生物质掺入动物饲料中，例如用于牛、马、鱼或其它动物的饲料。任选地，可将油掺入营养或膳食补充剂如维生素中。可以掺入油或脂质的合适的食物或饲料添加剂包括饮料诸如牛奶、水、运动饮料、能量饮料、茶和果汁；糖食诸如糖果、果冻和饼干；含脂肪的食物和饮料，诸如乳制品；加工食品，诸如软米(或粥)；婴儿配方食品；早餐谷物等。

任选地，可将其中的一种或多种油或化合物(例如，PUFA)掺入到营养制品或药品中。此类营养制品或药物的实例包括各种类型的片剂、胶囊剂、可饮用剂等。任选地，营养制品或药物适合于局部应用或口服应用。剂型可包括例如胶囊剂、油剂、颗粒剂、浓缩颗粒剂(granula subtilae)、散剂、片剂、丸剂、锭剂等。

可将根据本文描述的方法产生的油或其油部分与多种其它剂中的任一种组合掺入产品中。例如，可将所述油或生物质与一种或多种粘合剂或填充剂、螯合剂、色素、盐、表面活性剂、保湿剂、粘度调节剂、增稠剂、软化剂、香料、防腐剂等或其任意组合组合。

公开了可用于、可结合用于、可用于制备的材料、组合物和组分，或是所公开方法的产品和组合物。本文公开了这些和其它材料，并且应当理解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，尽管可能不能明确地公开每个不同的个体和这些化合物的各种组合和排列的具体参考，但是每个都应具体考虑并在本文描述。例如，如果方法被公开和讨论，并且讨论了对方法中包括的一些分子所做的一些修饰，那么方法的每个组合、每个排列和可能的修改是被特别考虑的，除非明确相反的说明。同样，这些的任何子集或组合也被具体考虑并公开。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于所公开的组合物中使用的方法步骤。因此，如果有多个可以执行的附加步骤，应当理解，这些附加步骤中的每个附加步骤可以以公开的方法中任何特定的方法步骤或方法步骤的组合来执行，并且每个这样的组合或组合的子集应具体考虑并考虑公开。

本文引用的出版物以及它们引用的材料据此通过引用明确地整体并入。

以下实施例意在进一步说明本文所述方法和组合物的某些方面，而非意在限制权利要求的范围。

实施例

实施例1.在实验室级和半纤维素碳源上的菌株生长。

使用表1中所述的菌株。

表1.菌株说明。

用于发酵的培养基组成和半纤维素碳水化合物流的特性描述于表2和表3中。

表2：不包括碳浓度的一般发酵培养基组成

表3：木糖和葡萄糖半纤维素原料的组成

通过木糖耗竭测试检查了7-7、Gxs1 7-7、AspTx 7-7和51-7代谢实验室级(非半纤维素)木糖的能力(图1)。这些烧瓶发酵展示了代谢木糖和定量转化为木糖醇的木糖量的能力，所述木糖醇可抑制生长。图1A-图1F显示了与未用任何参与木糖代谢的基因转化的野生型细胞(ONC-T18)相比，在所有菌株中木糖代谢增加并且转化为木糖醇的木糖减少。

使用7-7、Gxs1 7-7和51-7菌株测定了木糖醇浓度对葡萄糖和木糖消耗的影响。这些测定表明，理想地，木糖醇浓度应保持低于约1g/L(图2A-图2D和表4)，以避免生长抑制。

表4：对于Gsx1 7-7的在不同浓度的木糖醇下的所使用的木糖、所使用的葡萄糖和生物质。

在木糖耗竭烧瓶测定中，将Gxs1 7-7与含有20g/L木糖和8g/L葡萄糖并掺入浓度递增的木糖醇(如表4所示)的培养基一起使用。表4中的值是144小时后产生的生物质总量和使用的木糖。显示了48小时时的葡萄糖使用量。

当在半纤维素木糖中生长时，利用51-7和Gxs1 7-7进行的发酵测定显示出类似的木糖醇限制(图3A、图3B和图3C、表5)。使用半纤维素木糖原料以2L分批进料规模研究了51-7和Gxs1 7-7的性能。如表4所述，将细胞在培养基中生长72小时，并分批加入60g/L葡萄糖。72小时后，如表4所述，用900mL培养基填充发酵罐，并通过高压灭菌进行灭菌。一旦发酵罐冷却，加入100mL准备好的细胞培养物，并向接种的容器喂入半纤维素木糖原料。将进料保持低于30g/L，并根据木糖的消耗速率继续进料。在整个发酵过程中，搅拌速度从500RPM增加到1000RPM，以确保两种菌株均达到最大消耗速率。每天进行两次采样，以使用HPLC监测生长和碳消耗。结果和发酵参数概述于表5中。

表5：利用51-7和Gxs1 7-7以及半纤维素木糖进行2L规模分批进料发酵的发酵参数

在烧瓶测定中显示培养基中的低氮浓度与亲本菌株和51-7的木糖醇产量增加相关(图4)，这表明应提高培养基中的氮浓度以使木糖醇产量保持较低。

在烧瓶发酵中进一步测试了7-7、Gxs1 7-7和AspTx 7-7在含有实验室级或半纤维素碳源的培养基中生长的能力。将菌株在含有半纤维素木糖的烧瓶中生长。或者，使菌株在比率为1:10的实验室级木糖和葡萄糖中生长，所述比率模拟半纤维素木糖原料中的比率。在由实验室级碳流组成的培养基中，7-7、Gxs1 7-7和AspTx 7-7使用的木糖为野生型亲本菌株(ONC-T18)的约6至8倍。然而，在具有半纤维素木糖的培养基中，7-7不消耗木糖，而Gxs1 7-7和AspTx 7-7分别消耗了82％和44％的可用木糖。结果示于表6。

