一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组、试剂盒及方法

摘要

本发明提供了一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组、试剂盒以及方法，属于细胞工程领域，所述引物组包括RCL‑1引物组或RCL‑2引物组；所述RCL‑1引物组包括引物FP‑1、引物RP‑1和荧光探针P1；所述RCL‑2引物组包括引物FP‑2、引物RP‑2和荧光探针P2。利用本发明提供的引物组、试剂盒以及方法来检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒，扩增效率高、标准曲线的相关系数高；检测方法具有快速、简单、易操作的特点。

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程领域，尤其涉及一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组、试剂盒以及方法。

背景技术

随着分子生物学的不断发展，人为构建的基因修饰的细胞越来越多的应用到疾病治疗相关领域。生物病毒作为一种基因转移载体已被广泛地利用和研究；到目前为止，反转录病毒、慢病毒、腺/疱疹病毒和腺相关病毒已作为载体参与基因转移。

慢病毒属于逆转录病毒，最为人熟知的慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)，目前来源于慢病毒的复制缺陷病毒载体已成功用于介导目的基因在靶向细胞的转移和表达。现有的基因治疗产品所用慢病毒载体均是非复制型的，但在病毒包装过程中，可能会由于同源或非同源重组等机制产生复制型慢病毒(RCL)。出于安全、有效、质量可控的考虑，研究人员应当对该类病毒进行有效检测，以避免在细胞移植治疗后，其中的复制型病毒在人体内无法控制的自我复制，对人体造成伤害，防止临床安全性隐患事件。

目前对于复制型病毒的检测多采用共培养法，该方法操作复杂，培养周期长。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞(如DC细胞、CAR-T、NK和PBMCs等)中复制型病毒的引物组、试剂盒以及方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组，包括RCL-1引物组或RCL-2引物组；所述RCL-1引物组包括引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1；所述RCL-2引物组包括引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2；所述引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示，所述引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4～SEQ ID No.6所示。

本发明提供了一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞(如DC细胞、CAR-T、NK和PBMCs等)中复制型病毒的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂。

优选的，所述引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1的使用浓度独立为8～12μmol/L；所述引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2的使用浓度独立为8～12μmol/L。

优选的，所述检测试剂包括qPCR扩增MIX、阳性标准品和阴性质控品。

优选的，所述阳性标准品为复制型的vsvg质粒。

本发明提供了一种检测慢病毒介导基因修饰的细胞中复制型病毒的方法，包括以下步骤：

1)提取待检测细胞的总RNA后反转录获得反转录产物；

2)以步骤1)中获得的反转录产物为模板，以所述的RCL-1引物组或RCL-2引物组为引物进行qPCR扩增获得待检测细胞qPCR扩增的Ct值；

3)当Ct值≥33.92时，所述待检测细胞中不存在复制型病毒，当Ct值＜33.92时，所述待检测细胞中存在复制型病毒。

优选的，步骤2)中所述qPCR扩增的扩增体系，以20μL计，包括RNA模板4μL、引物FP-10.4μL、引物RP-10.4μL、荧光探针P10.4μL、qPCR扩增MIX 10μL和ddH

或者包括RNA模板4μL、引物FP-20.4μL、引物RP-20.4μL、荧光探针P20.4μL、qPCR扩增MIX 10μL和ddH

优选的，步骤2)中所述qPCR扩增的扩增程序包括以下步骤：95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

优选的，步骤1)中所述待检测细胞设置2～4个重复。

优选的，当采用RCL-2引物组为引物进行qPCR扩增时，将所述反转录产物线性化后作为模板。

本发明的有益效果：利用本发明提供的引物组、试剂盒以及方法来检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒，扩增效率高、标准曲线的相关系数高；检测方法具有快速、简单、易操作的特点。

附图说明

图1为线性质粒和环状质粒凝胶电泳示意图；

图2为用RCL-1引物组对VSVG环状质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线；

图3为用RCL-2引物组对VSVG环状质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线；

图4为用RCL-1引物组对VSVG线性质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线；

图5为用RCL-2引物组对VSVG线性质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞(如DC细胞、CAR-T、NK和PBMCs等)中复制型病毒的引物组，包括RCL-1引物组或RCL-2引物组；所述RCL-1引物组包括引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1；所述RCL-2引物组包括引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2；所述引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示，所述引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4～SEQ IDNo.6所示；在本发明中，所述荧光探针P1和荧光探针P2优选的分别在5’端修饰荧光基团6-FAM，3’端修饰荧光基团BHQ1；本发明涉及的引物和荧光探针的具体序列如表1所示。本发明对所述引物的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的人工合成方法即可。

