一种微生物活菌计数方法

摘要

本发明提供一种酵母菌和/或乳酸菌活菌计数方法，该方法不经DNA提取、也不用高温裂解或机械破碎细胞，能直接进行细胞定量PCR来计数活菌。本发明方法能有效缩短检测时间，提高效率，降低成本，且灵敏度高、准确性强。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种微生物活菌计数的方法。

背景技术

传统的平板计数一直是监控及定量微生物的金标准，被用于各种生物样品中检测，然而此方法存在时间成本高，无法监测假阴性(VBNC)状态菌的缺陷，故开发了基于分子手段的检测和定量微生物的方法，例如，用实时荧光定量PCR来检测微生物，达到快速定量的目的。然而，实时荧光定量PCR过程中仍存在一定缺陷，一方面，实时荧光定量PCR过程需要进行步骤繁琐的DNA提取，这不仅延长了实验操作时间，增加了实验成本，同时在DNA提取过程中会损失一部分DNA；另一方面，实时荧光定量PCR方法无法区分样品体系中的死菌和活菌，导致计数结果的偏差，存在应用限制。

果酒酿造过程涉及复杂的生物化学变化，主要包括两个阶段：酒精发酵阶段和苹乳发酵阶段。酒精发酵阶段主要以酿酒酵母将果汁中的糖消耗转化为酒精的过程；苹乳发酵阶段主要以植物乳杆菌和酒球菌将苹果酸转化为乳酸。由于果酒酿造过程涉及多种微生物互相作用，尤其是存在大量的酵母菌(其死菌、活菌的数量对酿造过程影响很大)，所以检测和定量酿酒过程中存在的酵母菌等微生物对果酒酿造的品质以及预防果酒腐败有重大意义。为了获得酵母菌的PCR模板，现阶段除了通过机械破壁等方法进行DNA提取外，还有高温裂解等方法，然而这些方法在对果酒中酵母菌等微生物的检测和定量时，或者存在操作复杂、易带入污染、因DNA提取导致样本损失等问题，或者难于区分死菌和活菌，因此，亟需开发一种高效快速的适于酿酒发酵过程中的酵母菌监测方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种传统食品果酒发酵过程酵母菌或植物乳杆菌活菌数定量检测的方法，实现活菌准确计数。本发明的方法简单有效、结果可靠。

本发明的总体思路和方法大致包括以下步骤：

(1)样本预处理：样本去杂，清洗后得菌体悬液；

(2)叠氮溴化丙锭处理：向菌体悬液中加入叠氮溴化丙锭溶液混匀孵育，离心制备菌悬液；

(3)实时荧光定量PCR检测：以所述菌悬液作为模板，进行实时荧光定量PCR检测(该菌悬液不经DNA提取步骤)；

(4)活菌计数：基于标准曲线计算酵母活菌浓度。

尤其是，步骤(2)中的孵育采用“冰上+避光+摇床”孵育，而不含室温过程，从而保证了结果的准确性。而且，步骤(2)中的菌悬液可选的进行溶壁酶处理。最后，步骤(3)中采用经优化的针对酵母菌或植物乳杆菌的特异性引物扩增。

具体的技术实施方案如下：

本发明首先提供一种微生物活菌计数方法，所述方法包括以下步骤：

(1)样本处理：样本去杂，清洗后得菌体悬液；

(2)叠氮溴化丙锭处理：向菌体悬液中加入叠氮溴化丙锭溶液混匀孵育，离心制备菌悬液；

(3)实时荧光定量PCR检测：以上述菌悬液为模板，进行实时荧光定量PCR检测；优选的，该菌悬液不经DNA提取步骤；

(4)活菌计数：基于标准曲线计算酵母活菌浓度。

在一些实施方式中，所述微生物为酵母菌和/或乳酸菌；

优选的，为酿酒酵母和/或植物乳杆菌；

更优选的，所述样本为果酒类样本，比如蓝莓或葡萄汁。

在一些实施方式中，步骤(1)中的所述清洗为：1mL生理盐水洗一次、1mL含2％(w/v)Polyvidone 25的10％TEN缓冲液洗一次，1mL生理盐水洗一次后300μl生理盐水重悬。