表6：在含有实验室级碳源或半纤维素木糖的培养基中，利用WT、7-7、Gxs1 7-7和AspTx 7-7进行的烧瓶测定中的代谢的木糖和产生的木糖醇。

在含有实验室级1:10的葡萄糖：木糖的培养基中，7-7、Gxs1 7-7和AspTx 7-7使用的木糖为野生型亲本菌株的约6至9.5倍。在具有半纤维素木糖的培养基中，7-7不消耗木糖，而Gxs1 7-7和AspTx 7-7消耗的木糖分别为野生型的11倍和6倍。这些烧瓶测定还显示，取决于培养基包含实验室级碳源还是半纤维素碳源，Gxs1 7-7和AspTx7-7使用木糖的能力不同。例如，尽管在具有实验室级碳源的培养基中，AspTx 7-7使用的木糖为Gxs1 7-7的1.6倍，但是在含半纤维素碳源的培养基中，Gxs1 7-7使用的木糖为AspTx 7-7的1.8倍。这种根据碳源的差异使用意味着可以针对特定碳源优化菌株(表6)。

还在烧瓶实验中确定了优选的葡萄糖：木糖比率。使菌株在含有不同比率的葡萄糖：木糖的培养基中生长7至9天，每次处理一式两份。每两天取样一次并离心，收集上清液进行HPLC分析以确定木糖、葡萄糖和木糖醇的浓度，并将沉淀物干燥以进行生物质测定。结果示于表7。

表7：使用7-7和Gxs1 7-7菌株测试不同的碳源比率对木糖使用和木糖醇产量的影响

使用实验室级的葡萄糖：木糖和衍生自木糖半纤维素原液的碳水化合物，当葡萄糖：木糖比率在约1:10至1:1的范围内时，木糖消耗会增加。对于生物质生产或木糖消耗，在约20g/L至30g/L的浓度范围内的半纤维素木糖是优选的(表7)。

还测试了递增的半纤维素木糖浓度。细胞在培养基中生长2-3天。沉淀在9g/L盐水中洗涤两次。然后，用所述洗涤过的细胞将含有20g/L、30g/L、40g/L或50g/L的半纤维素木糖的培养基接种至OD600为0.5。在各个时间点取样，并通过HPLC分析上清液中残留的碳水化合物的量。在含有半纤维素木糖的培养基中，取决于培养基中半纤维素木糖的量，51-7XP16使用的木糖为原始51-7菌株的1.2倍至8.8倍(图9)。

还测试了菌株使用半纤维素葡萄糖的能力。半纤维素葡萄糖的组成在表5中。细胞在培养基中生长2-3天。沉淀在9g/L盐水中洗涤两次。然后，用所述洗涤过的细胞将含有30g/L、40g/L或50g/L的半纤维素葡萄糖的培养基接种至OD600为0.5。在各个时间点取样，并通过HPLC分析上清液中残留的碳水化合物的量。该传代的菌株在含有半纤维素葡萄糖的培养基中使用葡萄糖的能力不受妨碍(图10)。

实施例2.改善木糖消耗的菌株适应。

菌株7-7、AspTx 7-7和51-7用于通过在含有木糖作为唯一碳源的培养基或同时含有葡萄糖和木糖的培养基中传代菌株来提高木糖消耗。具体而言，通过将菌株在具有或不具有20g/L葡萄糖的含有50g/L木糖的培养基中培养3至7天，取出一部分培养物，将该部分加入新鲜培养基中并重复该过程多次来进行菌株传代。每轮传代包括将菌株在具有或不具有20g/L葡萄糖的含有50g/L木糖的培养基中培养3至7天，然后取出一部分培养物，并将该部分加入新鲜培养基中。菌株被传代多达22次。在每次传代中制备甘油原液以保存每个阶段。

为了测试传代菌株的木糖消耗，将细胞在培养基中生长2-3天并沉淀。沉淀在9g/L盐水中洗涤两次。然后，用洗涤的细胞将含有50g/L木糖(5％木糖)的培养基或含有20g/L葡萄糖和50g/L木糖(2:5葡萄糖：木糖)的培养基接种至OD600为0.05。在各个时间点取样，并通过HPLC分析上清液中残留的碳水化合物的量。测试结果示于图5和图5B中。在进行实验室适应方案后，亲本菌株Iso-His#16并未改善。然而，7-7和AspTx 7-7的传代导致木糖使用增加的菌株(图5A和图5B)。图6A、图6B、图6C和图6D显示了当在含有2:5葡萄糖：木糖或5％木糖(即，50g/L木糖)的各种培养基中生长时，51-7传代菌株的木糖使用和木糖醇产量得到提高。与未传代的亲本菌株相比，传代5至22次的菌株的木糖使用提高到1.5倍至5.5倍的范围。(图5和6)。

从传代菌株中获取细胞提取物以分析酶活性。这些传代菌株的细胞提取物表明，所述菌株具有较高的木糖异构酶和木酮糖激酶的酶促活性。图7A和图7B显示了51-7传代菌株(51-7XP5、51-7XP9、51-7XP13、51-7XP16和51-7XP22)的数据。

为了分析基因拷贝数变化是否促成木糖消耗的差异，对51-7原始(未传代的)菌株和51-7传代菌株进行了Southern印迹分析。使用标准方案进行Southern印迹。将条带信号强度以上样对照信号(IMP)作归一化，然后计算传代菌株中木糖异构酶基因(xi)和pirXK条带以及51-7原始(ori)基因的相对强度。通过Southern印迹，在51-7原始菌株(在图8中称为ori)与传代菌株之间的条带模式上未观察到变化。然而，条带的强度相对于上样对照确实改变，表明木糖异构酶和木酮糖激酶的拷贝数可能增加(图8)。

实施例3.51-7XP16适应菌株的分析。

使用30g/L实验室级木糖，然后以与如表5中所述的半纤维素木糖原料相似的比例用实验室级木糖和葡萄糖的原料进行进料，来进行一式两份使用51-7XP16的2L分批进料发酵。进料通常保持低于30g L-1木糖；然而，由于木糖消耗速率的降低，在两个容器中约70小时后，两个容器中的51-7XP16的木糖浓度均大于30g/L。总体而言，在93小时时，平均最终生物质浓度为57g/L(图11A)。51-7XP16菌株的平均木糖消耗速率为3.62g/L/h，峰值木糖消耗速率为4.99g/L/h(图11B)。发酵结果和其它细节概述于表8中。