表1引物、荧光探针序列

本发明还提供了一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞(如DC细胞、CAR-T、NK和PBMCs等)中复制型病毒的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂。在本发明中，所述引物FP-1、引物RP-1和荧光探针P1的使用浓度优选的独立为8～12μmol/L，更优选为10μmol/L；所述引物FP-2、引物RP-2和荧光探针P2的使用浓度优选的独立为8～12μmol/L，更优选为10μmol/L。在本发明中，所述检测试剂优选的包括qPCR扩增MIX、阳性标准品和阴性质控品。在本发明中，所述qPCR扩增MIX优选为

本发明还提供了一种检测慢病毒介导基因修饰的细胞中复制型病毒的方法，包括以下步骤：1)提取待检测细胞的总RNA后反转录获得反转录产物；2)以步骤1)中获得的反转录产物为模板，以所述的RCL-1引物组或RCL-2引物组为引物进行qPCR扩增获得待检测细胞qPCR扩增的Ct值；3)当Ct值≥33.92时，所述待检测细胞中不存在复制型病毒，当Ct值＜33.92时，所述待检测细胞中存在复制型病毒。

在本发明中，提取待检测细胞的总RNA后反转录获得反转录产物。在本发明中，所述待检测细胞为慢病毒介导的基因修饰细胞；本发明对所述待检测细胞的种类(如DC细胞、CAR-T、NK和PBMCs等)没有特殊限定，任何经过慢病毒介导的基因修饰细胞均可。在本发明中，所述提取待检测细胞的总RNA优选的采用RNA提取试剂盒进行，在本发明具体实施过程中，优选的采用动物组织/细胞总RNA提取试剂盒#ZP404进行，具体操作参见试剂盒说明书记载。

本发明在提取获得所述待检测细胞的总RNA后进行反转录获得反转录产物；在本发明中，所述反转录优选的采用5XAll-In-One RT Master Mix(with AccuRT Genomic DNARemoval Kit)(abm，#G492)进行，具体操作参见试剂盒说明书记载。

本发明在获得所述反转录产物后，以获得的反转录产物为模板，以所述的RCL-1引物组或RCL-2引物组为引物进行qPCR扩增获得待检测细胞qPCR扩增的Ct值。在本发明中，所述qPCR扩增的扩增体系，以20μL计，优选的包括RNA模板4μL、引物FP-10.4μL、引物RP-10.4μL、荧光探针P10.4μL、qPCR扩增MIX 10μL和ddH

在本发明中，以不同浓度所述的阳性标准品复制型的vsvg质粒为模板进行qPCR扩增制备标准曲线。在本发明中，将所述阳性标准品复制型的vsvg质粒以10倍梯度稀释至10

本发明根据qPCR扩增获得的Ct值确定所述待检测细胞中是否存在复制性病毒，当Ct值≥33.92时，所述待检测细胞中不存在复制型病毒，当Ct值＜33.92时，所述待检测细胞中存在复制型病毒。当所述待检测细胞中存在复制性病毒时，根据标准曲线计算获得qPCR扩增体系中的复制型病毒的拷贝数，用所得复制型病毒的拷贝数(copies/μL)/逆转录初始体积(μL)×RNA原液浓度(ng/μL)，得到待检测细胞原液中复制性病毒的拷贝数(copies/ng)。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

反应体系确定

1.1引物设计，序列如表1所示，引物/探针合成：委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2模板量的确认：模板体积为2～5μL，在无干扰物情况下不超过总体系的20％为宜，检测限不会改变，考虑加样误差所以加样体积为4μL。

1.3引物探针比的确定：

采用英潍捷基(A30866)mix对不同引物探针比进行试验：等浓度下，分别采用引物探针体积比为1:1和1:2和2:1，以环状VSVG质粒为模板，模板浓度为10

反应体系优选的如表2所示。

表2不同探针引物比qPCR的扩增体系

表3不同探针引物比qPCR的扩增程序

qPCR扩增的实验结果如表4所示。

表4以RCL-1和RCL-2为引物组不同引物探针比的qPCR扩增结果

由此可见，当引物和探针体积比为1:1时，扩增效率最高，R

表5优化后的qPCR扩增体系

实施例2

标准曲线的制作

环状质粒

提前将DNA纯化磁珠，放置室温(18～28℃)平衡30min。准备一个新1.5mL离心管并标记样品名称。

取2μg VSVG质粒(pCMV-VSV-G，addgene，#8454)补水至100μL于标记好编号的1.5mL离心管中，再加入180μL(1.8×样品体积)磁珠，上下吹吐10次混匀，室温(18℃～28℃)孵育5min。

