使用LC-MS/MS对蛋白质生物标志物进行定量

摘要

本公开提供了用于确定生物样品中的蛋白质生物标志物的丰度和/或浓度的方法和组合物。

说明书

本申请要求于2018年8月8日提交的美国临时申请第62/715,973号的优先权和权益，所述美国临时申请的内容以全文引用的方式并入本文中。

本申请含有已经以ASCII格式经由EFS-Web提交并且特此以全文引用的方式并入本文中的序列表。创建于2019年7月29日的所述ASCII副本命名为“REGE-015-001WO_SeqList_ST25.txt”，并且大小为50,295字节。

背景技术

C1q是涉及先天免疫系统的补体系统的重要的成药蛋白。当前存在用于确定源自人的生物样品中的C1q的浓度的基于免疫的方法。然而，用于测定源自非人灵长类动物(临床前研究和试验中的重要模型生物体)的样品中的C1q的丰度的免疫试剂有限。因此，本领域中需要涉及确定源自人、非人灵长类动物和其它模型生物体的样品中的C1q浓度的方法和组合物，所述方法和组合物是快速、特异性且准确的，并且不需要昂贵且费时的免疫试剂开发。本公开解决了这些需求。

发明内容

本公开提供一种测定，其包括：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段；以及(2)执行所选反应监测质谱(SRM-MS)以测量所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q的浓度。

前述测定可以进一步包括：在步骤(1)与步骤(2)之间，向所述生物样品添加包括与所述至少一个C1q肽片段的氨基酸序列相同的氨基酸序列的至少一个标记的合成C1q肽片段。

前述测定中的测量所述至少一个C1q肽片段的所述丰度可以包括将与通过SRM-MS产生的至少一种C1q肽相对应的信号与标准曲线进行比较。

本公开提供一种测定，其包括：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段；(2)执行所选反应监测质谱(SRM-MS)以产生与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号；以及(3)通过将所述信号与标准曲线进行比较来确定所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少一个C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q浓度。

前述测定可以进一步包括：在步骤(1)与步骤(2)之间，向所述生物样品添加包括与所述至少一个C1q肽片段的氨基酸序列相同的氨基酸序列的至少一个标记的合成肽片段；以及在步骤(2)与步骤(3)之间，执行SRM-MS以产生与所述至少一种标记的合成肽相对应的信号。

所述生物样品可以是血液样品。所述生物样品可以是人样品。所述生物样品可以是非人灵长类动物样品。

所述至少一个肽片段可以包括至少5个氨基酸。所述至少一个肽片段可以包括选自表2的肽。

所述至少一个肽片段可以包括SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)或QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)。所述至少一个肽片段可以包括SLGFCDTTNK(SEQ IDNO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)或QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)中的至少两个。所述至少一个肽片段可以包括SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)和QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)中的每一个。

所述所选反应监测质谱可以为LC-SRM-MS/MS。

所述至少一种蛋白水解酶可以是胰蛋白酶。

标准曲线可以使用包括以下的方法产生：(a)通过混合已知数量的经过纯化的C1q蛋白和C1q消耗的血清制备至少两种C1q浓度标准品；(b)向所述至少两种C1q浓度标准品添加至少一个标记的合成肽片段，其氨基酸序列与预期在使所述C1q浓度标准品与蛋白水解酶接触后产生的至少一个C1q肽片段相同；(c)使所述至少两种标记的C1q浓度标准品与蛋白水解酶接触以产生至少一个C1q肽片段；(d)执行所选反应监测质谱，以确定与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号的强度和与所述至少两种标记的C1q浓度标准品中的每一者中的所述至少一个标记的合成肽片段相对应的信号的强度；以及(e)使用所述信号和所述已知数量的C1q蛋白确定标准曲线。

本公开提供了一种组合物，其包括至少一种分离的合成肽，所述组合物包括具有选自蛋白C1q的氨基酸序列的至少一种分离的合成肽。

一种组合物，其包括至少一种分离的合成肽，所述组合物包括具有选自蛋白C1q的氨基酸序列的至少一种分离的合成肽，其中选自所述蛋白C1q的所述氨基酸序列是通过使C1q与至少一种蛋白水解酶接触而产生的C1q肽片段的序列。

