一种利用日本曲霉PJ01产酶降解西番莲果皮多糖的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种利用日本曲霉PJ01产酶降解西番莲果皮多糖的酶解修饰工艺及其应用，属于药用食品研发领域。本发明取西番莲果皮制备成西番莲果皮多糖，以日本曲霉PJ01为实验菌株，培养产出粗酶液与多糖混匀，进行酶解得到酶解修饰后的西番莲果皮多糖。结果显示经日本曲霉PJ01产酶降解后的西番莲果皮多糖具有更好的抗氧化活性，在抗氧化类保健品和化妆品中具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用日本曲霉PJ01产酶降解西番莲果皮多糖的酶解修饰工艺及其在制备抗氧化剂中的应用，属于药用食品研发领域。

背景技术

西番莲果皮多糖具有多种生物活性，如调节血糖血脂、抗氧化和抗肿瘤等作用，而多糖的活性与其结构、单糖含量等有着密切的联系，因此，需对多糖降解前后的结构与活性进行深入研究。

酶降解法是利用酶降解多糖，得到较低分子量多糖的生物降解法，此法也存在许多优点，其酶降解的特异性较强，整个降解工艺也比较环保、反应相对温和、能耗较低、降解效率较高、降解后的产物结构和活性都能得到最大限度的保护，酶催化还具有高效性和专一性。

从西番莲果皮中提取的粗多糖，其分子量相对来说比较大，粘度也比较高，在一定程度上影响了其最大效果的发挥，所以通常会采用降解的方法获得小分子量的多糖。黄永春等通过利用α-淀粉酶对壳聚糖的降解，发现其能够显著降低壳聚糖的分子量。苏畅等研究发现木瓜蛋白酶可以降解壳聚糖。多糖的降解过程中，某些特定的化学键会发生断裂，使得更多的还原末端被暴露出来，进而使其还原糖含量显著增加，多糖的特性粘度逐渐降低，还原能力逐渐提高。赵婷婷通过用化学法降解多糖，降解后多糖的还原能力和清除自由基能力与降解前相比均显著提高，这可能与分子量的降低有关。多糖的生物活性与许多因素有关，如溶解度和分子量大小。降解会增加多糖的亲水基，使多糖的溶解性增加，随之进一步提高多糖的活性水平。

本发明对西番莲果皮多糖进行酶解，比较了粗多糖通过酶降解前后的抗氧化能力的变化。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶解西番莲果皮多糖的制备方法，研究多糖酶解前后的抗氧化活性。

一种利用日本曲霉PJ01产酶降解西番莲果皮多糖的制备方法。具体包括：西番莲果皮多糖的制备和日本曲霉PJ01产酶降解西番莲果皮多糖的制备。先取西番莲果皮制备成西番莲果皮多糖粉末，以日本曲霉PJ01为试验菌株，利用PDA培养基培养获得粗酶液，将粗酶液与多糖混匀，进行酶解得到酶解修饰后的西番莲果皮多糖。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：

(1)取新鲜西番莲果皮洗净，50℃烘干，粉碎。在85℃条件下，按照料液比(1:20g/mL)加入80％的乙醇冷凝回流提取3次，每次2h，过滤，残渣干燥，即得去除色素、酚类等物质的西番莲果皮粉末。

(2)称取1g上述粉末，按照料液比(1:27g/mL)的比例加入蒸馏水，微波提取3min，过滤，3000rpm离心10min，取上清液浓缩。

(3)按1:4的比例加入无水乙醇沉淀48h，4000rpm离心15min，取沉淀冷冻干燥，获得水提西番莲果皮粗多糖(Water extracted polysaccharide from Passiflora edulisSims peel,WPEP)。

(4)以日本曲霉PJ01为实验菌株，接种于PDA斜面上培养；挑取长势较好的单菌落纯化。活化2次，接种斜面保存；以PDA固态发酵培养基，于30℃恒温培养箱中培养3天。

(5)以1:20(w:v)的比例加蒸馏水浸泡固态发酵产酶的发酵底物，在170rpm，40℃的条件下反应2h，制备粗酶液。

(6)精确称取(3)中多糖粉末溶入蒸馏水中，以日本曲霉PJ01所产酶作为水解酶，与西番莲果皮多糖混合进行酶解反应，得到酶解修饰后的西番莲果皮多糖(Enzymesolution degradation polysaccharide from Passiflora edulis peel,EWPEP)。

