柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法和接种方法

摘要

本发明提供一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法和接种方法，涉及生物技术领域。本发明的分离纯化方法包括：取感染鸡粪便，加水，过滤；离心，沉淀加入饱和食盐水，离心，上清液加水得卵囊稀释液；离心，沉淀加入氯胺T溶液，得孢子化卵囊悬液；离心，沉淀加入饱和食盐水重悬，离心收集卵囊沉淀；加入次氯酸钠溶液重悬，收集卵囊；震荡破碎，待孢子囊全部逸出停止震荡，离心得到孢子囊，加入胰酶消化液进行消化，过滤离心收集沉淀，得柔嫩艾美耳球虫子孢子。本发明的接种方法是将上述孢子囊或子孢子精准注射于小鸡肌胃和小肠中段，实现成功感染。本发明的纯化方法得到的孢子囊和子孢子的纯化程度高，实验操作简便，注射接种后感染成功率达100％。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法和接种方法。

背景技术

球虫病被认为是家禽的重要传染病之一，每年给全世界养禽业造成超过20亿英镑的经济损失。艾美耳球虫是引起家禽球虫病的主要病原，可造成腹泻、体重减轻、产蛋量减少等症状，有时甚至死亡。此外，艾美耳球虫的感染可促进其他病原体(如产气荚膜梭菌)的机会性感染。并且，其卵囊对环境的耐受性很强，这使得控制措施变得相当困难。常规的疾病控制策略主要依赖于预防性用药，但是引起鸡球虫病的艾美耳球虫已对大多数抗球虫药产生了耐药性。因此，近年来国内外学者对鸡球虫虫种的鉴定、基因编辑、遗传稳定性和疫苗开发等方面进行了大量的研究工作。

鸡球虫孢子化卵囊包含4个孢子囊，孢子囊间的遗传基因存在不一致的现象，但每个孢子囊含2个基因组一致的子孢子。用于分子遗传学研究的群体必须基因组完全一致，而传统的单卵囊分离技术得到的产物存在基因组不纯的可能性，因此，单孢子囊和单子孢子接种获取克隆化群体的方式显得十分重要。已有研究报道，从既有早熟又有抗药性的卵囊群体中分离出单孢子囊，经分子遗传学鉴定得出口服接种的后代只来源于2种母系卵囊，说明单孢子囊接种的群体在遗传基因上是一致的，即真正意义上的克隆化群体。

目前，现有技术已经能够实现卵囊、孢子囊和子孢子的分离纯化，例如采用DE-52阴离子交换色谱纯化球虫子孢子。但是，在这种方法需要耗费的时间较长，涉及的器材较多，为获取克隆化卵囊群体带来较高的不稳定性。现有技术中也有利用显微镜分离单孢子囊，并建立柔嫩艾美耳球虫克隆的报道，但是成功率仅为17.8％。现有技术中还有报道，利用显微镜操作吸取单子孢子，并注射于解剖后暴露的鸡盲肠内，实现单子孢子的分离与接种，但是其成功率也仅达22％，而且操作难度系数大，精密设备需求度高，给研究带来诸多不便。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法，得到的孢子囊和子孢子的纯化程度高，接种后感染成功率大大提升。

一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1、取感染柔嫩艾美耳球虫的鸡的粪便，加水稀释，过筛网，保留滤液；