所述C1q蛋白可以来自人。所述C1q蛋白可以来自非人灵长类动物。

所述至少一种分离的合成肽可以包括至少5个氨基酸。

选自所述蛋白C1q的氨基酸序列可以是通过使C1q与至少一种蛋白水解酶接触而产生的C1q肽片段的序列。所述至少一种蛋白水解酶可以是胰蛋白酶。

所述至少一种分离的合成肽可以被标记。

所述至少一种分离的合成肽可以包括选自表2的肽。

所述至少一种分离的合成肽可以包括SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)、IAFSATR(SEQID NO:29)或QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)。所述合成肽SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)中的半胱氨酸可以被修饰。所述修饰可以是脲基甲基化。

本公开提供了一种组合物，其包括至少一个过渡离子对，所述组合物包括蛋白C1q的至少一个过渡离子对，其中所述至少一个过渡离子对由具有对应m/z的前体离子和具有对应离子m/z的碎片离子组成。

所述C1q蛋白可以来自人。所述C1q蛋白可以来自非人灵长类动物。

本公开提供了一种组合物，其包括至少一个过渡离子对，所述组合物包括蛋白C1q的至少一个过渡离子对，其中所述至少一个过渡离子对由具有对应m/z的前体离子和具有对应离子m/z的碎片离子组成，并且其中所述过渡离子对选自前体SLGFC(Cam)DTTNK(SEQID NO:41)过渡对571.8-942.3、前体IAFSATR(SEQ ID NO:29)过渡对383.1-581.1和前体QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)过渡对487.0-350.3。上述方面中的任何方面可以与任何其它方面进行组合。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在本说明书中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式还包含复数形式；作为实例，术语“一个/一种(a/an)”和“所述”被理解为单数或复数，并且术语“或”被理解为是包含的。举例来说，“元件”意指一个或多个元件。贯穿本说明书，词语“包括(comprise)”或变型(如“包括(comprises或comprising)”应被理解为暗示包含所陈述的要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组，但不排除任何其它要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组。约可以理解为在规定的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。

尽管类似或等效于本文所描述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试本公开，但是下面描述了适合的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过全文引用的方式并入本文中。不承认本文所引用的参考文献是所要求保护的发明的现有技术。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。根据以下详细描述和权利要求，本公开的其它特征和优点将显而易见。

附图说明

当结合附图时，根据以下详细描述，将更清楚地理解上述以及另外的特征。

图1是来自人、猴、小鼠和大鼠的C1q的A亚基的氨基酸序列比对。

图2是来自人、猴、小鼠和大鼠的C1q的B亚基的氨基酸序列比对。

图3是来自人、猴、小鼠和大鼠的C1q的C亚基的氨基酸序列比对。

图4是使用本公开的方法和源自C1q蛋白的A亚基的肽产生的校准曲线。

图5是使用本公开的方法和源自C1q蛋白的B亚基的肽产生的校准曲线。

图6是使用本公开的方法和源自C1q蛋白的C亚基的肽产生的校准曲线。

图7是源自空白消化、双空白、空白和定量下限(LLOQ)样品中的C1q的A、B和C亚基的所选肽的一系列LC-SRM-MS/MS色谱图。

图8是示出突出显示的峰的信噪比和响应值的源自检测极限(LOD)和LLOQ样品中的C1q的A、B和C亚基的所选肽的一系列LC-SRM-MS/MS色谱图。

图9是在分析ULOQ样品之前和之后源自空白消化样品中的C1q的A、B和C亚基的所选肽的一系列LC-SRM-MS/MS色谱图。

图10示出了源自补充有2000μg/mL双特异性抗体、20μg/mL双特异性抗体或没有双特异性抗体的双空白(L00)标准溶液以及LLOQ样品中的C1q的A、B和C亚基的所选肽的LC-SRM-MS/MS色谱图。

图11是示出使用本公开的方法测量的与双特异性抗体一起温育的样品中的C1q的相对响应的一系列图表。

图12是示出使用本公开的方法针对在不同稀释剂中以不同稀释因子稀释的样品中的内源性C1q测量的相对响应的一系列图表。

图13是示出使用本公开的方法针对在不同稀释剂中以不同稀释因子稀释的样品中的C1q测量的相对响应的一系列图表。

图14是示出使用本公开的方法的经受三个冻融循环或在自动采样器中存储48小时的样品中的C1q的所测量的浓度的准确度的一系列图表。

图15示出了描绘使用本公开的方法和源自C1q的A亚基的所选肽确定的来自经过给药的猴的血液样品中的C1q浓度随时间推移的图表。

图16示出了描绘使用本公开的方法和源自C1q的B亚基的所选肽确定的来自经过给药的猴的血液样品中的C1q浓度随时间推移的图表。

图17示出了描绘使用本公开的方法和源自C1q的C亚基的所选肽确定的来自经过给药的猴的血液样品中的C1q浓度随时间推移的图表。

具体实施方式

本公开提供了用于确定生物样品中的蛋白质生物标志物的丰度和/或浓度的方法和组合物。在一些方面，此蛋白质生物标志物是蛋白C1q。在一些方面，本公开的方法包括液相色谱选择性反应监测质谱(LC-SRM-MS)分析。