表8：使用51-7XP16和实验室级木糖-葡萄糖原料的规模化分批进料发酵的发酵参数和平均结果

总体而言，以与半纤维素木糖流相似的浓度使用实验室级木糖和葡萄糖的51-7XP16菌株产生的平均木糖速率为3.6g/L/h，最终生物质为57g/L，总脂肪酸含量为545mg/g。所述菌株的脂肪酸谱示于图12中。

然后分析了51-7XP16在半纤维素碳源和不同浓度的氮上的生长能力。已显示在存在增加的氮源(40g/L)的情况下进行发酵可提高半纤维素木糖的使用。(图13和表9)。通过将氮源的浓度从表4所示的原始浓度加倍到40g/L，研究了提高51-7的性能。还通过在其中一个容器的氮耗竭过程中将原料切换为半纤维素葡萄糖来研究增加生物质积累。将细胞在如表4所述的培养基中生长72小时，并分批加入60g/L的葡萄糖。72小时后，用900mL如表4所述的培养基填充发酵罐，并通过高压灭菌进行灭菌。一旦发酵罐冷却，加入100mL准备好的细胞培养物。如表9所述，向发酵罐中分批加入实验室级木糖，并用半纤维素原料进行进料。表4中描述了培养基的组成。1号容器的进料保持低于30g/L木糖，并根据木糖消耗速率继续进行。类似地向2号容器进料，不同之处在于一旦除去氮，就更换了原料。在整个发酵过程中，将搅拌速度从500RPM增加到1000RPM，以确保达到最大消耗速率。最后，利用2倍的氮(40g/L(NH

表9：利用51-7XP16以及半纤维素木糖的2L规模的分批进料发酵的发酵参数

尽管平均木糖消耗在1.6g/L/h至2.3g/L/h的范围内，但与51-7XP16对实验室级木糖的消耗相比，51-7XP16消耗的总木糖有所增加(分别为287g木糖对比230g木糖)。脂肪酸谱示于图14中。

还在5L、30L和3200L的体积下证明了51-7XP16在半纤维素葡萄糖流上高效生长的能力。分批给发酵液添加30g/L的葡萄糖，并用掺混有实验室级葡萄糖的半纤维素葡萄糖进行进料。将5L和30L容器用在培养基中生长72小时的细胞接种，而将3200L容器用100L种子接种，所述种子在190L容器中于28℃和pH 5.75下的培养基中生长24小时。5L、30L和3200L的发酵在28℃、pH 5.75和1vvm的通气下进行。参数示于表10中。

表10：利用半纤维素葡萄糖以5L、30L和3200L进行的51-7XP发酵的参数。

进行5L发酵，并使用1:1的实验室级葡萄糖与半纤维素葡萄糖的比率进行进料，以评估与野生型菌株相比的51-7XP16的性能。两种菌株的发酵均在74小时时完成，其中51-7XP16的最终生物质为89g/L，野生型菌株的最终生物质为112g/L，51-7XP16的油为763.6mg/g，野生型亲本菌株ONC-T18的油为773.7mg/g。

用于5L、10L和51-7XP16 3200L规模的进料策略使得进行葡萄糖饥饿，以促进了木糖的消耗。平均葡萄糖消耗速率为10.8g/L/h，而平均木糖消耗速率为0.7g/L/h。不同的代谢速率导致木糖积累高达11.12g/L的木糖，而没有细胞外木糖醇积累。对3200L规模进行连续进料，这降低了木糖醇的产量。

尽管51-7XP16有时产生的生物质少于野生型，但其比野生型菌株(ONC-T18)代谢的木糖更多，产生更少的木糖醇。51-7XP16使用68％的木糖，产生1.4g/L的木糖醇，而野生型使用52％的木糖，产生1.5g/L的木糖醇。

与5L的野生型(ONC-T18)相比，51-7XP16使用的木糖多至1.3倍。该过程可扩展到30L和3200L，其中51-7XP在3200L时使用51％的木糖(图15、图16和图17)。

与野生型(ONC-T18)相比，木糖增强菌株使用了高达51.16％的进料的木糖，同时避免了木糖醇的产生。另外，51-7XP16使用的木糖平均为野生型的2.8倍。

序列表

<110> 玛拉可再生能源公司(MARA RENEWABLES CORPORATION)

<120> 微生物在半纤维素衍生碳水化合物中生长的适应和工艺优化

<130> 095523-1161193

<150> US 62/749,554

<151> 2018-10-23

<160> 12

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1723

<212> DNA

<213> 破囊壶菌属某种(Thraustochytrium sp.)

<400> 1

gtagtcatac gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg taagtataag cgattatact 60

gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt tatgatttct tcggtatttt ctttatatgg 120

atacctgcag taattctgga attaatacat gctgagaggg cccgactgtt cgggagggcc 180

gcacttatta gagttgaagc caagtaagat ggtgagtcat gataattgag cagatcgctt 240

gtttggagcg atgaatcgtt tgagtttctg ccccatcagt tgtcgacggt agtgtattgg 300

actacggtga ctataacggg tgacggggag ttagggctcg actccggaga gggagcctga 360

gagacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgtaa attacccaat gtggactcca 420

cgaggtagtg acgagaaata tcaatgcggg gcgcttcgcg tcttgctatt ggaatgagag 480

caatgtaaaa ccctcatcga ggatcaactg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt 540

aattccagct ccagaagcgt atgctaaagt tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaatt 600