S2、将滤液离心，收集沉淀，加入饱和食盐水重悬，离心，收集上清液，加水稀释，得到卵囊稀释液；

S3、将卵囊稀释液离心，收集沉淀，加入氯胺T溶液，待卵囊孢子化后，得到孢子化卵囊悬液；

S4、将孢子化卵囊悬液离心，收集沉淀，加入饱和食盐水重悬，离心，收集卵囊；

S5、向卵囊沉淀中加入次氯酸钠溶液重悬，离心，收集上层的卵囊；

S6、取卵囊，配制成悬液，进行震荡破碎，待全部孢子囊逸出，停止震荡，离心，收集沉淀，得到孢子囊；

S7、取孢子囊，配制成悬液，离心收集沉淀，加入胰酶消化液，消化至全部的子孢子释放，停止消化，离心收集沉淀，配制成悬液，过滤，所得沉淀即为柔嫩艾美耳球虫子孢子。

本发明的分离纯化方法，通过对常规的分离纯化方法进行改进，采用氯胺T作为诱导剂，使用玻璃珠进行震荡破碎(8-10min)，延长消化时间(60-90min)，并利用优化的胰酶消化液进行消化，先使孢子囊全部逸出，再通过消化使子孢子全部逸出，后用G3砂芯漏斗过滤子孢子，有助于孢子囊和子孢子的纯化，提高子孢子的提取率。而且，本发明的分离纯化方法对精密设备或仪器的依赖程度低，采用实验室常规试剂和设备即可实现柔嫩艾美耳球虫孢子囊和子孢子的高效纯化。

在其中一个实施例中，所述步骤S1具体为：将柔嫩艾美耳球虫接种于1-2周龄的麻鸡，感染后5-6天进行球虫检测，收取6-10天的含有柔嫩艾美耳球虫卵囊的粪便；加2-3倍体积的水稀释粪便，依次过80目、100目、300目筛网，保留滤液。

在其中一个实施例中，所述步骤S2具体为：将滤液在1400-1600rpm下离心3-4min，收集沉淀，加入1-3倍体积的食盐水，2700-2900rpm下离心3-4min，收集上清液，加入4-6倍体积水稀释，得到卵囊稀释液。

在其中一个实施例中，所述步骤S3具体为：将卵囊稀释液在3200-3400rpm下离心1-3min，收集沉淀，加水洗涤，离心，保留沉淀，加入浓度为1.0w/v％的氯胺T溶液，卵囊浓度为10-20万个/mL，28℃下培养，待卵囊孢子化后，得到孢子化卵囊悬液。

在其中一个实施例中，所述步骤S4具体为：将孢子化卵囊悬液在3500-3700rpm下离心4-6min，收集沉淀，加水洗涤，3500-3700rpm下离心4-6min，保留沉淀，加入饱和食盐水重悬，收集上层卵囊，加入4-6倍体积水洗涤，3500-3700rpm下离心4-6min，收集卵囊沉淀。

在其中一个实施例中，所述步骤S5具体为：向卵囊沉淀中加入4-6倍体积的浓度为30w/v％的次氯酸钠溶液重悬，0℃下静置5-7min，3500-3700rpm下离心4-6min，收集上层卵囊，加水洗涤，离心后保留沉淀，得到卵囊。

在其中一个实施例中，所述步骤S6具体为：取卵囊，配制成悬液，加入1-2倍体积的玻璃珠进行震荡破碎8-10min，待全部的孢子囊逸出，停止震荡，3500-3700rpm下离心4-6min，收集沉淀，得到孢子囊。

在其中一个实施例中，所述步骤S7具体为：取孢子囊，配制成悬液，加入胰酶消化液，在40-42℃下140-160rpm震荡消化60-90min，消化至全部的子孢子释放，停止消化，3500-4500rpm下离心8-12min，取沉淀加入PBS混匀，利用机械真空泵经G3砂芯漏斗过滤，3500-4500rpm下离心8-12min，沉淀即为柔嫩艾美耳球虫子孢子。