补体组分1q(C1q)是涉及补体系统的蛋白复合物，所述补体系统是先天免疫系统的一部分。C1q与C1r和C1s一起形成C1复合物。C1q是由以下18个多肽亚基组成的400kDa的蛋白质：六个A亚基、六个B亚基和六个C亚基。补体抑制剂已成功用于治疗若干种疾病。靶向C1q的单克隆抗体具有治疗涉及经典补体途径的自身免疫疾病的潜力。靶向C1q的治疗方法的发展需要用于在实验室研究和临床试验期间确定生物样品中的C1q水平的浓度的方法。迄今为止，确定人样品中的C1q丰度需要使用免疫测定，如ELISA。此外，在非人灵长类动物样品中存在有限的用于测定C1q的免疫试剂，这是临床前研究和试验的重要方面。因此，需要一种用于确定源自人、非人灵长类动物和其它模型生物体的生物样品中的C1q浓度的经过改进的测定。

液相色谱选择性反应监测质谱(LC-SRM-MS)方法是非常期望的，因为当利用适合的内标物时，LC-SRM-MS方法提供了对靶蛋白的绝对结构特异性以及对靶蛋白浓度的相对或绝对测量两者。

本文详细描述了本公开的各种方法。

本公开提供了一种方法，其包括包含以下的测定：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段；以及(2)执行所选反应监测质谱(SRM-MS)以测量所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q的浓度。

在一些方面，前述方法可以进一步包括：在步骤(1)与步骤(2)之间，向所述生物样品添加包括与所述至少一个C1q肽片段的氨基酸序列相同的氨基酸序列的至少一个标记的合成C1q肽片段。

本公开还提供了一种方法，其包括包含以下的测定：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段；(2)执行所选反应监测质谱(SRM-MS)以产生与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号；以及(3)通过将所述信号与标准曲线进行比较来确定所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少一个C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q浓度。

在一些方面，前述方法可以进一步包括：在步骤(1)与步骤(2)之间，向所述生物样品添加包括与所述至少一个C1q肽片段的氨基酸序列相同的氨基酸序列的至少一个标记的合成肽片段；以及在步骤(2)与步骤(3)之间，执行SRM-MS以产生与所述至少一种标记的合成肽相对应的信号。

在一些方面，所述生物样品可以是血液样品。在优选的方面，所述生物样品可以是血清样品。在一些方面，所述生物样品可以是人样品。可替代地，所述生物样品可以是非人灵长类动物样品。所述非人灵长类动物可以是食蟹猴(Macaca fascicularis)或猕猴(Macaca mulatta)。

在一些方面，C1q蛋白可以是人C1q蛋白。在其它方面，C1q蛋白是食蟹猴C1q蛋白。在又另一方面，C1q蛋白可以是猕猴C1q蛋白。C1q蛋白可以包括表1中所示的序列中的任何序列。

表1.C1q蛋白的序列

在前述方法的一些方面，蛋白C1q的至少一个肽片段包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或至少20个氨基酸。

在前述方法的一些方面，蛋白C1q的至少一个肽片段包括选自表2的肽。在其它方面，至少一个肽片段包括蛋白C1q的胰蛋白酶肽。

表2.C1q肽序列

*表示人/猴C1q共同肽。

在前述方法的一些方面，蛋白C1q的至少一个肽片段包括SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)或QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)。在其它方面，所述至少一个肽片段包括SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)或QTHQPPAPNSLIR(SEQID NO:36)中的至少两个。在仍其它方面，所述至少一个肽片段包括SLGFCDTTNK(SEQ IDNO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)和QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)中的每一个。

因此，本公开涵盖了一种方法，其包括包含以下的测定：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段，其中所述至少一个肽片段包括SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)和QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)中的每一个；(2)执行SRM-MS以产生与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号，其中所述SRM-MS信号是根据包括前体SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)过渡对571.8-942.3、前体IAFSATR(SEQ ID NO:29)过渡对383.1-581.1和前体QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)过渡对487.0-350.3中的每一个的过渡离子对的；以及(3)通过将所述信号与标准曲线进行比较来确定所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少一个C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q浓度。

