一种乳酸联合木聚糖酶水解制备低聚木糖的方法

摘要

本发明提供了一种乳酸联合木聚糖酶水解制备低聚木糖的方法，属于生物质降解和转化技术领域。本发明将农林废弃物与体积浓度为0‑10％的乳酸溶液混合，进行催化反应，过滤，获得含有低聚木糖的处理液和滤渣，将滤渣与木聚糖酶溶液混合，进行酶解，获得含低聚木糖的酶解液。本发明采用稀酸结合酶水解法，可充分的将农林废弃物催化后的处理液和固体残渣中的木聚糖降解为低聚木糖，低聚木糖得率可达到70％。

说明书

技术领域

本发明属于生物质降解和转化技术领域，尤其涉及一种乳酸联合木聚糖酶水解制备低聚木糖的方法。

背景技术

我国每年生产的农林废弃物数量甚多，比如仅玉米芯就大约有1000万吨。其中多种农林废弃物含有大量木聚糖型半纤维素，如小麦秸秆、玉米秸秆、玉米芯等。玉米芯中含有大约35％的半纤维素、35％的纤维素和15％的木质素，其中半纤维素的主要组成为木聚糖，是生产低聚木糖的最佳原料之一。目前，常用低聚木糖的制备方法有酶解法、碱法、自水解法和酸法等。例如，Yoon等人(LWT-Food Science and Technology,2006,39(4):388-392)利用1.2IU/mL木聚糖酶水解玉米芯10～480min，可获得8.2％-18.3％的低聚木糖，但是产物色值高且纯度低；黄等人(食品与发酵工业，2004，(5))采用氢氧化钠提取玉米芯中的木聚糖再进行木聚糖酶解(800IU/g DM，40℃，6h)，可获得50％的低聚木糖，此过程工艺复杂、污染多，且玉米芯易与碱产生较重的色素，给低聚木糖生产后面的工序带来了很大的压力。Nabarlatz等人(Industrial&Engineering Chemistry Research,2004,43(15):4124-4131)在190℃条件下对玉米芯进行15min自水解，可获得58％的低聚木糖(聚合度≥2)，但是水热预处理反应温度和压力较高，对设备要求严格。据Zhang等人报道(Bioresource Technology,234(2017):343-349)，玉米芯经过20％(w/v)乙酸在140℃处理20min后，可获得45.9％的低聚木糖(聚合度2～6)，反应时间短且低聚木糖得率高，但是浓酸易对设备造成腐蚀且产物分离较困难。Xiao等人(Bioresource Technology,290(2019):121775)用2％(w/v)乳酸在170℃条件下预处理玉米秸秆40min最高可获得12.9％的低聚木糖(聚合度2～4)，但仍有大量木聚糖没能充分利用转化。

可见，现有技术制备低聚木糖的方法普遍存在原料木聚糖水解不充分，低聚木糖选择性低等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效、低聚木糖得率高的制备低聚木糖的方法，能够将农林废弃物中的木聚糖高效转化为低聚木糖，所制备的低聚木糖(木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖)的得率达70％。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种低聚木糖的制备方法，包括如下步骤：将农林废弃物与体积浓度为0-10％的乳酸溶液混合，进行催化反应，过滤，获得含有低聚木糖的处理液和滤渣；将滤渣与木聚糖酶溶液混合，进行酶解，获得含低聚木糖的酶解液。

优选的，所述农林废弃物包括玉米秸秆、小麦秸秆和玉米芯中的任意一种或几种。

优选的，所述农林废弃物与乳酸溶液的质量体积比为1g:5-20ml。

优选的，所述催化反应的温度为145-175℃，所述催化反应的时间为20-70min。

优选的，所述木聚糖酶的用量为200～1000U/g滤渣。

优选的，所述木聚糖酶为内切木聚糖酶。

优选的，所述木聚糖酶溶液与滤渣的体积质量比为1-10ml:20-200mg。

优选的，所述酶解的pH值为4.0-6.0。

优选的，调节pH值的调节剂为柠檬酸钠、氢氧化钠或柠檬酸-磷酸氢二钠中的一种或几种。

优选的，所述酶解的温度为48-52℃，所述酶解的时间为6-48h。

本发明的有益效果：

1、本发明选取乳酸为催化剂，充分利用乳酸质子解离度相对较低的弱酸性质，同时通过较温和的反应条件，使得农林废弃物中大部分的木聚糖的水解被控制在木二糖至木六糖阶段，使得木聚糖底物达到受控催化的水解效果，同时也克服了高温水解条件下抑制物多的不足，使催化后所得的处理液中含有大量低聚木糖，且充分利用催化后的固体残渣再进行木聚糖酶解制备低聚木糖，实现了农林废弃物木聚糖的充分利用。