在一些实施方式中，所述步骤(2)中加入叠氮溴化丙锭的终浓度为25-50μM，优选为25μM。

在一些实施方式中，所述步骤(2)中所述处理方法为：冰上避光摇床孵育10-30min，卤素灯曝光5-15min后，离心收集菌体；优选的，先冰上避光，在摇床上以200rpm，孵育20min，然后用465nm卤素灯曝光10min。

当上述微生物为酵母菌尤其是酿酒酵母是，在一些实施方式中，所述步骤(2)进一步包括溶壁酶处理，优选采用溶壁酶处理，最适处理时间为45min，处理浓度为75U/mL。

在一些实施方式中，所述步骤(3)中实时荧光定量PCR所用特异性引物是检测酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的特异性引物：

上游引物S.c-f：5'-ACATATGAAGTATGTTTCTATATAACGGTG-3'(SEQ ID NO.1)；

下游引物S.c-r：5'-TGGTGCTGGTGCGGATCTA-3'(SEQ ID NO.2)；

在一些实施方式中，所述步骤(3)中实时荧光定量PCR所用特异性引物是植物乳杆菌的特异性引物：

上游引物L.p-f：5'-TGATCCTGGCTCAGGACGAA-3'(SEQ ID NO.7)；

下游引物L.p-r：5'-TGCAAGCACCAATCAATACCA-3'(SEQ ID NO.8)；。

在一些实施方式中，所述步骤(3)中的荧光定量PCR检测的反应体系为：

SYBR Mix 12.5μL，

模板10μL，

上下游引物各1μL，

dd H

所述反应程序为：

95℃预变性15min；

40个循环：95℃变性15s，60℃退火20s；

在一些实施方式中，所述步骤(4)中标准曲线建立方法如下：

将10

在一些实施方式中，所述样本为果酒样本；优选的，所述样本为蓝莓汁或葡萄酒果酒样本。

本发明还提供一种基于叠氮溴化丙锭的细胞实时荧光定量PCR在酵母和/或植物乳杆菌活菌计数中的应用，其特征在于，所述用途包括以下步骤：

(1)样本预处理：样本去杂，清洗后得菌体悬液；

(2)叠氮溴化丙锭处理：向菌体悬液中加入叠氮溴化丙锭溶液混匀孵育，离心制备菌悬液，所述叠氮溴化丙锭的终浓度为25-50μM，优选为25μM；

(3)实时荧光定量PCR检测：以所述菌悬液作为模板，直接进行实时荧光定量PCR检测(该菌悬液不进行DNA提取步骤)；

(4)活菌计数：基于标准曲线计算酵母活菌浓度。

在一些实施方式中，所述样本为果酒样本；优选的，所述样本为蓝莓汁或葡萄汁果酒样本。

在一些实施方式中，步骤(1)中的所述清洗为：1mL生理盐水洗一次、1mL含2％(w/v)Polyvidone 25的10％TEN缓冲液洗一次，1mL生理盐水洗一次后300μl生理盐水重悬。

在一些实施方式中，所述步骤(2)中所述处理方法为：冰上避光孵育10-30min，卤素灯曝光5-15min后，离心收集菌体；优选的，先冰上避光，在摇床上以200rpm，孵育20min，然后用465nm卤素灯曝光10min。

在一些实施方式中，所述步骤(3)中实时荧光定量PCR所用特异性引物是检测酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的特异性引物：

上游引物S.c-f如SEQ ID NO.1所示，

下游引物S.c-r如SEQ ID NO.2所示。

在一些实施方式中，所述步骤(3)中实时荧光定量PCR所用特异性引物是植物乳杆菌的特异性引物：

上游引物L.p-f如SEQ ID NO.7所示；

下游引物L.p-r如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供一种果酒酵母或植物乳杆菌活菌计数的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含浓度为25-50μM，优选为25μM的叠氮溴化丙锭，检测引物及其他试剂。