本公开还涵盖一种方法，其包括包含以下的测定：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段，其中所述至少一个肽片段包括SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)和QTHQPPAPNSLIR(SEQID NO:36)中的每一个；(2)向所述生物样品添加包括与SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)和QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)中的每一个的氨基酸序列相同的氨基酸序列的至少一个标记的合成肽片段；(3)执行SRM-MS以产生与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号，其中所述SRM-MS信号是根据包括前体SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)过渡对571.8-942.3、前体IAFSATR(SEQ ID NO:29)过渡对383.1-581.1和前体QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)过渡对487.0-350.3中的每一个的过渡离子对以及与所述至少一种标记的合成肽相对应的信号的；以及(4)通过将所述信号与标准曲线进行比较来确定所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少一个C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q浓度。

本公开还涵盖一种方法，其包括包含以下的测定：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段，其中所述至少一个肽片段包括SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)；(2)执行所选反应监测质谱(SRM-MS)以产生与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号，其中所述SRM-MS信号是根据包括前体SLGFC(Cam)DTTNK(SEQ ID NO:41)过渡对571.8-942.3的过渡离子对的；以及(3)通过将归一化信号与标准曲线进行比较来确定所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少一个C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q浓度。

本公开还涵盖一种方法，其包括包含以下的测定：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段，其中所述至少一个肽片段包括SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)；(2)向所述生物样品添加包括与SLGFCDTTNK(SEQID NO:26)的氨基酸序列相同的氨基酸序列的至少一个标记的合成肽片段；(3)执行所选反应监测质谱(SRM-MS)以产生与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号，其中所述SRM-MS信号是根据包括前体SLGFC(Cam)DTTNK(SEQ ID NO:41)过渡对571.8-942.3的过渡离子对以及与所述至少一种标记的合成肽相对应的信号的；以及(4)通过将归一化信号与标准曲线进行比较来确定所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少一个C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q浓度。

本公开还涵盖一种方法，其包括包含以下的测定：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段，其中所述至少一个肽片段包括IAFSATR(SEQ ID NO:29)；(2)执行所选反应监测质谱(SRM-MS)以产生与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号，其中所述SRM-MS信号是根据包括前体IAFSATR(SEQ IDNO:29)过渡对383.1-581.1的过渡离子对的；以及(3)通过将所述信号与标准曲线进行比较来确定所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少一个C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q浓度。

本公开还涵盖一种方法，其包括包含以下的测定：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段，其中所述至少一个肽片段包括IAFSATR(SEQ ID NO:29)；(2)向所述生物样品添加包括与IAFSATR(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列相同的氨基酸序列的至少一个标记的合成肽片段；(3)执行所选反应监测质谱(SRM-MS)以产生与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号，其中所述SRM-MS信号是根据包括前体IAFSATR(SEQ ID NO:29)过渡对383.1-581.1的过渡离子对以及与所述至少一种标记的合成肽相对应的信号的；以及(4)通过将所述信号与标准曲线进行比较来确定所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少一个C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q浓度。

本公开还涵盖一种方法，其包括包含以下的测定：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段，其中所述至少一个肽片段包括QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)；(2)执行所选反应监测质谱(SRM-MS)以产生与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号，其中所述SRM-MS信号是根据包括前体QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)过渡对487.0-350.3的过渡离子对的；以及(3)通过将所述信号与标准曲线进行比较来确定所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少一个C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q浓度。

本公开还涵盖一种方法，其包括包含以下的测定：(1)使生物样品与至少一种蛋白水解酶接触以产生所述生物样品中存在的蛋白C1q的至少一个肽片段，其中所述至少一个肽片段包括QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)；(2)向所述生物样品添加包括与QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列相同的氨基酸序列的至少一个标记的合成肽片段；(3)执行所选反应监测质谱(SRM-MS)以产生与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号，其中所述SRM-MS信号是根据包括前体QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)过渡对487.0-350.3的过渡离子对以及与所述至少一种标记的合成肽相对应的信号的；以及(4)通过将所述信号与标准曲线进行比较来确定所述至少一个C1q肽片段的丰度，其中所述至少一个C1q肽片段的所述丰度决定所述生物样品中的C1q浓度。