室温孵育结束，把反应管放到磁力架上，2min后或直到观察溶液澄清后，将上清液吸掉。

加200μL新鲜配制的70％乙醇至1.5mL离心管中，在磁力架上向一个方向(顺时针或逆时针，不要把离心管从磁力架上拿出来)转动离心管清洗珠子，然后弃掉上清。

重复上步操作一次(共用70％乙醇清洗两次)。

70％乙醇清洗结束，短暂离心后放回磁力架上并用10μL枪吸掉残余的液体，室温(18～28℃)干燥5min。

注意：室温干燥时观察磁珠干湿程度，避免磁珠过度干燥，磁珠干燥后表面无水渍即可，如磁珠有裂纹出现需立即进行下步实验操作。

干燥结束加100μL TB(RK153-02)，上下吹打10次混匀，重新放回磁力架上2min，等溶液澄清后，转移上清到一个新1.5mL离心管备用。

Qubit定量检测浓度为500ng/μL。

倍比稀释10

用RCL-1引物组对VSVG环状质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线图2所示。

用RCL-2引物组对VSVG环状质粒进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线如图3所示。

线性质粒

质粒酶切线性化

采用(Thermo Scientific FastDigest EcoRI；#FD0274)和(FastAP

表6单酶切和去磷酸化体系

37℃水浴15min，80℃水浴5min灭活，4℃保存。

电泳跑胶

配置0.7％琼脂糖(Invitrogen Agarase-Molecular Biology Grade；#75510-019)，按体积配比加入染料(GelRed Nucleic Acid Stain；#41003)，15K Marker(Trans15KDNA Marker；#N10415)点样50μL，150v电泳30min后查看电泳图像。结果如图1所示，环状质粒的泳道出现一条条带，线性质粒的泳道出现两条条带，切胶回收1663bp条带。

胶回收(Genejet Gel ExtractionKit；K0691)

加入100μL Binding Buffer，60℃水浴10min，将液体转移到GeneJET纯化柱内，12000rpm离心1min，加入700μL洗液，12000rpm离心1min，换新管14000rpm离心1min后转移至新1.5mL EP管，加100μL TB洗脱液，12000rpm离心1min取出液体备用。

浓度测定(Qubit

将

倍比稀释

将测定的浓度按下面公式换算成拷贝数，原液以10倍梯度稀释至10

用RCL-1引物组对VSVG线性质粒片段进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线如图4所示。

用RCL-2引物组对VSVG线性质粒片段进行扩增获得的扩增曲线和标准曲线如图5所示。

按照实施例1中的引物组、扩增体系和扩增程序进行扩增，实验结果如表7所示：环状质粒在引物RCL-1下得到的扩增效率及R

表7 RCL-1和RCL-2两种引物组对环状和线性质粒的扩增效率和R

除了将退火温度分别设定为57℃，60℃和63℃，其余条件按照实施例1中的引物组、扩增体系和扩增程序进行扩增，扩增效率和R

表8不同退火温度下RCL-1和RCL-2两种引物组对环状和线性质粒的扩增效率和R

可见，以环状质粒和线性质粒为模板时，在60℃时扩增效率及R

表9标准曲线制备数据

实施例3

检测方法的建立

RNA提取(动物组织/细胞总RNA提取试剂盒#ZP404)

1.1匀浆处理

通过离心来沉淀经过修饰培养的DC细胞(见专利ZL201911397010.2)。在细胞裂解液R试剂中用移液枪反复吹打来裂解细胞。每5～10×10

1.2将匀浆样品剧烈震荡混匀(涡旋亦可)，在15～30℃条件下孵育5min以使核蛋白体完全分解。

1.3每1mL细胞裂解液R加0.2mL氯仿，盖紧样品管盖，剧烈振荡(涡旋亦可)15s并将其在室温下孵育3min。

1.4于4℃12000rpm离心10min，样品会分成三层：下层有机相、中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加细胞裂解液R体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。

建议：①分层后细胞裂解液对RNA的保护作用减弱，因此操作上快些低温更好。②由正中插入液面下缓慢吸取460μL上相，避免扰动带RNase的中间层。一般吸取大约400μL上相即可，不必要尽可能多的吸取含RNA的水相。

1.5加入0.5倍体积无水乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱中，吸附柱套在收集管内。

1.6 12000rpm离心45s，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。

1.7加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12000rpm离心45s，弃掉废液。

1.8加入500μL漂洗液RW，12000rpm离心45s，弃掉废液。

1.9将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

1.10取出吸附柱，放入一个RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加60μL RNase-free water，室温放置2min，12000rpm离心1min。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积最好不少于30μL，体积过小降低RNA洗脱效率，减少RNA产量。

2 RNA定量(样本制备区)(Qubit

2.1开机

将

2.2校正

取1μL Qubit

2.3样品定量

取一个0.5mL EP管，加入198μL Qubit

3反转录(5X All-In-One RT MasterMix(with AccuRT Genomic DNA RemovalKit)(abm，#G492)