在其中一个实施例中，所述胰酶消化液为含有0.5w/v％胰蛋白酶和5w/v％牛磺脱氧胆酸钠的PBS缓冲溶液。

本发明还提供一种柔嫩艾美耳球虫子孢子的接种方法，取上述分离纯化方法得到的柔嫩艾美耳球虫子孢子，用PBS缓冲液重悬后，注射到鸡的小肠和/或静脉。

本发明还提供一种柔嫩艾美耳球虫孢子囊的接种方法，取上述分离纯化方法得到的柔嫩艾美耳球虫孢子囊，用PBS缓冲液重悬后，注射到鸡的肌胃和/或小肠。

本发明的接种方法，将孢子囊或子孢子精准注射于鸡的肌胃和/或小肠，避免经过嗉囊和肌胃时的机械性损伤，有利于提高孢子囊和子孢子的接种成功率，为单孢子囊和单子孢子的注射接种和获取克隆化卵囊群体奠定基础。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的分离纯化方法，通过对常规的分离纯化方法进行改进，采用氯胺T作为诱导剂，使用玻璃珠进行震荡破碎(8-10min)，延长消化时间(60-90min)，并采用优化的胰酶消化液进行消化，先使孢子囊全部逸出，再通过消化使子孢子全部逸出，后用G3砂芯漏斗过滤子孢子，有助于孢子囊和子孢子的纯化，提高子孢子的提取率。而且，本发明的分离纯化方法对精密设备或仪器的依赖程度低，采用实验室常规试剂和设备即可实现柔嫩艾美耳球虫孢子囊和子孢子的高效纯化。

本发明的接种方法，将孢子囊或子孢子精准注射于鸡的肌胃和/或小肠，避免经过嗉囊和肌胃时的机械性损伤，有利于提高孢子囊和子孢子的接种成功率，实验表明采用本发明纯化的孢子囊和子孢子的接种成功率达100％，为单孢子囊和单子孢子的注射接种和获取克隆化卵囊群体奠定基础。

附图说明

图1为实施例中纯化后的柔嫩艾美耳球虫卵囊、孢子囊和子孢子的形态图；

其中，A为纯化的孢子化卵囊，B为纯化的孢子囊，C为纯化的子孢子；

图2为实施中肌胃和小肠的注射位置图；

其中，A为1周龄清远麻鸡，B为肌胃与小肠的位置标注，C为溴酚蓝成功注射于肌胃，D为溴酚蓝成功注射于小肠；

图3为实施例中肌胃接种孢子囊的排卵囊曲线图；

图4为实施例中小肠接种孢子囊的排卵囊曲线图；

图5为小肠接种子孢子的排卵囊曲线图；

图6为静脉接种子孢子的排卵囊曲线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

柔嫩艾美耳球虫卵囊的繁殖与分离纯化。

1、将柔嫩艾美耳球虫增城株(ZC株)接种于5只1周龄清远麻鸡，于感染后第5天(5days post inoculation，5d p.i.)用饱和食盐水漂浮法进行球虫排查，收取6-10d p.i.的含卵囊粪便。

2、加2倍体积水稀释粪便，过80目金属网筛，过筛时揉捻粪便，于粪渣中再加2倍体积水，混匀后过80目金属网筛，收集滤液；滤液过100目金属网筛，过筛时揉捻粪便，收集的滤液再过300目尼龙网筛，收集滤液。

3、滤液置于离心管中，1500rpm离心3min，收集沉淀，去除上层白色尿酸盐杂质。用清水洗粪至上清液清澈，最后将沉淀合并。

4、擦拭离心管内壁水珠，沉淀中加2倍体积的饱和食盐水，2800rpm离心3min，收集上清液，加入5倍体积清水稀释。沉淀继续加2倍体积的饱和食盐水，2800rpm离心3min，收集上清液，合并上清液，得到卵囊稀释液。

5、将卵囊稀释液离心，3300rpm离心2min，用清水洗涤重悬。进行细胞计数。

6、离心，沉淀中加入1w/v％氯胺T溶液，卵囊浓度为10-20万卵囊/mL，28℃有氧震荡培养24h，得到新鲜孢子化卵囊混悬液，3600rpm离心5min(以下离心步骤均为此转速)，弃掉上清，加水洗涤3次，洗去氯胺T。