在本公开的方法的一些方面，所选反应监测质谱是LC-SRM-MS/MS。

在本公开的方法的一些方面，所述至少一种蛋白水解酶是胰蛋白酶。其它适合的蛋白水解酶将是本领域技术人员已知的，包含但不限于Glu-C蛋白酶、Lys-N蛋白酶、Lys-C蛋白酶、Asp-N蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。

在本公开的方法的一些方面，可以使用包括以下的方法来产生标准曲线：(a)通过混合已知数量的经过纯化的C1q蛋白和C1q消耗的血清制备至少两种C1q浓度标准品；(b)向所述至少两种C1q浓度标准品添加至少一个标记的合成肽片段，其氨基酸序列与预期在使所述C1q浓度标准品与蛋白水解酶接触后产生的至少一个C1q肽片段相同；(c)使所述至少两种标记的C1q浓度标准品与蛋白水解酶接触以产生至少一个C1q肽片段；(d)执行所选反应监测质谱，以确定与所述至少一个C1q肽片段相对应的信号的强度和与所述至少两种标记的C1q浓度标准品中的每一者中的所述至少一个标记的合成肽片段相对应的信号的强度；以及(e)使用所述信号和所述已知数量的C1q蛋白确定标准曲线。

在一些方面，可以使用至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或至少八个、或至少九个或至少十个C1q浓度标准品产生标准曲线。在一些方面，制备C1q浓度标准品可以包括在C1q消耗的血清中稀释或连续稀释经过纯化的C1q蛋白，其中稀释因子可以为1:1、1:1.5或1:2、或1:2.5、或1:3、或1:3.5、或1:4、或1:5、或1:6、或1:7、或1:8、或1:9、或1:10、或1:100或1:1000或在1:1到1:10000的范围内的任何稀释因子。

在本公开的方法的一些方面，在使生物样品与蛋白水解酶接触之前，可以将至少一个标记的合成肽片段添加到生物样品。

在本公开的一些方面，所述至少一个标记的合成肽片段可以用于对本公开的方法进行故障排除。

在本公开的一些方面，与至少一个标记的合成肽片段相对应的信号可以用于使与标记的合成肽片段相对应的蛋白C1q的至少一个肽片段的信号归一化。

在本公开的方法的一些方面，C1q标准曲线可以用于测量生物样品中的C1q丰度。可以定义预定的标准样品中的C1q肽的丰度，并且将结果与来自生物样品中发现的对应的C1q肽的LC-SRM-MS结果进行比较。这允许计算生物样品中的肽的丰度。因此，通过了解样品中的肽的丰度，可以确定其对应的蛋白质的丰度。

本文详细描述了本公开的各种组合物。

本公开提供了一种组合物，其包括至少一种分离的合成肽，所述组合物包括具有选自蛋白C1q的氨基酸序列的至少一种分离的合成肽。

可以使用本领域已知的任何方法来产生合成肽。这些方法可以包含重组表达技术，如在细菌中表达或在真核细胞裂解物中体外表达。这些方法还可以包含固相合成。

合成肽可以是同位素标记的。可以利用其标记合成肽的同位素包含

在本公开的组合物的一些方面，C1q蛋白可以是人C1q蛋白。在其它方面，C1q蛋白是食蟹猴C1q蛋白。在又另一个方面，C1q蛋白可以是猕猴。C1q蛋白可以包括表1中所示的序列中的任何序列。

在本公开的组合物的一些方面，所述至少一种分离的合成肽包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或至少20个氨基酸。

在本公开的组合物的一些方面，分离的合成肽包括通过使C1q与蛋白水解酶接触而产生的C1q肽片段的序列。在优选的方面，蛋白水解酶是胰蛋白酶。因此，在优选的方面，分离的合成肽是C1q的胰蛋白酶肽。

在本公开的组合物的一些方面，标记了分离的合成肽。分离的合成肽可以是同位素标记的。可以利用其标记分离的合成肽的同位素包含但不限于

在本公开的组合物的一些方面，分离的合成肽包括选自表2的肽。在其它方面，组合物包括表2中描述的任何两种肽。在其它方面，组合物包含表2中描述的任何3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种肽。

在优选的方面，本公开的组合物可以包括至少一种分离的合成肽，所述至少一种分离的合成肽包括SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)或QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)。组合物可以包括包含SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)或QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)中的至少两个的至少一种分离的合成肽。在又其它方面，组合物可以包括包含SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)、IAFSATR(SEQ ID NO:29)或QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)中的每一个的至少一种分离的合成肽。

在本公开的组合物的一些方面，所述合成肽SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)中的半胱氨酸可以被修饰。所述修饰可以是脲基甲基化。

