肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型环介导等温扩增检测方法的建立和应用

摘要

手足口病是儿童中常见的肠道病毒感染性疾病,肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)是其主要病原。手足口病的传染主要通过粪-口和口-口途径,其中接触感染者粪便污染的水、食物及土壤可以导致粪-口传播。水是生命之源,由于干净安全饮用水的缺乏,世界上每年都有大量人群发生疾病和死亡。近年来,EV71的流行在亚太地区呈上升趋势,甚至引起严重中枢感染或死亡,引起人们的密切关注。传统的检测手足口病病原的方法通常需要5-7d才能完成,而且操作繁琐、灵敏度较低,不能满足临床上快速、灵敏的检测需要。因此,建立粪便及饮用水源水中手足口病病原快速、灵敏的检验方法,对疾病的预防和辅助检测、评估水源卫生质量和环境卫生状况具有重要的实用价值和现实意义。
　　 目的:建立并优化EV71和CoxA16的LAMP检测体系,应用于手足口病的病原检测。建立EV71和CoxA16的实时RT-LAMP检测方法并定量检测天津市饮用水源水样品。
　　 方法:
　　 1、本研究基于EV71和CoxA16病毒基因组VP1区利用软件设计出LAMP反应的外引物和内引物。并对反应温度、镁离子浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度等扩增条件进行优化。LAMP反应的总反应体系为25μL,EV71和CoxA16反应混合物分别在62℃和63℃孵育60min,然后在80℃加热10min终止反应。LAMP反应结束后通过以下几种方法判断扩增是否发生:一是肉眼观察反应管的混浊度或向反应管中加入SYBR Green I型染料后观察反应管颜色的变化,二是通过琼脂糖凝胶电泳检测,此外也可通过酶切鉴定LAMP扩增产物。对6株肠道病毒分别进行了LAMP反应来验证引物的特异性,构建EV71和CoxA16标准质粒模板,梯度稀释后验证LAMP反应的灵敏性。
　　 2、采集60例天津地区手足口病流行期间手足口病患儿的粪便标本,分别用EV71和CoxA16的特异性引物对分离到的病毒RNA进行LAMP及PCR检测。
　　 3、本研究于2010年1月至2010年11月,采集18个天津市饮用水源水样品。用超滤离心管浓缩500 mL水样,提取总RNA。实时RT-LAMP分别检测饮用水源水中的EV71和CoxA16。
　　 结果:
　　 1、该方法对EV71和CoxA16的检测有高度的特异性,与甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇B3、柯萨奇B5、埃可30及柯萨奇A16/肠道病毒71型等病毒均无交叉反应。LAMP检测CoxA16的灵敏性比传统的PCR检测方法高100倍,检测EV71的灵敏性比传统的.PCR检测方法高10倍。
　　 2、LAMP检测EV71的检出率(31/60=51.7％)高于PCR(27/60=45％),LAMP检测CoxA16的检出率与PCR相当(27/60=45％)。说明这次手足口病流行的主要病原是EV71,同时存在CoxA16的散发。通过两种方法的比较,可知LAMP比PCR更快速、灵敏,有着更为广泛的发展前景。
　　 3、超滤离心管浓缩病毒的回收率为34.83％。浊度仪实时RT-LAMP结果显示,天津市饮用水源水中的EV71/CoxA16病毒浓度大约分别为0至1.9×106 copies·L-1和0至5.4×105copies·L-1。
　　 结论: 本研究建立的LAMP检测EV71/CoxA16的方法具有特异性好、敏感性高、节省时间的特点,并成功地应用于粪便及饮用水源水中EV71/CoxA16的检测。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 EV71/CoxA16病毒LAMP检测方法的建立及粪便样品检测

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 饮用水源水中EV71/CoxA16的LAMP定量检测

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型检测方法研究进展

致谢

个人简历