2、本发明制备低聚木糖所用乳酸既是一种催化剂，也是一种饲料添加剂，因此低聚木糖中的乳酸可不经分离而直接用作饲料添加剂。

3、本发明极大程度的降解木聚糖为低聚木糖，最终低聚木糖得率达到70％，为迄今为止报道的最高水平。

4、本发明制备的低聚木糖的聚合度主要为2～6，可用于功能性饲料添加剂，也可经后处理用作功能性食品添加剂。

5、本发明制备的低聚木糖纯度较高，节省了后续分离纯化的成本。

附图说明

图1为本发明低聚木糖制备方法的流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种低聚木糖的制备方法，包括如下步骤：将农林废弃物与体积浓度为0-10％的乳酸溶液混合，进行催化反应，过滤，获得含有低聚木糖的处理液和滤渣；将滤渣与木聚糖酶溶液混合，进行酶解，获得含低聚木糖的酶解液。

本发明对于农林废弃物的种类没有特殊限定，采用本领域公知的含木聚糖型半纤维素的农林废弃物均可，优选的为含大量木聚糖型半纤维素的农林废弃物，如玉米秸秆、小麦秸秆、玉米芯等，在本发明某些实施例中，选择的是玉米芯。在本发明中，优选的是将农林废弃物粉碎后与体积浓度为0-10％的乳酸溶液混合。本发明对于粉碎的方式没有特殊限定，采用本领域常规粉碎方式均可，优选的为粉碎后过筛，所述过筛的目数优选为≤60目。本发明对于乳酸的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。本发明对所述乳酸溶液的配制方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规配制特定浓度的方法即可。在本发明中，配制乳酸溶液使用的乳酸的纯度优选为大于85％。在本发明中，当乳酸溶液的体积浓度为0％时，则表明本发明的技术方案为自水解协同木聚糖酶水解制备低聚木糖，当乳酸溶液的体积浓度大于0％且小于等于10％时，则表明本发明的技术方案为乳酸协同木聚糖酶水解制备低聚木糖。在本发明中，所述乳酸溶液的体积浓度优选为1-7％，更优选为2-5％。

在本发明中，所述所述农林废弃物与乳酸溶液的质量体积比优选为1g:5-20ml，更优选为1g:8-15ml，最优选为1g:10ml。在本发明中，所述催化反应的温度优选为145-175℃，更优选为155-165℃，最优选为160℃，所述催化反应的时间优选为20-70min，更优选为30-60min，进一步优选为40-50min。在本发明中，所述催化反应优选的是在密封反应釜中进行。

本发明对于过滤的方式没有特殊限定，采用本领域常规固液分离的方式均可。过滤后，获得含有低聚木糖的处理液和滤渣。优选的将滤渣水洗至中性，再与木聚糖酶溶液混合。水洗滤渣至中性可保证酶解液中pH值稳定，维持酶的活性，所述水优选为去离子水。

本发明对于木聚糖酶的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述木聚糖酶优选为内切木聚糖酶，更优选的为来源于米曲霉的木聚糖酶；所述木聚糖酶的用量优选为200～1000U/g滤渣，更优选为400-800U/g滤渣，最优选为600U/g滤渣；所述木聚糖酶溶液与滤渣的体积质量比优选为1-10ml:20-200mg，更优选为3-8ml:50-170mg，最优选为5-7ml:100-120mg。

在本发明中，将滤渣和木聚糖酶混合后，优选的用调节剂调节pH值后进行酶解，所述调节剂优选的为柠檬酸钠、氢氧化钠或柠檬酸-磷酸氢二钠中的一种或几种，更优选为柠檬酸钠；所述pH值优选为4.0-6.0，更优选为4.8。

在本发明中，所述酶解优选的是在恒温密封体系中进行，所述酶解的温度优选为48-52℃，更优选为49-51℃，最优选为50℃，所述酶解的时间优选为6-48h，更优选为20-34h。最优选为24h。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

乳酸催化：准确称取绝对干重为1g的玉米芯，按照1g:10ml的料液比加入体积浓度为2％的乳酸溶液，在160℃温度下，加热40min后，冷却，进行固液分离，得到含有低聚木糖的处理液；将滤渣用去离子水洗涤至中性得到固体残渣，自然风干。

木聚糖酶解：取绝对干重为0.06g滤渣于10ml离心管中，加入36U的木聚糖酶，柠檬酸钠缓冲液调节pH值至4.8，摇匀置于恒温摇床中50℃下酶解24h后，在沸水浴中煮沸10min使酶失活，冷却至室温，离心，上清液得到含低聚木糖的酶解液。

采用高效液相离子色谱检测处理液和酶解液中低聚木糖成分，色谱条件：美国Dionex ICS-3000离子色谱系统，配置CarboPacM PA200(3mm×250mm)色谱柱及保住柱(3×50mm)，ED电化学检测器，柱温30℃，进样体积10μL；以500mmol/L醋酸钠溶液(A)和100mmol/L氢氧化钠溶液(B)为淋洗液进行二元梯度淋洗，流速为0.3mL/min(洗脱程序：0min，100％A；30min，75％A，25％B；38～45min，100％A)。电化学检测器检测模式为金工作电极和pH-Ag/AgCl复合型参比电极，采用积分脉冲安培检测法和色谱峰面积积分法测定糖组分的含量谱系统。