在一些实施方式中，所述检测引物是检测酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的特异性引物：

上游引物S.c-f如SEQ ID NO.1所示；

下游引物S.c-r如SEQ ID NO.2所示。

在一些实施方式中，所述检测引物是植物乳杆菌的特异性引物：

上游引物L.p-f如SEQ ID NO.7所示；

下游引物L.p-r如SEQ ID NO.8所示。

在一些实施方式中，当针对酿酒酵母检测时，所述试剂盒进一步包含75U/mL的溶壁酶。

在一些实施方式中，所述其他试剂包括实时荧光定量PCR检测的常规试剂组分。

本发明具有如下有益技术效果：

(1)本发明能够有效缩短检测时间，提高效率，降低成本；同时克服了不能计数VBNC细菌的不足，提高计数的准确率；

(2)本发明能够准确的检测酵母菌活菌数，避免检测结果死菌干扰，由此提高定量方法的准确性；而且本发明直接以细胞为模板，省去DNA提取过程，避免了DNA在提取过程中的损失，提高了检测的效率和准确性。

(3)本发明提供的酿酒酵母的特异性引物可准确定量复杂微生物体系中的酵母菌，在提高工作效率的同时具有特异性强和灵敏度高的优点。

(4)本发明通过采用独特的孵育方法以及溶壁酶处理步骤，加上对细胞模板浓度等参数条件的优化，最终确立了一套完整的、系统的、适于果酒中酵母活菌计数的方法和体系，准确度高，实用性强；该方法可用于发酵和酿造工业。

附图说明

图1为不同清洗方式的死菌和活菌检测结果图；

图2为不同酵母/植物乳杆菌引物对扩增产物的凝胶电泳结果图，其中图2a为酵母引物对扩增产物凝胶电泳图，图2b为植物乳杆菌引物对扩增产物凝胶电泳图；

图3为不同叠氮溴化丙锭处理浓度的检测结果图，其中图3a为不同叠氮溴化丙锭处理浓度对酵母的检测结果图，其中图3b为不同叠氮溴化丙锭处理浓度对植物乳杆菌的检测结果图；

图4为不同溶壁酶处理条件的检测结果图，其中图4a是溶壁酶最佳处理浓度，图4b是溶壁酶最佳处理时间；

图5为PCR最佳模板加样体积的检测结果图；

图6为酵母菌不同环境下的标准曲线图；

图7为不同浓度死菌对叠氮溴化丙锭工作效率的影响图，其中图7a是酵母菌将不同浓度死菌加入10

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

部分术语定义

除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。

本发明通过附图和如下实施例进一步描述，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用的试剂和原材料均可由市场购得。

实施例1样品处理

根据前期的预实验结果发现，由于酒环境复杂对实时荧光定量PCR扩增和PMA处理有较大的抑制作用，为了降低酒环境对实时荧光定量PCR扩增和PMA处理结果的影响，提高扩增和检测效率，故对样品进行前处理优化。以下以植物乳杆菌为例，酿酒酵母沿用同样的方法。

实验菌株：植物乳杆菌LP39；酿酒酵母(red fruit)；

样品预处理：将样品菌株的菌粉转移至液体MRS培养基，37℃活化24h，然后以每毫升4％接种比例接种到摇瓶37℃培育12h，接到果酒中孵育90min，然后用移液枪吸取1mL样液于1.5mL离心管中。

活菌悬液制备：将准备好的样品，用不同的洗样方法清洗后，重悬备用；

死菌悬液制备：将准备好的样品，重悬后，放入85℃金属浴20min，吸取部分样品涂布平板法鉴定是否灭活，然后剩余样品12000rpm离心30s，弃去上清，加入1mL生理盐水重悬，备用。

取10

最佳洗样(清洗)方法见图1，其中1-5分别是：1：1mL无菌水洗两次；2：1mL生理盐水洗两次后等体积MRS重悬，孵育2h；3：1mL生理盐水洗一次、1mL含2％(w/v)Polyvidone 25的10％TEN缓冲液洗一次，1mL生理盐水洗一次后300ul生理盐水重悬；4：1mL 0.1％蛋白胨缓冲液洗两次后300ul 0.1％蛋白胨缓冲液重悬；5：1mL 0.1％蛋白胨缓冲液一次、1mL10％TEN+Polyvidone 25(PVP)(2％w/v)缓冲液洗一次，1mL0.1％蛋白胨缓冲液一次后300ul0.1％蛋白胨缓冲液重悬。