本公开提供了一种组合物，其包括至少一个过渡离子对，所述组合物包括蛋白C1q的至少一个过渡离子对，其中所述至少一个过渡离子对由具有对应m/z的前体离子和具有对应离子m/z的碎片离子组成。

在本公开的组合物的一些方面，C1q蛋白可以是人C1q蛋白。在其它方面，C1q蛋白是食蟹猴C1q蛋白。在又另一个方面，C1q蛋白可以是猕猴。C1q蛋白可以包括表1中所示的序列中的任何序列。

本公开提供了一种组合物，其包括至少一个过渡离子对，所述组合物包括蛋白C1q的至少一个过渡离子对，其中所述至少一个过渡离子对由具有对应m/z的前体离子和具有对应离子m/z的碎片离子组成，并且其中所述过渡离子对选自前体SLGFC(Cam)DTTNK(SEQID NO:41)过渡对571.8-942.3、前体IAFSATR(SEQ ID NO:29)过渡对383.1-581.1和前体QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)过渡对487.0-350.3。

如本文所使用的，“m/z”表示离子的质荷比。

如本文所使用的，“MS/MS”表示串联质谱，其是涉及质量分析的多个阶段的一种质谱，其中在各阶段之间发生某种形式的片段化。

如本文所使用的，“LC-SRM-MS”是“选择性反应监测”的首字母缩写，并且可以与“LC-MRM-MS”或“LC-SRM-MS/MS”互换使用。

LC-SRM-MS是一种串联质谱的高度选择性方法，其具有有效过滤掉除一种或多种期望的分析物之外的所有分子和污染物的潜力。如果分析样品是在定义的分析窗口内可以包括若干种同量异位物质的复杂的混合物，则这是特别有益的。LC-SRM-MS方法可以利用三重四极杆质谱仪，如本领域中已知的，所述三重四极杆质谱仪包含三个四重杆组。在第一四极杆组中执行质量选择的第一阶段，并且在第二四极杆组中使选择性传输的离子碎裂。所得过渡(产物)离子被输送到第三四极杆组，所述第三四极杆组执行质量选择的第二阶段。通过检测器测量通过第三四极杆组传输的产物离子，所述检测器产生表示选择性传输的产物离子的数量的信号。对施加到第一四极和第三四极的RF和DC电势进行微调，以(分别)选择m/z值位于指定的狭窄范围内的前体离子和产物离子。通过指定适当的过渡(前体离子和产物离子的m/z值)，可以以高灵敏度和选择性测量对应于靶向蛋白质的肽。LC-SRM-MS中的信噪比通常优于不会选择性地靶向(过滤)特定分析物而是旨在调查样品中的所有分析物的常规的串联质谱(MS/MS)实验。

LC-SRM-MS质谱涉及气相离子的碎裂，并且发生在质谱分析的不同阶段之间。存在用于使离子碎裂的许多方法，并且这些方法可能产生不同类型的碎裂，并且因此产生有关分子的结构和组成的不同信息。在LC-SRM-MS光谱中观察到的过渡离子是由若干种不同的因素产生的，所述因素包含但不限于主要序列、内部能量的数量、引入能量的方式以及电荷状态。过渡必须携带至少一种待检测的电荷。如果电荷位于包括肽的原始N端的过渡上，则离子分类为a、b或c，而如果电荷位于包括肽的原始C端的过渡上，则离子分类为x、y或z。下标指示过渡中的残基位置(例如，来自C端的x

在通用肽中，重复单元表示-N-C(O)-C-、x离子和由羰基-碳键(即，C(O)-C)的切割而产生的离子。x离子是酰基离子(acylium ion)，并且a离子是亚胺离子(iminium ion)。y离子和b离子是由羰基-氮键(即，C(O)-N，也被称为酰胺键)的切割而产生的。在此情况下，y离子是铵离子，并且b离子是酰基离子。最后，由氮-碳(即，C-N)键的切割而产生z离子和c离子。z离子是碳阳离子，并且c离子是铵离子。

有时使用上标来表示除主链片段化之外的中性损失，例如，*表示氨损失，并且°表示水损失。除质子外，c离子和y离子还可以从前体肽中提取另外的质子。在电喷射离子化中，胰蛋白酶肽可以携带多于一个电荷。