7、沉淀中加入饱和盐水重悬，离心，收集最上层的卵囊，加入5倍体积的水重悬，离心，收集卵囊沉淀。

8、向卵囊沉淀中加入5倍体积的30w/v％的次氯酸钠溶液重悬，冰浴静置6min，离心并收集最上层卵囊，加入5倍体积的水混匀，离心，用水清洗3次，洗去次氯酸钠。

9、向卵囊沉淀中加入适量1w/v％氯胺T溶液，于4℃保存备用。

实施例2

注射位置定位。

取3只1周龄的清远麻鸡进行临床试验。首先，取3只小鸡进行腹腔剖检，利用游标卡尺测量得出小鸡肌胃与小肠中段(空肠和回肠)的具体位置，分别记录器官距离鸡龙骨突尾端的长宽高。再取两只小鸡，用1mL注射器吸取溴酚蓝指示剂，对肌胃与小肠的预测位置进行活体注射。最后剖开小鸡腹腔，观察小肠、肌胃浆膜层和内容物中溴酚蓝的注射情况，最终确定肌胃和小肠注射的确切位置。

在正式进入接种实验之前，先了解1周龄麻鸡(图2A)的肌胃和小肠的具体位置。解剖小鸡腹腔后，以鸡胸骨尾端为中心，由游标卡尺进行测量，得出肌胃和小肠中段的位置：长8.0±1mm，宽9.4±1mm，深15±1mm(图2B)。以溴酚蓝为指示剂，于预测部位进行定点注射，结果如图，肌胃位于腹腔右侧，触摸即可轻易感知其位置，指示剂成功注射于肌胃(图2C)；小肠中段(空肠与回肠)位于腹腔左侧，指示剂成功注射于小肠(图2D)。综上，实验表明肌胃和小肠定位准确，指示剂成功地精准注射。

实施例3

柔嫩艾美耳球虫孢子囊纯化与接种。

1、取实施例1中纯化的孢子化卵囊，以体积比1:1加入无菌玻璃珠，震荡破碎10min，显微镜下观察至全部卵囊壁破碎，重复观察3次，待孢子囊全部逸出时停止震荡。用无菌PBS溶液洗3次，将洗过的孢子囊液于3600rpm下离心5min，弃上清。沉淀用20mL PBS混匀，用20μm孔径金属网筛过滤，3600rpm下离心5min，弃上清，加入10mL PBS混匀备用。

2、通过1mL注射器将纯化好的孢子囊注射到1周龄清远麻鸡的肌胃与小肠，肌胃组注射剂量为10万孢子囊/羽；设置对照组，同步注射相等体积PBS。小肠组注射剂量为10万孢子囊/羽；设置对照组，同步注射相等体积PBS。实验组与对照组均为5只小鸡。

实施例4

柔嫩艾美耳球虫子孢子纯化与接种。

1、将实施例1中纯化的孢子化卵囊，以体积比1:1加入无菌玻璃珠，震荡破碎10min，显微镜下观察至全部的卵囊壁破碎，孢子囊逸出，停止震荡。吸出孢子囊液，用PBS洗3次，将洗过的PBS和孢子囊液于3500-3700rpm下离心4-6min，弃上清。沉淀加入胰酶消化液(含0.75w/v％胰蛋白酶和10w/v％牛磺脱氧胆酸钠的PBS缓冲液，pH7.6)，于41℃150rpm恒温摇床，消化60min左右，镜检子孢子逸出情况，直到至全部子孢子释放，停止消化。将消化好的子孢子混合液吸至离心管，4℃4000r/min离心10min，弃上清，用PBS洗3次，重复离心，弃上清。沉淀加入少量PBS混匀，利用机械真空泵经G3砂芯漏斗过滤，用血球计数板进行子孢子计数，4℃保存，备用。

2、通过1mL注射器将纯化好的子孢子注射到清远麻鸡的翅下静脉与小肠，小肠组注射1周龄麻鸡，剂量为5万子孢子/羽；设置对照组，同步注射相等体积PBS。静脉组注射4周龄麻鸡，剂量为2万子孢子/羽；设置对照组，同步注射相等体积PBS。实验组与对照组均为5只小鸡。

实施例5

纯化后柔嫩艾美耳球虫卵囊、孢子囊和子孢子的形态观察。

对以上实施例中分离纯化后的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊、孢子囊和子孢子进行形态学观察，以观测、鉴别其生物学结构和证实球虫纯化的纯度。结果显示，孢子化卵囊(图1A)呈宽卵圆形，大小约为：24μm×19μm；孢子囊(图1B)呈卵圆形，大小约为15μm×6μm；子孢子(图1C)呈月牙状，大小约为10μm×2μm。并且，通过显微观察，卵囊、孢子囊和子孢子各自纯度较高，基本无杂质。