结果显示洗样方法3和洗样方法5中死菌CT值较高，证明叠氮溴化丙锭能有效的抑制死菌，同时洗样方法3的活菌组与对照组ct值最为接近，证明此方法处理后可准确定量活菌。故最佳洗样方法为1mL生理盐水洗一次、1mL含2％(w/v)Polyvidone 25的10％TEN缓冲液洗一次，1mL生理盐水洗一次后300μl生理盐水重悬。

基于植物乳杆菌样品处理方法的优化，对酿酒酵母沿用其优化后的方法，洗样效果相同。

实施例2引物体系优化

为验证不同引物对实验菌种的扩增效率和特异性，并确定最佳引物序列。故选取三对酵母引物：

(1)上游引物S.c-f：5'-ACATATGAAGTATGTTTCTATATAACGGTG-3'(SEQ ID NO.1)；下游引物S.c-r：5'-TGGTGCTGGTGCGGATCTA-3'(SEQ ID NO.2)；

(2)上游引物S.c-f：5'-GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGC-3'(SEQ ID NO.3)；下游引物S.c-r：5'-TCTCTTTCCAAAGTTCTTTTCATCTTT-3'(SEQ ID NO.4)；

(3)上游引物S.c-f：5'-GCCCAGTGCTCTGAATGTC-3'(SEQ ID NO.5)；下游引物S.c-r：5'-GCTCAACAGGGTCTTCTTTCC-3'(SEQ ID NO.6)；

选取三对植物乳杆菌引物：

(1)上游引物L.p-f：5'-TGATCCTGGCTCAGGACGAA-3'(SEQ ID NO.7)；下游引物L.p-r：5'-TGCAAGCACCAATCAATACCA-3'(SEQ ID NO.8)；

(2)上游引物L.p-f：5'-AGGCGCGGCTGATGTCA-3'(SEQ ID NO.9)；下游引物L.p-r：5'-CGCGATTGTCTTGGTTTTGTT-3'(SEQ ID NO.10)；

(3)上游引物L.p-f：5'-ACGCGAAGAACCTTACCAGG-3'(SEQ ID NO.11)；下游引物L.p-r：5'-CCCAACATCTCACGACACGA-3'(SEQ ID NO.12)；

对酵母进行PCR扩增，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定最佳酵母引物；取上述洗样后的菌悬液6份，每份三平行，其中三份分别用三对酵母引物进行PCR扩增；另外三份用天根生化科技公司的酵母DNA提取试剂盒(DP307)提取DNA后，进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳。

最佳酵母引物见图2a，其中电泳图泳道a-c分别为SEQ ID NO.3-4对酵母细胞、DNA、空白对照的扩增产物凝胶电泳结果；泳道d-f分别为SEQ ID NO.1-2对酵母细胞、DNA、空白对照的扩增产物凝胶电泳结果；泳道g-i分别为SEQ ID NO.5-6对酵母细胞、DNA、空白对照的扩增产物凝胶电泳结果。

结果显示，泳道a-c、g-i的目标bp处均有明显条带，即SEQ ID NO.3-4、SEQ IDNO.5-6两对引物均可扩增样品酵母，说明两对引物有较好的扩增效率，但同时也能扩增出杂菌，说明两对引物的特异性较差；泳道d-e的目标bp处均有明显条带，即SEQ ID NO.1-2引物均可扩增样品酵母，且有较好的扩增效率，同时泳道f没有条带出现，说明引物不扩增杂菌，对样品酵母有较好的特异性；故三对引物中SEQ ID NO.1-2对样品酵母有较高的扩增效率和最好的特异性，故最佳引物是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

最佳植物乳杆菌引物见图2b，其中电泳图泳道a-c分别为SEQ ID NO.11-12对植物乳杆菌细胞、DNA、空白对照的扩增产物凝胶电泳结果；泳道d-f分别为SEQ ID NO.9-10对植物乳杆菌细胞、DNA、空白对照的扩增产物凝胶电泳结果；泳道g-i分别为SEQ ID NO.7-8对植物乳杆菌细胞、DNA、空白对照的扩增产物凝胶电泳结果。