附图说明

图1实施所述不同降解反应时间对还原糖含量影响。。

图2为实施所述日本曲霉PJ01产酶降解前后多糖及Vc对DPPH自由基的清除作用。

图3为实施所述日本曲霉PJ01产酶降解前后多糖及Vc的还原能力作用。

图4为实施所述日本曲霉PJ01产酶降解前后多糖及Vc对羟基自由基的清除作用。

图5为实施所述日本曲霉PJ01产酶降解前后多糖及Vc对超氧阴离子自由基的清除作用。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

(1)西番莲果皮多糖制备

将西番莲果皮进行醇提，取干燥后的果渣，料液比1:27g/mL，微波提取3min，过滤，3000rpm离心10min，浓缩上清液。按1:4的体积比例加入无水乙醇沉淀48h，4000r/min离心15min，取沉淀冷冻干燥，获得水提西番莲果皮粗多糖。

(2)粗酶液的制备方法

菌种活化：以日本曲霉PJ01为实验菌株，接种于PDA斜面上培养；挑取长势较好的单菌落纯化，活化2次，接种斜面保存。

以PDA固态发酵培养基，于30℃恒温培养箱中培养3天。以1:20(w:v)的比例加蒸馏水浸泡固态发酵产酶的发酵底物，在170rpm，40℃的条件下孵育2h，获得粗酶液。

(3)酶活力的测定

取步骤(2)中粗酶液测定酶活力，日本曲霉PJ01固态发酵产的粗酶液含有果胶酶、纤维素酶以及木聚糖酶，其酶活分别为966U/gds、58U/gds、1004U/gds。

(4)酶解时间的确定

以1:20(w:v)的比例加蒸馏水浸泡固态发酵产酶的发酵底物，在170rpm，40℃的条件下反应2h，获得粗酶液。以1:200(w:v)的比例将WPEP与粗酶液混合，45℃水浴溶解，转至45℃，170rpm条件下继续水解，每隔1h取100.00μL水解液于100℃水浴5min终止反应，测定还原糖含量。结果如图1显示，降解6h后还原糖含量不再发生显著变化，说明6h能完全水解多糖得到酶解液。

(5)日本曲霉PJ01产酶降解西番莲果皮

按1:200(w:v)的比例将西番莲果皮多糖与粗酶液混合，于45℃水浴锅溶解，然后转入振荡培养箱中，在45℃，170rpm条件下水解6h，最后沸水浴5min以终止反应，浓缩，冷冻干燥，得到酶解西番莲果皮多糖。

本实施例制得的酶解修饰西番莲果皮多糖与未修饰多糖应用于抗氧化类保健品和化妆品,具体对比效果如下：

(1)对DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力测定结果如图2所示，在同等浓度下，DPPH自由基清除能力的强弱顺序为：Vc>粗多糖>酶解多糖，酶解修饰有助于西番莲果皮对DPPH自由基清除能力的提高。

(2)对还原能力的测定

以抗坏血酸为阳性对照，还原能力的测定结果如图3。在同等浓度下，还原能力的强弱顺序为Vc>多糖>酶解多糖，同等浓度下，酶解多糖的还原能力总是比粗多糖的还原能力强，酶解修饰有助于西番莲果皮多糖还原能力的提高。

(3)对羟基自由基清除能力的测定

羟基自由基的清除率测定结果如图4，同一浓度下，酶解多糖对羟基自由基的清除率明显高于粗多糖对羟基自由基的清除率，浓度为3.2mg/mL时，酶解多糖和粗多糖的清除率分别为65.47％和29.55％，说明酶解后的粗多糖可以提高对羟基自由基的清除能力。

(4)对超氧阴离子清除能力的测定

超氧阴离子清除能力测定结果如图5所示，在同一浓度下，降解前后的多糖及Vc溶液对超氧阴离子清除能力的强弱顺序为：Vc>酶解多糖>多糖，说明酶解后的粗多糖可以提高对超氧阴离子清除能力。