实施例6

卵囊排出动态监测。

1、卵囊数量检测方法

孢子囊接种肌胃组与小肠组，以及子孢子接种静脉组与小肠组，4-13d p.i.用麦氏计数板检测每克粪中的球虫含量(OPG)。取粪便2克，放入烧杯中，先加水5mL，搅拌混匀后，加饱和盐水至60mL，混匀后用60目铜筛网过滤，吸取粪液，注入麦克马斯特计数板的计数室内，静置5分钟后，在显微镜下计数两个刻度室中的卵囊(OPG)。两个计数室的虫卵数的平均值A乘以200，即为每克粪便中的卵囊数。按照如下公式计算每克粪便中卵囊OPG数量：

OPG＝(n1+n2)/2÷0.15×60÷2＝A×200

其中，(n1+n2)/2为平均每个计数室内卵囊数A，0.15为每个计数室有效体积为0.15mL，60为粪液总体积为60mL，2为所用粪便克数为2g。

2、孢子囊接种后排卵囊期

2.1、孢子囊接种肌胃后排卵囊期

于1周龄麻鸡肌胃精准注射纯化后的孢子囊(10万/羽)，共5只鸡；阴性对照组同步注射相同体积的PBS，共5只鸡。于4-13d p.i.检测OPG，称量每组每日的总粪重，计算每羽鸡每日的卵囊产量，制作肌胃接种孢子囊排卵囊曲线(图3)。结果显示，对照组为阴性，实验组中排卵囊期在6-12d p.i.，排卵囊高峰为7d p.i.，卵囊产量/羽为121.07×10

2.2、孢子囊接种小肠后排卵囊期

于1周龄麻鸡小肠中段分3点注射纯化后的孢子囊(10万/羽)，共5只鸡；阴性对照组同步注射相同体积的PBS，共5只鸡。于4-13d p.i.检测OPG，称量每组每日的总粪重，计算每羽鸡每日的卵囊产量，制作小肠中段接种孢子囊排卵囊曲线(图4)。结果显示，对照组为阴性，实验组中排卵囊期在7-12d p.i.，排卵囊高峰为9d p.i.，卵囊产量/羽为114.99×10

3、子孢子接种后排卵囊期

3.1、子孢子接种小肠后排卵囊期

于1周龄麻鸡小肠中段分3点注射纯化后的子孢子(5万/羽)，共5只鸡；阴性对照组同步注射相同体积的PBS，共5只鸡。于4-13d p.i.检测OPG，称量每组每日的总粪重，计算每羽鸡每日的卵囊产量，制作小肠中段接种子孢子排卵囊曲线(图5)。结果显示，对照组为阴性，实验组中排卵囊期在6-11d p.i.，排卵囊高峰为8d p.i.，卵囊产量/羽为56.32×10

3.2、子孢子静脉注射后排卵囊期

于4周龄麻鸡翅下静脉注射纯化后的子孢子(2万/羽)，共5只鸡；阴性对照组同步注射相同体积的PBS，共5只鸡。于4-13d p.i.检测OPG，称量每组每日的总粪重，计算每羽鸡每日的卵囊产量，制作子孢子注射静脉排卵囊曲线(图6)。结果表明，对照组和实验组均为阴性，于4-13d p.i.均无卵囊产生。

实施例7

接种成功率/感染成功率检测。

本实验中，将柔嫩艾美耳球虫子孢子和孢子囊注射接种于1周龄麻鸡的肌胃和/或小肠中段的情况下，实验组全部麻鸡(20只)于6-7d p.i.进行粪便检测，接种成功率达100％。

对比例1

柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊纯化的方法，与实施例1的纯化方法的主要区别在于，诱导卵囊孢子化的溶液和诱导条件不同，以及保存卵囊的保存剂不同。