结果显示，泳道a-c的目标bp处有明显条带，即SEQ ID NO.11-12引物均可扩增样品植物乳杆菌，说明引物有较好的扩增效率，但同时也能扩增出杂菌，说明引物的特异性较差；泳道d-e的目标bp处均有条带但条带不明显，较为模糊，即SEQ ID NO.9-10引物均可扩增样品植物乳杆菌，但扩增效率相对较差，同时泳道f没有条带出现，说明引物不扩增杂菌，对样品植物乳杆菌有较好的特异性；泳道g-h的目标bp处均有明显条带，即SEQ ID NO.7-8引物均可扩增样品植物乳杆菌，且有较好的扩增效率，同时泳道i没有条带出现，说明引物不扩增杂菌，对样品植物乳杆菌有较好的特异性；故三对引物中SEQ ID NO.7-8对样品植物乳杆菌有较高的扩增效率和最好的特异性，故最佳引物为上游引物是SEQ ID NO.7和SEQID NO.8。

实施例3叠氮溴化丙锭处理

叠氮溴化丙锭母液的制备：取1mg叠氮溴化丙锭溶解于100μL 20％DMSO中制得20mM叠氮溴化丙锭储备液，于-20℃冻存。

制备活细胞悬液样品和死细胞悬液样品各5份，每份三平行，分别加入适量的叠氮溴化丙锭母液，使菌液叠氮溴化丙锭的终浓度分别为0μM，5μM，10μM，25μM，50μM，与菌液充分混匀后以200rpm速度恒定搅拌菌液，冰上避光反应20min(1.防止样品悬液中活细胞在室温下继续增殖；2.防止因温度升高影响PMA的活性和处理效率)。之后将样品开盖放置于波长为464nm LED光源下7cm处曝光10min；光反应后，12000rpm离心30s收集菌体，无菌水冲洗两次后1mL体积重悬。所得样品用于实时荧光定量PCR扩增，确定叠氮溴化丙锭最适处理浓度。

酵母菌叠氮溴化丙锭最适处理浓度见图3a，结果显示实验组浓度均能在一定程度上抑制死菌DNA的扩增，且对活菌DNA扩增均无明显抑制作用，当叠氮溴化丙锭浓度大于等于25μM时，死菌抑制效果达到最大，同时CT值显示活菌定量结果未受影响，故叠氮溴化丙锭最适处理浓度范围为25-50μM，最理想浓度为25μM。

植物乳杆菌叠氮溴化丙锭最适处理浓度见图3b，结果显示实验组浓度均能在一定程度上抑制死菌DNA的扩增，且对活菌DNA扩增均无明显抑制作用，当叠氮溴化丙锭浓度在25μM-50μM时，死菌抑制效果达到最大，同时CT值显示活菌定量结果未受影响，当叠氮溴化丙锭浓度在50μM时，CT值显示活菌定量结果受到较大影响，故叠氮溴化丙锭最适处理浓度范围为25-50μM，最理想浓度为25μM。

实施例4酵母菌破壁方法

由于酵母菌是真菌，有较厚的细胞壁，若未进行有效裂解，对实时荧光定量PCR结果有较大的影响，导致ct值偏大，无法得到准确定量结果。故在进行PCR之前，用溶壁酶对待测模板细胞进行破壁处理，确定最适处理浓度和最适处理时间；取上述叠氮溴化丙锭处理后菌悬液，分别加入0U、50U、75U、100U的溶壁酶，处理时间分别为0min、30min、45min、60min；以提取DNA模板为对照，然后以4000rpm，10min收集菌体，并用无菌水清洗两次，得到菌悬液，以细胞为模板，进行实时荧光定量PCR实验；

溶壁酶最适处理时间和浓度见图4，结果显示，在相同浓度的溶壁酶作用下随着处理时间的增加，酵母的ct值均有明显的下降，且在处理45min之后，加长处理时间，ct值无明显变化；同时在相同处理时间下，随着溶壁酶溶度的升高，酵母的ct值均有明显减小，且在浓度为75U/mL时ct值最小；故溶壁酶最适处理时间为45min，最适处理浓度为75U/mL。