tctggggcgg gagccccggt ctttgcgcga ctgcgctctg tttgccgagc ggctcctctg 660

ccatcctcgc ctcttttttt agtggcgtcg ttcactgtaa ttaaagcaga gtgttccaag 720

caggtcgtat gacctggatg tttattatgg gatgatcaga tagggctcgg gtgctatttt 780

gttggtttgc acatctgagt aatgatgaat aggaacagtt gggggtattc gtatttagga 840

gctagaggtg aaattcttgg atttccgaaa gacgaactac agcgaaggca tttaccaagc 900

atgttttcat taatcaagaa cgaaagtctg gggatcgaag atgattagat accatcgtag 960

tctagaccgt aaacgatgcc gacttgcgat tgcggggtgt ttgtattgga ccctcgcagc 1020

agcacatgag aaatcaaagt ctttgggttc cggggggagt atggtcgcaa ggctgaaact 1080

taaaggaatt gacggaaggg caccaccagg agtggagcct gcggcttaat ttgactcaac 1140

acgggaaaac ttaccaggtc cagacatagg taggattgac agattgagag ctctttcttg 1200

attctatggg tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg agtgatttgt ctggttaatt 1260

ccgttaacga acgagacctc ggcctactaa atagcggtgg gtatggcgac atacttgcgt 1320

acgcttctta gagggacatg ttcggtatac gagcaggaag ttcgaggcaa taacaggtct 1380

gtgatgccct tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgatgggttc aacgggtggt 1440

catcgttgtt cgcagcgagg tgctttgccg gaaggcatgg caaatccttt caacgcccat 1500

cgtgctgggg ctagattttt gcaattatta atctccaacg aggaattcct agtaaacgca 1560

agtcatcagc ttgcattgaa tacgtccctg ccctttgtac acaccgcccg tcgcacctac 1620

cgattgaacg gtccgatgaa accatgggat gaccttttga gcgtttgttc gcgagggggg 1680

tcagaactcg ggtgaatctt attgtttaga ggaaggtgaa gtc 1723

<210> 2

<211> 1320

<212> DNA

<213> 破囊壶菌属某种(Thraustochytrium sp.)