取500ngRNA，加入2μL AccuRT Reaction Mix(4X)，加入适当Nuclease-free H

4实时荧光定量检测

4.1实验前准备

4.1.1准备实验所用的耗材和试剂，用75％的乙醇擦拭工作台面。

4.1.2将所需组分按试验先后顺序冰上融化，涡旋混匀并短暂离心，放置于冰上。

4.1.3核对并记录相应的样本ID，核对无误后混匀短暂离心置于离心管架上备用。

4.1.4试验使用所有枪头为带滤芯枪头，防止污染。

4.1.5全程使用Rainin移液器，快吸慢打，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。

4.2 Standard阳性标准品的配置(独立通风橱)

4.2.1Standard(RCL)配置

4.2.1.1质粒酶切线性化

pCMV-VSV-Gg质粒，大小6507bp(addgene，#8454)；采用(Thermo ScientificFastDigest EcoRI；#FD0274)和(FastAP

4.2.1.2电泳跑胶

配置0.7％琼脂糖(Invitrogen Agarase-Molecular Biology Grade；#75510-019)，按体积配比加入染料(GelRed Nucleic Acid Stain；#41003)，从左到右顺序依次是Marker-酶切前质粒-酶切后，15K Marker(Trans15K DNA Marker；#N10415)点样40μL，酶切前质粒1μL+3μL 6X loading buffer(TransGen Biotech；#J10128)，酶切后直接将50μL样本点入胶内，150v电泳30min后查看电泳图像。

4.2.1.3胶回收(Genejet Gel Extraction Kit；K0691)

加入100μL Binding Buffer，60℃水浴10min，将液体转移到GeneJET纯化柱内，12000rpm离心1min，加入700μL洗液，12000rpm离心1min，换新管14000rpm离心1min后转移至新1.5mL EP管，加100μL TB洗脱液，12000rpm离心1min取出液体备用。

4.2.1.4定量Standard(RCL)，按公式计算出Standard(RCL)原液拷贝数，质粒拷贝(copies/μL)＝6.02×10

4.3试剂准备(试剂准备区)

4.3.1每次PCR实验根据待检测样本数、Standard(RCL)、阴性质控品(ddH

4.3.2首先按上表配置Mix混合液(无核酸酶超纯水+PCR酶混合液+引物FP-1/FP-2+引物RP-1/RP-2+荧光探针P1/P2)，不同引物组分别配制。按10份检测，需配置10×3个复孔+1个阴性质控品，共31个反应孔按9％损耗率配置33个反应配置，无核酸酶超纯水(4.8×33)，PCR酶混合液(10×33)，引物FP-1/FP-2(0.4×33)，引物RP-1/RP-2(0.4×33)，荧光探针P1/P2(0.4×33)于1.5mL EP管中标记Mix充分混匀后短暂离心；再单独按表5配置2个Standard(RCL)反应体系，无核酸酶超纯水(4.8×3)，PCR酶混合液(10×3)，引物FP-1/FP-2(0.4×3)，引物RP-1/RP-2(0.4×3)，荧光探针P1/P2(0.4×3)于1.5mL EP管中标记Mix充分混匀后短暂离心备用。

4.3.3将上述配置好的混合液充分混匀后短暂离心后按每孔16μL分装到96孔上样板孔中，建议更换枪头，增加复孔准确性。

4.4加样(样本制备区)

向每个待检样本对应的2个复孔分别加入4μL模板，阴性质控直接加入到管底，勿吹吸。

4.5封膜

使用

上机，程序结束后进行分析。

4.6数据分析

扩增效率

目的基因RCL：(N6:10

目的基因：RCL(线性)

扩增效率：99％

R

5判断标准

待检测细胞中是否存在复制型病毒的判断标准如表10所示。

表10待检测细胞中是否存在复制型病毒的判断标准

将三种类型样本：经过慢病毒修饰的DC-0330B、未经慢病毒修饰的PBMC和293T，分别取10个不同批次提取检测，结果如下表所示，CT为35或未检出。

表11阴性样本检测结果

分别取10copies/μl、8copies/μl、6copies/μl、5copies/μl、4copies/μl和3copies/μl浓度的质粒，各重复12次，然后统计cutoff值和LOD值，检测结果见表12，统计得出cutoff值为35，95％阳性检出，LOD为8copies/μl。

表12不同拷贝数质粒对应Ct值统计

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司

焦顺昌

<120> 一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组、试剂盒及方法

<141> 2021-02-18

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggacgttgag aggatcttgg at 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

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<210> 2

<211> 26

<212> DNA

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<210> 4

<211> 23

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<212> DNA

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