具体方法如下：

(1)将粪便中加入5-10倍体积的自来水，搅拌均匀，然后用80目筛子进行过滤；此过程中需用塑料软铲不停搅动，使大部分的水溶液滤过筛网，收集至一塑料盆；滤后的粪渣置于另一塑料盆，粪渣再加入自来水，进一步过滤，最后弃去粪渣。

(2)将所有的滤过液用160目的筛子进行二次过滤，滤液收集至塑料盆中；滤液静止2h，然后快速倾去上清；将所得到的混悬液离心3600rpm 5min(以下离心均采此设置)，收集所存沉淀；

(3)用玻璃棒搅匀沉淀，加入2倍体积饱和盐水，搅匀，离心漂浮卵囊；所得的含卵囊上清倒入一个大烧杯中，将其均匀分配至离心罐中，加入至少5倍体积的自来水，然后离心沉淀卵囊；

(4)得到的卵囊沉淀用重铬酸钾溶液重悬，转移至小锥形瓶中，重铬酸钾的体积根据卵囊的数量决定，每毫升所含卵囊不超过100万；

(5)将收集到的卵囊接好吹气装置，置于28℃温箱通气孢子化，时间为48小时(注意24h时添加水，补偿吹气孵化所蒸发的水)；孢子化完毕，将卵囊做好标记保存于4℃。

本对比例中的诱导剂和保存剂均为重铬酸钾，其属于剧毒、易爆品，为实验过程和科研人员带来安全隐患。由此，本发明采取1％氯胺T作为孢子化卵囊的诱导剂和保存剂，其属于外用消毒剂，低毒，更安全、稳定。

对比例2

柔嫩艾美耳球虫子孢子纯化的方法，与实施例4的纯化方法的主要区别在于，卵囊破碎方式、消化液种类和子孢子纯化方式的不同。

具体方法如下：

(1)根据实验需要取一定数量的经次氯酸钠处理的孢子化卵囊，用PBS洗涤3次(3000rpm 3min)；卵囊沉淀加入1-2倍体积的PBS混匀后，加入到研磨器中进行研磨，镜检90％左右卵囊破碎时停止(从研磨器中取1微升研磨物镜检，视野中卵囊很少见时即可；将孢子囊悬液(含有少量卵囊、卵囊壁)从研磨器中转移到离心管，用PBS洗涤两次(3000rpm3min)；将孢子囊沉淀用脱囊缓冲液(0.75％胰蛋白酶和10％鸡胆汁)重悬，置41-42℃水浴孵育40分钟左右，其间每5分钟颠倒混匀一次；

(2)在30min时镜检子孢子的脱囊状况，一般在视野中少见孢子囊时即可停止孵育；离心除去脱囊缓冲液，用预热至42℃的甘氨酸洗脱液重悬沉淀并离心洗涤3次；

(3)子孢子的过柱纯化：所有沉淀用大约1mL甘氨酸洗脱液重悬，在纤维素基本沉降时将重悬液加入柱内，开始洗脱(此时流速应至10*档的3-4之间)，用50mL离心管收集洗脱液，此过程持续20min至1h不等，根据洗脱液中子孢子镜检的结果决定停止时间；过程中需不时用玻棒轻轻搅动纤维素上层直至中部，注意不得搅至底部，以防卵囊或卵囊壁等直接进入收集管；如果室温较低，应在洗脱前将安好红外灯，对层析柱进行加热保温；收集的洗脱液3000rpm 5min离心，所得沉淀即为纯化的子孢子，用完全Cytomix溶液重悬，转移至1.5mL离心管，备用。

采用本对比例的柔嫩艾美耳球虫孢子囊、子孢子的纯化方法，存在过程繁琐、耗时久的缺点，主要原因为：该方法核心为DE-52纤维素层析柱的制备，并利用其进行子孢子纯化；层析柱的制备需要1天的时间且实验过程繁琐；纤维素层析柱在超负荷纯化子孢子时容易被卵囊壁所堵塞。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。