<400> 2

atggagttct tccccgaggt ggccaaggtg gagtacgccg gccccgagag ccgcgacgtc 60

ctggcgtata gatggtacaa caaggaagag gtagtgatgg ggaagaaaat gaaggagtgg 120

ctgaggttct cggtgtgctt ttggcatacc tttcgcggaa acgggtcgga cccctttggc 180

aagcccacca tcacgcaccg cttcgcaggc gacgatggtt cggacaccat ggagaacgcc 240

ctccggcgcg ttgaggcggc ctttgagctc tttgtcaagc tcggcgtgga gttctactcc 300

tttcacgacg tcgatgtggc gcctgagggc aagacgctca aggagacaaa cgagaacctg 360

gacaagatca cggaccgcat gctcgagctg caacaggaga cgggcgtcaa gctgctctgg 420

ggcactgcca acttgttctc tcatccgcga tacatgaacg gcgggtcaac aaacccggat 480

cccaaggtct ttgtgcgcgc cgccgcgcag gtgaaaaagg ccatcgacgt gacccacaaa 540

ctcggtggcg aaggctttgt gttctggggc ggtcgggagg gttacatgca cattctcaac 600

acggatatgg tccgtgaaat gaatcattac gcgaaaatgc tcaagatggc catcgcctac 660

aagaaaaaga tcggcttcgg cgggcagatc ctggtcgaac ccaagccccg cgagcccatg 720

aagcaccagt atgactacga cgtgcagacc gtcattggct ttctcagaca gcacggcctg 780

gaaaacgagg tcagcctcaa cgtggagccc aatcacacgc agctcgccgg gcacgagttt 840

gagcacgatg tcgtcctcgc cgcgcagctc ggcatgctcg gcagcgtcga cgccaacacg 900

ggctccgaga gcctcgggtg ggacacggac gagttcatca ccgaccaaac gcgcgccact 960

gtgctttgca aggccatcat tgagatgggt ggtttcgttc agggcggtct caactttgac 1020

gccaaggtcc gtcgggagag caccgacccg gaggacctct ttatcgctca tgtcgcctcg 1080

attgacgcgc tcgccaaggg tctgcgcaac gcttcgcagc tcgtttctga cggccgcatg 1140

cgcaaaatgc tccaggaccg gtacgccggc tgggatgagg gcatcggaca aaagattgag 1200

attggggaaa cctcgcttga ggacctcgag gcccactgcc tgcaggacga cacggaacca 1260

gtcaagacgt cggccaagca ggagaaattc cttgccgttc tcaaccacta catttcctaa 1320

<210> 3

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

atgtacatcg gcatcgacct cggcacctcg ggcgtcaagg tcatcctcct caacgagcag 60

ggcgaggtcg tcgccgccca gaccgagaag ctcaccgtct cgcgcccgca cccgctctgg 120

tcggagcagg acccggagca gtggtggcag gccaccgacc gcgccatgaa ggccctcggc 180

gaccagcact cgctccagga cgtcaaggcc ctcggcatcg ccggccagat gcacggcgcc 240

accctcctcg acgcccagca gcgcgtcctc cgcccggcca tcctctggaa cgacggccgc 300

tgcgcccagg agtgcaccct cctcgaggcc cgcgtcccgc agtcgcgcgt catcaccggc 360

aacctcatga tgccgggctt caccgccccg aagctcctct gggtccagcg ccacgagccg 420

gagatcttcc gccagatcga caaggtcctc ctcccgaagg actacctccg cctccgcatg 480

accggcgagt tcgcctcgga catgtcggac gccgccggca ccatgtggct cgacgtcgcc 540

aagcgcgact ggtcggacgt catgctccag gcctgcgacc tctcgcgcga ccagatgccg 600

gccctctacg agggctcgga gatcaccggc gccctcctcc cggaggtcgc caaggcctgg 660

ggcatggcca ccgtcccggt cgtcgccggc ggcggcgaca acgccgccgg cgccgtcggc 720

gtcggcatgg tcgacgccaa ccaggccatg ctctcgctcg gcacctcggg cgtctacttc 780

gccgtctcgg agggcttcct ctcgaagccg gagtcggccg tccactcgtt ctgccacgcc 840

ctcccgcagc gctggcacct catgtcggtc atgctctcgg ccgcctcgtg cctcgactgg 900

gccgccaagc tcaccggcct ctcgaacgtc ccggccctca tcgccgccgc ccagcaggcc 960

gacgagtcgg ccgagccggt ctggttcctc ccgtacctct cgggcgagcg caccccgcac 1020

aacaacccgc aggccaaggg cgtcttcttc ggcctcaccc accagcacgg cccgaacgag 1080

ctcgcccgcg ccgtcctcga gggcgtcggc tacgccctcg ccgacggcat ggacgtcgtc 1140

cacgcctgcg gcatcaagcc gcagtcggtc accctcatcg gcggcggcgc ccgctcggag 1200

tactggcgcc agatgctcgc cgacatctcg ggccagcagc tcgactaccg caccggcggc 1260

gacgtcggcc cggccctcgg cgccgcccgc ctcgcccaga tcgccgccaa cccggagaag 1320

tcgctcatcg agctcctccc gcagctcccg ctcgagcagt cgcacctccc ggacgcccag 1380

cgctacgccg cctaccagcc gcgccgcgag accttccgcc gcctctacca gcagctcctc 1440

ccgctcatgg cctaa 1455

<210> 4

<211> 1669

<212> DNA

<213> 梨囊鞭菌属某种(Piromyces sp.)

<400> 4

gtaaatggct aaggaatatt tcccacaaat tcaaaagatt aagttcgaag gtaaggattc 60

taagaatcca ttagccttcc actactacga tgctgaaaag gaagtcatgg gtaagaaaat 120

gaaggattgg ttacgtttcg ccatggcctg gtggcacact ctttgcgccg aaggtgctga 180

ccaattcggt ggaggtacaa agtctttccc atggaacgaa ggtactgatg ctattgaaat 240

tgccaagcaa aaggttgatg ctggtttcga aatcatgcaa aagcttggta ttccatacta 300

ctgtttccac gatgttgatc ttgtttccga aggtaactct attgaagaat acgaatccaa 360

ccttaaggct gtcgttgctt acctcaagga aaagcaaaag gaaaccggta ttaagcttct 420

ctggagtact gctaacgtct tcggtcacaa gcgttacatg aacggtgcct ccactaaccc 480

agactttgat gttgtcgccc gtgctattgt tcaaattaag aacgccatag acgccggtat 540

tgaacttggt gctgaaaact acgtcttctg gggtggtcgt gaaggttaca tgagtctcct 600

taacactgac caaaagcgtg aaaaggaaca catggccact atgcttacca tggctcgtga 660

ctacgctcgt tccaagggat tcaagggtac tttcctcatt gaaccaaagc caatggaacc 720

aaccaagcac caatacgatg ttgacactga aaccgctatt ggtttcctta aggcccacaa 780

cttagacaag gacttcaagg tcaacattga agttaaccac gctactcttg ctggtcacac 840

tttcgaacac gaacttgcct gtgctgttga tgctggtatg ctcggttcca ttgatgctaa 900

ccgtggtgac taccaaaacg gttgggatac tgatcaattc ccaattgatc aatacgaact 960

cgtccaagct tggatggaaa tcatccgtgg tggtggtttc gttactggtg gtaccaactt 1020

cgatgccaag actcgtcgta actctactga cctcgaagac atcatcattg cccacgtttc 1080

tggtatggat gctatggctc gtgctcttga aaacgctgcc aagctcctcc aagaatctcc 1140

atacaccaag atgaagaagg aacgttacgc ttccttcgac agtggtattg gtaaggactt 1200

tgaagatggt aagctcaccc tcgaacaagt ttacgaatac ggtaagaaga acggtgaacc 1260

aaagcaaact tctggtaagc aagaactcta cgaagctatt gttgccatgt accaataagt 1320

taatcgtagt taaattggta aaataattgt aaaatcaata aacttgtcaa tcctccaatc 1380

aagtttaaaa gatcctatct ctgtactaat taaatatagt acaaaaaaaa atgtataaac 1440

aaaaaaaagt ctaaaagacg gaagaattta atttagggaa aaaataaaaa taataataaa 1500

caatagataa atcctttata ttaggaaaat gtcccattgt attattttca tttctactaa 1560

aaaagaaagt aaataaaaca caagaggaaa ttttcccttt tttttttttt tgtaataaat 1620

tttatgcaaa tataaatata aataaaataa taaaaaaaaa aaaaaaaaa 1669

<210> 5

<211> 395

<212> PRT

<213> 变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)

<400> 5

Met Asn Tyr Gln Pro Thr Ser Glu Asp Arg Phe Thr Phe Gly Leu Trp

1 5 10 15

Thr Val Gly Trp Gln Gly Leu Asp Pro Phe Gly Asp Ala Thr Arg Glu

20 25 30

Ala Leu Asp Pro Ala Glu Ser Val Arg Arg Leu Ser Gln Leu Gly Ala

35 40 45

Tyr Gly Val Thr Phe His Asp Asp Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ser Ser