根据下述公式分别计算处理液和酶解液中低聚木糖得率：

处理液中低聚木糖得率(％)＝处理液中产生低聚木糖的质量(g)/未处理玉米芯中木聚糖的质量(g)×100％

酶解液中低聚木糖得率(％)＝酶解液中低聚木糖质量(g)/未处理玉米芯中木聚糖的质量(g)×100％

公式中底物中的木聚糖含量依据美国国家可再生能源实验室方法测定。

结果如下：

处理液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的得率分别为18.5％、13.5％、13.4％、8.5％和6.0％，所测总低聚木糖得率为59.9％；酶解液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖得率分别为4.0％、2.1％、2.7％、0.9％和0.4％，所测总低聚木糖得率为10.1％。最后，经过催化和酶解法所得低聚木糖得率共计为70％。

实施例2

与实施例1的区别之处在于所述玉米芯没有进行乳酸催化处理，而是直接进行木聚糖酶解过程，其余酶解的条件等均同实施例1。

结果测得酶解液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖得率分别为11.1％、1.2％、1.6％、0.4％和0.2％，所测总低聚木糖得率为14.5％。

实施例3

与实施例1的区别之处在于乳酸水溶液的体积浓度为0％，其余均同实施例1。

结果测得处理液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的得率分别为12.5％、0.8％、1.2％、1.3％和1.4％，所测总低聚木糖得率为17.2％；酶解液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖得率分别为10.2％、2.1％、1.2％、0.5％和0.5％，所测总低聚木糖得率为14.5％。最后，经过催化和酶解法所得低聚木糖得率共计为31.7％。

实施例4

与实施例1的区别之处在于乳酸溶液的体积浓度为1％，其余均同实施例1。

结果测得处理液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的得率分别为9.1％、10.0％、12.1％、8.5％和10.1％，所测总低聚木糖得率为49.8％；酶解液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖得率分别为6.5％、1.9％、2.4％、0.7％和0.4％，所测总低聚木糖得率为11.9％。最后，经过催化和酶解法所得低聚木糖得率共计为61.7％。

实施例5

与实施例1的区别之处在于乳酸溶液的体积浓度为5％，其余均同实施例1。

结果测得处理液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的得率分别为17.7％、8.9％、7.6％、2.8％和1.7％，所测总低聚木糖得率为38.7％；酶解液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖得率分别为5.8％、2.0％、2.3％、0.5％和0.3％，所测总低聚木糖得率为10.9％。最后，经过催化和酶解法所得低聚木糖得率共计为49.6％。

实施例6

与实施例1的区别之处在于催化的时间为30min，其余均同实施例1。

结果测得处理液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的得率分别为6.1％、5.3％、7.5％、5.5％和5.4％，所测总低聚木糖得率为29.8％；酶解液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖得率分别为16.8％、6.9％、8.5％、3.1％和2.0％，所测总低聚木糖得率为37.3％。最后，经过催化和酶解法所得低聚木糖得率共计为67.1％。

实施例7

与实施例1的区别之处在于催化的时间为50min，其余均同实施例1。

结果测得处理液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的得率分别为17.6％、9.5％、8.6％、3.5％和2.2％，所测总低聚木糖得率为41.4％；酶解液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖得率分别为2.0％、0.7％、1.0％、0.1％和0.1％，所测总低聚木糖得率为3.9％。最后，经过催化和酶解法所得低聚木糖得率共计为45.3％。

实施例8

与实施例1的区别之处在于催化的温度为145℃，其余均同实施例1。

结果测得处理液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的得率分别为2.1％、1.8％、3.1％、2.3％和2.8％，所测总低聚木糖得率为12.1％；酶解液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖得率分别为11.0％、8.7％、5.0％、2.1％和1.1％，所测总低聚木糖得率为27.9％。最后，经过催化和酶解法所得低聚木糖得率共计为40.0％。

实施例9

与实施例1的区别之处在于催化的温度为175℃，其余均同实施例1。

结果测得处理液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的得率分别为10.2％、2.7％、2.2％、0.1％和0.2％，所测总低聚木糖得率为15.4％；酶解液中木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖得率分别为10.0％、8.7％、7.5％、5.1％和2.1％，所测总低聚木糖得率为33.4％。最后，经过催化和酶解法所得低聚木糖得率共计为48.8％。

由以上实施例可知，本发明提供的乳酸水解协同酶水解制备低聚木糖的方法通过乳酸催化将玉米芯中大量的木聚糖降解为低聚木糖，同时利用木聚糖酶将催化后固体残渣中的木聚糖继续降解为为低聚木糖，两步法制备的低聚木糖得率达到了70％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。