内部过渡是由双主链切割引起的。这些可以通过b型和y型切割(即，产生b离子和y离子的切割)的组合形成。内部切割离子也可以通过a型和y型切割的组合形成。通过a型和y型切割的组合形成的具有单侧链的内部过渡被称为亚胺离子(iminium ion)(有时也被称为亚铵或亚铵离子(immonium ion))。这些离子标记有对应氨基酸的一个字母代码。

低能量CID(即，三重四极杆或离子阱中的碰撞诱导解离)涉及主要沿其主链携带正电荷的肽的片段化，以主要产生a离子、b离子和y离子。

在随后的LC-SRM-MS分析步骤之前执行一个或多个液相色谱(LC)纯化步骤。传统的LC分析依赖于样品组分与柱填充材料之间的化学相互作用，其中样品通过柱的层流是从测试样品中分离出所关注的分析物的基础。技术人员将理解的是，在此类柱中的分离是扩散过程。多种柱填充材料可用于样品的色谱分离，并且选择适当的分离方案是取决于样品特性、所关注的分析物、存在的干扰物质和其特性等的经验过程。可以根据需要(例如，所纯化的化合物的结构、极性和溶解度)使用各种填充化学物质。在各个方面，柱是极性的、离子交换的(阳离子和阴离子)、疏水性相互作用、苯基、C-2、C-8、C-18柱、多孔聚合物上的极性涂层或其它可商购获得的。在色谱分析期间，材料的分离受到变量的影响，如洗脱剂的选择(也被称为“流动相”)、梯度洗脱的选择以及梯度条件、温度等。在某些方面，在由柱填充材料可逆地保留所关注的分析物而没有保留一种或多种其它材料的条件下，可以通过将样品施加到柱来纯化分析物。在这些方面，可以采用第一流动相条件，其中所关注的分析物被柱保留，并且一旦将未保留的材料洗涤后，随后就可以采用第二流动相条件从柱中去除所保留的材料。可替代地，在与一种或多种其它材料相比，所关注的分析物以不同的速率洗脱的流动相条件下，可以通过将样品施加到柱来纯化分析物。如上文所讨论的，相对于样品的一种或多种其它组分，此类程序可以丰富一种或多种所关注的分析物的量。

以下参数用于指定特定LC-SRM-MS系统下蛋白质的LC-SRM-MS测定：(1)蛋白质的胰蛋白酶肽；(2)肽的保留时间(RT)；(3)肽前体离子的m/z值；(4)用于使前体离子离子化的去簇电势；(5)由肽前体离子产生的碎片离子的m/z值；以及(6)用于使针对特定肽进行优化的肽前体离子碎裂的碰撞能量(CE)。

如本文所使用的，“ISP”是指“内部标准肽”。

为了通过本文公开的方法促进肽过渡的准确定量，可以将已知量的一组所关注的同位素标记的合成肽添加到样品中，以用作内标物。由于同位素标记的肽具有与对应的替代肽相同的物理和化学性质，因此其会从色谱柱上共同洗脱出来，并且可容易地在所得质谱图中进行鉴别。标记的标准品的添加可以在蛋白水解消化之前或之后进行。同位素标记的肽的合成方法将是本领域技术人员已知的。因此，在一些方面，实验样品含有内部标准肽。其它方面可以利用外部标准品或其它权宜方法进行肽定量。

如本文所使用的，“胰蛋白酶肽”是指通过用胰蛋白酶处理蛋白质而形成的肽。

如本文所使用的，术语“标准曲线”可以与术语“校准曲线”互换使用。

如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。

除非具体规定或根据上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“或”应理解为包含性的并且涵盖“或”和“与”。

除非明确规定或根据上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。约可以理解为在规定的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本文所描述的那些探针、组合物、方法和试剂盒类似或等同的其它探针、组合物、方法和试剂盒均可以用于本公开的实践中，但是本文描述了优选的材料和方法。应该理解的是，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不旨在是限制性的。

实例：

使用已知的C1q浓度的一组C1q参考溶液(包含C1q标准品和质量对照(QC)样品)，将本公开的方法用于产生标准曲线(也被称为校准曲线)。还对本公开的方法的灵敏度和准确度进行了测试。

使用利用以下准则制备和施加的C1q标准样品产生校准曲线：

·将经过纯化的C1q蛋白稀释在与实验样品相同的生物基质中，

·所测试的一组C1Q参考溶液由双空白、空白和至少6个非零浓度的C1q组成；

·定量下限(LLOQ)定义为C1q蛋白的浓度，在所述浓度下，LLOQ样品的测量响应是空白样品的响应的至少5倍，使得准确度在标称浓度的25％以内并且变异系数小于25％；