50 55 60

Asp Asn Glu Arg Gly Val Ala His Gly Ala Gly Val Ala His Gln Ala

65 70 75 80

Val Pro Ala Gly Ala Gly Arg Asp Arg His Glu Gly Ala Asp Gly Asp

85 90 95

Asp Glu Pro Val His Ala Pro Gly Cys Ser Arg Asp Gly Ala Phe Thr

100 105 110

Ala Asn Asp Arg Asp Val Arg Gly Thr Arg Cys Ala Arg Ala Ile Arg

115 120 125

Asn Ile Asp Leu Ala Val Glu His Val Ala Arg Ala Ser Thr Cys Ala

130 135 140

Trp Gly Gly Arg Glu Gly Ala Glu Ser Gly Ala Ala Lys Asp Val Arg

145 150 155 160

Asp Ala Leu Asp Arg Met Lys Glu Ala Phe Asp Leu Leu Gly Glu Tyr

165 170 175

Val Thr Glu Gln Gly Tyr Asp Leu Lys Phe Ala Ile Glu Pro Lys Pro

180 185 190

Asn Glu Pro Arg Gly Asp Ile Leu Leu Pro Thr Val Gly His Ala Leu

195 200 205

Ala Phe Ile Glu Arg Leu Glu Arg Pro Glu Leu Tyr Gly Val Asn Pro

210 215 220

Glu Val Gly His Glu Gln Met Ala Gly Leu Asn Phe Pro His Gly Ile

225 230 235 240

Ala Gln Ala Leu Trp Ala Gly Lys Leu Phe His Ile Asp Leu Asn Gly

245 250 255

Gln Ser Gly Ile Lys Tyr Asp Gln Asp Leu Arg Phe Gly Ala Gly Asp

260 265 270

Leu Arg Ala Ala Phe Trp Leu Val Asp Leu Leu Glu Arg Ala Gly Tyr

275 280 285

Ala Gly Pro Arg His Phe Asp Phe Lys Pro Pro Arg Thr Glu Asn Phe

290 295 300

Asp Ala Val Trp Pro Ser Ala Ala Gly Cys Met Arg Asn Tyr Leu Ile

305 310 315 320

Leu Lys Asp Arg Ala Ala Ala Phe Arg Ala Asp Pro Gln Val Gln Glu

325 330 335

Ala Leu Ala Ala Ala Arg Leu Asp Glu Leu Ala Arg Pro Thr Ala Glu

340 345 350

Asp Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala Asp Arg Ser Ala Tyr Asp Thr Phe

355 360 365

Asp Val Asp Ala Ala Ala Ala Arg Gly Met Ala Phe Glu His Leu Asp

370 375 380

Gln Leu Ala Met Asp His Leu Leu Gly Ala Arg

385 390 395

<210> 6

<211> 2040

<212> DNA

<213> 梨囊鞭菌属某种(Piromyces sp.)

<400> 6

attatataaa ataactttaa ataaaacaat ttttatttgt ttatttaatt attcaaaaaa 60

aattaaagta aaagaaaaat aatacagtag aacaatagta ataatatcaa aatgaagact 120

gttgctggta ttgatcttgg aactcaaagt atgaaagtcg ttatttacga ctatgaaaag 180

aaagaaatta ttgaaagtgc tagctgtcca atggaattga tttccgaaag tgacggtacc 240

cgtgaacaaa ccactgaatg gtttgacaag ggtcttgaag tttgttttgg taagcttagt 300

gctgataaca aaaagactat tgaagctatt ggtatttctg gtcaattaca cggttttgtt 360

cctcttgatg ctaacggtaa ggctttatac aacatcaaac tttggtgtga tactgctacc 420

gttgaagaat gtaagattat cactgatgct gccggtggtg acaaggctgt tattgatgcc 480

cttggtaacc ttatgctcac cggtttcacc gctccaaaga tcctctggct caagcgcaac 540

aagccagaag ctttcgctaa cttaaagtac attatgcttc cacacgatta cttaaactgg 600

aagcttactg gtgattacgt tatggaatac ggtgatgcct ctggtaccgc tctcttcgat 660

tctaagaacc gttgctggtc taagaagatt tgcgatatca ttgacccaaa acttttagat 720

ttacttccaa agttaattga accaagcgct ccagctggta aggttaatga tgaagccgct 780

aaggcttacg gtattccagc cggtattcca gtttccgctg gtggtggtga taacatgatg 840

ggtgctgttg gtactggtac tgttgctgat ggtttcctta ccatgtctat gggtacttct 900

ggtactcttt acggttacag tgacaagcca attagtgacc cagctaatgg tttaagtggt 960

ttctgttctt ctactggtgg atggcttcca ttactttgta ctatgaactg tactgttgcc 1020

actgaattcg ttcgtaacct cttccaaatg gatattaagg aacttaatgt tgaagctgcc 1080

aagtctccat gtggtagtga aggtgtttta gttattccat tcttcaatgg tgaaagaact 1140

ccaaacttac caaacggtcg tgctagtatt actggtctta cttctgctaa caccagccgt 1200

gctaacattg ctcgtgctag tttcgaatcc gccgttttcg ctatgcgtgg tggtttagat 1260

gctttccgta agttaggttt ccaaccaaag gaaattcgtc ttattggtgg tggttctaag 1320

ctgatctctg gagacaaatt gccgctgata tcatgaacct tccaatcaga gttccacttt 1380

tagaagaagc tgctgctctt ggtggtgctg ttcaagcttt atggtgtctt aagaaccaat 1440

ctggtaagtg tgatattgtt gaactttgca aagaacacat taagattgat gaatctaaga 1500

atgctaaccc aattgccgaa aatgttgctg tttacgacaa ggcttacgat gaatactgca 1560

aggttgtaaa tactctttct ccattatatg cttaaattgc caatgtaaaa aaaaatataa 1620

tgccatataa ttgccttgtc aatacactgt tcatgttcat ataatcatag gacattgaat 1680

ttacaaggtt tatacaatta atatctatta tcatattatt atacagcatt tcattttcta 1740

agattagacg aaacaattct tggttccttg caatatacaa aatttacatg aatttttaga 1800

atagtctcgt atttatgccc aataatcagg aaaattacct aatgctggat tcttgttaat 1860

aaaaacaaaa taaataaatt aaataaacaa ataaaaatta taagtaaata taaatatata 1920

agtaatataa aaaaaaagta aataaataaa taaataaata aaaatttttt gcaaatatat 1980

aaataaataa ataaaatata aaaataattt agcaaataaa ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040

<210> 7

<211> 1803

<212> DNA

<213> 酵母属某种(Saccharomyces sp.)

<400> 7

atgttgtgtt cagtaattca gagacagaca agagaggttt ccaacacaat gtctttagac 60

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tctctgttag agcaattgaa taagaaaccg gaaaaagatt tattgcacta cgtgagctct 420

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attcatccaa ctctgccaaa ccattatatg ggtatgattt gttattgtaa tggttctttg 1080

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taa 1803

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<212> PRT

<213> 毕赤酵母属某种(Pichia sp.)