实施例5不同体积细胞模板对实时荧光定量PCR扩增效率影响

取实施例1中处于对数期10

最佳模板体积见图5，结果显示2μl模板加样可在菌浓度10

实施例6不同环境中标准曲线的建立

取不同环境下(培养基、蓝莓汁、葡萄汁)的菌液各10

标准曲线见图6，结果显示取每mL不同浓度菌液进行叠氮溴化丙锭-细胞实时荧光定量PCR和不经叠氮溴化丙锭处理的细胞实时荧光定量PCR扩增，细胞浓度检测限均为10

表1培养基环境下酵母的标准曲线

表2蓝莓汁环境下酵母的标准曲线

表3葡萄汁环境下酵母的标准曲线

实施例7不同浓度死菌对叠氮溴化丙锭工作效率影响

为进一步证明本发明体系的有效性，本实施例分析不同浓度死菌对于叠氮溴化丙锭工作效率的影响，同时验证该方法的灵敏度。

上述实验得出本方法针对酿酒酵母检测限为10

不同死菌浓度对叠氮溴化丙锭效率影响见图7a、7b，结果显示，在10

同样的，植物乳杆菌的检测限为10

不同死菌浓度对叠氮溴化丙锭效率影响见图7c、7d，结果显示，在10

实施例8葡萄果酒汁发酵过程中的实际应用

为了验证该方法的实用性，在葡萄酒发酵过程中，每两天取样检测菌量。以还原糖含量降至4g/L以下视为酒精发酵结束，，以苹果酸含量降至0.2g/L以下视为苹乳发酵结束乳酸菌，植物乳杆菌在发酵12天接入葡萄酒中，本次发酵20天后还原糖含量降为2.79±0.7g/L，苹果酸含量降为0.18±0.06g/L。

分别取葡萄汁发酵含酵母菌和植物乳杆菌的样品于1.5mL离心管中，1mL生理盐水洗一次、1mL 10％TEN+Polyvidone 25(PVP)(2％w/v)缓冲液洗一次，1mL生理盐水洗一次后300μl生理盐水重悬，备用，整个过程均为无菌操作，所有样品三组生物平行。

将制备好的菌悬液加入适量的叠氮溴化丙锭工作液，使体系中叠氮溴化丙锭的终浓度为25μM，与菌液充分混匀后以200rpm速度恒定搅拌菌液，冰上避光反应20min。之后将样品开盖放置于波长为464nm LED光源下7cm处曝光10min；光反应后，12000rpm离心30s收集菌体，无菌水冲洗两次后1mL体积重悬，备用；

取上述叠氮溴化丙锭处理后酵母菌菌悬液，分别加入75U的溶壁酶，处理45min；然后以4000rpm，10min收集菌体，并用无菌水清洗两次，得到菌悬液；

(4)以细胞为模板，酿酒酵母以上游引物S.c-f：5'-ACATATGAAGTATGTTTCTATATAACGGTG-3'(SEQ ID NO.1)，下游引物S.c-r：5'-TGGTGCTGGTGCGGATCTA-3'(SEQ ID NO.2)进行荧光定量PCR扩增反应，植物乳杆菌以上游引物L.p-f：5'-TGATCCTGGCTCAGGACGAA-3'(SEQ ID NO.7)；下游引物L.p-r：5'-TGCAAGCACCAATCAATACCA-3'(SEQ ID NO.8)进行荧光定量PCR扩增反应，输出相应的循环阈值；将所述循环阈值与菌种标准曲线(实施例5表1-3所示)进行对照，得到酵母和植物乳杆菌的活菌和总菌量，计数结果见表4-5。

表4葡萄汁中酵母菌的计数结果

表5葡萄酒中植物乳杆菌的计数结果

结果表明，通过本发明方法计数获得的细胞浓度与传统平板法结果更为接近，证明本发明方法在果酒微生物活菌计数方面具有很高的可信度和准确性，适于推广应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，本发明只列举了酿酒酵母和植物乳杆菌的应用实例，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，进行改进和润饰的技术也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 一种微生物活菌计数方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acatatgaag tatgtttcta tataacggtg 30

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggtgctggt gcggatcta 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagtcgagtt gtttgggaat gc 22

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctctttcca aagttctttt catcttt 27

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcccagtgct ctgaatgtc 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctcaacagg gtcttctttc c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgatcctggc tcaggacgaa 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgcaagcacc aatcaatacc a 21

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggcgcggct gatgtca 17

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgcgattgtc ttggttttgt t 21

<210> 11

<211> 20

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<210> 12

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