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<212> DNA

<213> 曲霉菌属某种(Aspergillus sp.)

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ggtttcgata tctcgtcgat gtcggccatc atcgagaccg atgcctatct ctgttacttc 120

aaccaggctc ctgtcactta cgatgatgat ggcaagaggg tctgtcaggg ccccagcgcg 180

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tcgggtttca tctcggacag gcttggtcgt cgtactgcca ttcagatcgg ttccatcatc 300

tggtgcattg gatccatcat tgtctgtgcc tcccagaaca ttcccatgct gatcgtcggt 360

cgtatcatca acggtctgag tgtgggtatc tgctccgctc aggtgccagt gtatatttcg 420

gagattgctc ctccaaccaa gcgtggtcgt gtcgtcggtc tgcaacaatg ggctattacc 480

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gccttccgga ttccctgggg tctgcagatg atccctgccg tgctattgtt cctgggtatg 600

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gctgttttga ccctcgtcca cggtcaggga gacccgagct ctccctttgt gcagcgtgaa 720

tatgaagaga tcaagagcat gtgcgagttt gagcgccaaa acgcggatgt ctcctacctc 780

gagctgttca agcccaacat gcttaaccgt acccatgtgg gtgttttcgt tcagatctgg 840

tctcagttga ctggaatgaa cgtcatgatg tactacatca cctacgtctt tgccatggcc 900

ggcttgaaag gtaacaacaa cttgatctcc tccagtatcc agtacgtgat caacgtgtgc 960

atgactgtgc cggctctggt gtggggtgat cagtggggcc gtcgcccgac cttcttgatc 1020

ggttccctct tcatgatgat ctggatgtac attaatgctg gtctgatggc cagctacggt 1080

catcccgcgc cgcccggcgg tctcaacaac gtggaagccg agtcctgggt catccacggc 1140

gcgcccagca aggctgtcat tgccagtacc tacctcttcg tagcctcata cgccatctcc 1200

ttcggccccg ccagctgggt gtacccgccg gaactcttcc ctctgcgtgt gcgcggcaag 1260

gctaccgccc tctgcacttc agccaactgg gccttcaact tcgccctcag ctattttgtc 1320

cccccggcat ttgtcaacat ccagtggaag gtctacatcc tcttcggtgt cttctgtact 1380

gccatgttct tgcacatttt cttcttcttt cccgagacca cgggtaagac cctggaagag 1440

gtcgaggcca tcttcactga tcccaatggt attccgtaca tcggtactcc cgcctggaag 1500

acaaagaacg agtactcgcg cggtgcacac attgaggagg ttggctttga agatgagaag 1560

aaggttgctg gtgggcagac tatccaccag gaggtcacgg ctactccgga taagattgct 1620

tga 1623

<210> 10

<211> 1644

<212> DNA

<213> 假丝酵母属某种(Candida sp.)

<400> 10

atgtcacaag attcgcattc ttctggtgcc gctacaccag tcaatggttc catccttgaa 60

aaggaaaaag aagactctcc agttcttcaa gttgatgccc cacaaaaggg tttcaaggac 120

tacattgtca tttctatctt ctgttttatg gttgccttcg gtggtttcgt cttcggtttc 180

gacactggta ccatttccgg tttcgtgaac atgtctgact ttaaagacag attcggtcaa 240

caccacgctg atggtactcc ttacttgtcc gacgttagag ttggtttgat gatttctatt 300

ttcaacgttg gttgcgctgt cggtggtatt ttcctctgca aggtcgctga tgtctggggt 360

agaagaattg gtcttatgtt ctccatggct gtctacgttg ttggtattat tattcagatc 420

tcttcatcca ccaagtggta ccagttcttc attggtcgtc ttattgctgg tttggctgtt 480

ggtaccgttt ctgtcgtttc cccacttttc atctctgagg tttctccaaa gcaaattaga 540

ggtactttag tgtgctgctt ccagttgtgt atcaccttgg gtatcttctt gggttactgt 600

actacttacg gtactaagac ctacactgac tctagacagt ggagaattcc tttgggtttg 660

tgtttcgctt gggctatctt gttggttgtc ggtatgttga acatgccaga gtctccaaga 720

tacttggttg agaagcacag aattgatgag gccaagagat ccattgccag atccaacaag 780

atccctgagg aggacccatt cgtctacact gaggttcagc ttattcaggc cggtattgag 840

agagaagctt tggctggtca ggcatcttgg aaggagttga tcactggtaa gccaaagatc 900

ttcagaagag ttatcatggg tattatgctt cagtccttgc aacagttgac cggtgacaac 960

tacttcttct actacggtac taccattttc caggctgtcg gtttgaagga ttctttccag 1020

acttctatca ttttgggtat tgtcaacttt gcttccacct tcgttggtat ctatgtcatt 1080

gagagattgg gtagaagatt gtgtcttttg accggttccg ctgctatgtt catctgtttc 1140

atcatctact ctttgattgg tactcagcac ttgtacaagc aaggttactc caacgagacc 1200

tccaacactt acaaggcttc tggtaacgct atgatcttca tcacttgtct ttacattttc 1260

ttctttgctt ctacctgggc tggtggtgtt tactgtatca tttccgagtc ctacccattg 1320

agaattagat ccaaggccat gtctattgct accgctgcta actggttgtg gggtttcttg 1380

atttccttct tcactccatt catcaccagt gccatccact tctactacgg tttcgttttc 1440

actggttgtt tggctttctc tttcttctac gtctacttct tcgtctacga aaccaagggt 1500

ctttctttgg aggaggttga tgagatgtac gcttccggtg ttcttccact caagtctgcc 1560

agctgggttc caccaaatct tgagcacatg gctcactctg ccggttacgc tggtgctgac 1620

aaggccaccg acgaacaggt ttaa 1644

<210> 11

<211> 1569

<212> DNA

<213> 假丝酵母属某种(Candida sp.)

<400> 11

atgggtttgg aggacaatag aatggttaag cgtttcgtca acgttggcga gaagaaggct 60

ggctctactg ccatggccat catcgtcggt ctttttgctg cttctggtgg tgtccttttc 120

ggatacgata ctggtactat ttctggtgtg atgaccatgg actacgttct tgctcgttac 180

ccttccaaca agcactcttt tactgctgat gaatcttctt tgattgtttc tatcttgtct 240

gttggtactt tctttggtgc actttgtgct ccattcctta acgacaccct cggtagacgt 300

tggtgtctta ttctttctgc tcttattgtc ttcaacattg gtgctatctt gcaggtcatc 360

tctactgcca ttccattgct ttgtgctggt agagttattg caggttttgg tgtcggtttg 420

atttctgcta ctattccatt gtaccaatct gagactgctc caaagtggat cagaggtgcc 480

attgtctctt gttaccagtg ggctattacc attggtcttt tcttggcctc ttgtgtcaac 540

aagggtactg agcacatgac taactctgga tcttacagaa ttccacttgc tattcaatgt 600

ctttggggtc ttatcttggg tatcggtatg atcttcttgc cagagactcc aagattctgg 660

atctccaagg gtaaccagga gaaggctgct gagtctttgg ccagattgag aaagcttcca 720

attgaccacc cagactctct cgaggaatta agagacatca ctgctgctta cgagttcgag 780

actgtgtacg gtaagtcctc ttggagccag gtgttctctc acaagaacca ccagttgaag 840

agattgttca ctggtgtggc tatccaggct ttccagcaat tgaccggtgt taacttcatt 900

ttctactacg gtactacctt cttcaagaga gctggtgtta acggtttcac tatctccttg 960

gccactaaca ttgtcaatgt cggttctact attccaggta ttcttttgat ggaagtcctc 1020

ggtagaagaa acatgttgat gggtggtgct actggtatgt ctctttctca attgatcgtt 1080

gccattgttg gtgttgctac ctcggaaaac aacaagtctt cccagtccgt ccttgttgct 1140

ttctcctgta ttttcattgc cttcttcgct gccacctggg gtccatgtgc ttgggttgtt 1200

gttggtgagt tgttcccatt gagaaccaga gctaagtctg tctccttgtg tactgcttcc 1260

aactggttgt ggaactgggg tattgcttac gctactccat acatggtgga tgaagacaag 1320

ggtaacttgg gttccaatgt gttcttcatc tggggtggtt tcaacttggc ttgtgttttc 1380

ttcgcttggt acttcatcta cgagaccaag ggtctttctt tggagcaggt cgacgagttg 1440

tacgagcatg tcagcaaggc ttggaagtct aagggcttcg ttccatctaa gcactctttc 1500

agagagcagg tggaccagca aatggactcc aaaactgaag ctattatgtc tgaagaagct 1560

tctgtttaa 1569

<210> 12

<211> 1662

<212> DNA

<213> 毕赤酵母属某种(Pichia sp.)

<400> 12

atgtctgtag atgaaaatca attggagaat ggacaacttc tatcctccga aaatgaggca 60

tcatcacctt ttaaagagtc tatcccttct cgctcttccc tctacttaat agctcttaca 120

gtttcacttt tgggagttca attgacttgg tcggttgaac ttggttatgg tacaccgtat 180

ttattctcac ttggtcttcg taaagaatgg acttcaatta tatggattgc cggtcctttg 240

actggaatat taattcagcc aattgctggt atattgtccg accgggttaa ttcaagaata 300

ggtcggcgga gaccgttcat gctctgtgct agtttgttag gaacattcag cttattcctt 360

atgggctggg cccctgatat ttgcctcttt atatttagca atgaggttct aatgaaacgt 420

gttactatcg ttttggctac gattagcatt tatttgcttg acgtggccgt caatgtcgta 480

atggctagca ctcgatcttt aattgttgat tcagtccgtt cagatcaaca gcatgaagca 540

aattcctggg ctggaagaat gataggtgta ggcaatgtgc ttgggtactt actaggctat 600

ttacctctat atcgcatctt ctcctttctc aatttcacac agttacaggt gttttgcgta 660

cttgcctcca tttccttggt actcacagtt accatcacaa caatatttgt gagtgaaagg 720

agattcccac cagttgaaca cgagaaatcg gttgctggag aaatctttga attttttaca 780

actatgcgac aaagtattac cgcacttcca tttacattaa aaagaatttg ttttgttcaa 840

ttttttgcat actttggatg gtttccattt ttgttttata ttactaccta tgtgggtatt 900

ttatatttac gccatgctcc taaaggccat gaagaagatt gggacatggc gactcgtcaa 960

gggtcgttcg cattactgct ttttgctatc atttctcttg ccgcaaatac agcacttcca 1020

ttgttgctcg aggacacgga ggatgatgag gaggacgaat cgagtgatgc atctaataat 1080

gaatacaaca ttcaagaaag aaacgatctc ggaaatataa gaactggtac taatacaccc 1140

cgtcttggta atttgagcga aacaacttct ttccgttcgg aaaatgagcc ctcacgacgc 1200

aggcttttac cgtctagtag atcaattatg acaacgatat cctccaaggt acaaatcaaa 1260

ggacttactc ttcctattct gtggttgagc tcccatgtcc tttttggtgt ttgtatgttg 1320

agcacgatat tcttgcaaac atcatggcaa gcgcaggcaa tggtagctat ctgtggactg 1380

tcctgggcat gtactctatg gattccatat tcgctatttt cttcagaaat agggaagctt 1440

ggattacgag aaagcagtgg caaaatgatt ggtgttcaca atgtatttat atctgccccc 1500

caagtgttga gcaccatcat tgccaccatt gtatttattc aatcggaggg cagtcatcga 1560

gacatcgccg acaatagtat agcatgggtg ttgagaattg gaggtatatc tgcatttcta 1620

gccgcgtacc aatgccggca tcttttgccc atcaactttt ga 1662