·定义定量上限(ULOQ)，使得准确度在标称浓度的20％以内，并且变异系数小于20％。

使用利用以下准则制备和施加的C1q QC样品产生校准曲线：

·制备了至少3种浓度的QC样品并且将其用于校准；

·每个QC样品均一式两份地进行制备；

·QC样品涵盖了测定的低、中和高定量范围，并且低QC(LQC)样品处于LLOQ浓度的3倍之内；

·至少67％的QC样品的准确度处于标称浓度的20％以内；

·每个水平下的至少50％的QC样品的准确度处于标称浓度的20％以内；

·QC样品的最小数量等于未知样品或至少6个总QC样品数量的至少5％；

·QC样品是用C1q储备溶液制备的，所述C1q储备溶液与用于制备C1q参考溶液的储备溶液分离。

材料：

·经过纯化的人补体蛋白C1q(Quidel公司，项目号A400)

·补体C1q消耗的人血清(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号234401-1ML)

·SLGFC(Cam)DTTNK(SEQ ID NO:41)(新英格兰肽公司(New England Peptide))

·IAFSATR(SEQ ID NO:29)(新英格兰肽公司)

·QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)(新英格兰肽公司)

·双特异性单克隆抗体药物候选物

·供应有重悬缓冲液的测序级经过修饰的胰蛋白酶(普洛麦格(Promega)，目录号V5117)

·UltraPure 1.0M Tris-HCl pH 7.5(英杰公司(Invitrogen)，目录号15567-027)

·UltraPure 1.0M Tris-HCl pH 8.0(英杰公司(Invitrogen)，目录号15568-025)

·UltraPure 1.0M Tris-HCl pH 8.5(阿法埃莎公司(Alfa Aesar)，目录号J61038)

·尿素(西格玛奥德里奇公司，目录号U5128-100G)

·TCEP HCL(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，目录号20491)

·碘乙酰胺(西格玛奥德里奇公司；目录号A3221-10VL)

·甲酸(赛默飞世尔科技公司，目录号28905)

·乙腈(飞世尔化学品公司(Fisher Chemical)，目录号A955-4)

·ACQUITY UPLC BEH130 C18柱，1.7μm，2.1mm×50mm((沃特世公司(Waters)，零件号1860035554)

·96孔板，0.5mL，聚丙烯(安捷伦科技公司(Agilent)，零件号5042-1386)

·25mL一次性试剂容器(VistaLab公司，零件号3054-1004)

·三重四极杆质谱仪(安捷伦科技公司，型号6495)

·1290无限II LC系统(安捷伦科技公司，型号1290)

在C1q消耗的人血清和含有20μg/mL双特异性单克隆抗体药物候选物的测定稀释缓冲液(ADB)中制备200μg/mL C1q储备溶液。将C1q储备溶液连续1到3倍稀释六次，以制备六种C1q标准溶液(L6-L1)。在ADB中独立于C1q储备溶液制备LLOQ(定量下限)、低QC、中QC、高QC和ULOQ(定量上限)样品。将ADB的等分试样保留为L0(空白)样品。表3列出了C1q标准溶液和QC溶液的浓度。

表3.C1q标准溶液和QC溶液的浓度。

将以下同位素标记的内部标准肽(ISP)在含30％乙腈的0.1％甲酸中重构到6-12mM，以产生同位素标记的ISP溶液：SLGFC(Cam)DTTNK(SEQ ID NO:41)、IAFSATR(SEQ IDNO:29)和QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)。

将每种C1q样品在100mM pH 7.5的Tris-HCl和20μg/mL的双特异性抗体中稀释50倍。然后使5μL的每种经过稀释的C1q样品变性并且在56℃下在20μL的8M尿素和10mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)中通过摇晃30分钟进行还原。然后将5μL的50mM碘乙酰胺添加到每种样品中，并且然后在25℃下将样品在摇晃下在黑暗中温育30分钟。然后将10μL适当的同位素标记的ISP溶液添加到每种样品中。在添加ISP之后，还将100μL的0.01μg/μL胰蛋白酶添加到每种样品中。然后，在37℃下将样品在摇晃下在黑暗中温育4小时。向样品中添加5μL的20％甲酸以淬灭胰蛋白酶消化反应。在通过LC-SRM-MS/MS进行分析之前，将样品混合并且以4680rpm离心持续5分钟。

LC-SRM-MS分析

LC-SRM-MS分析是在具有1290无限II LC系统(安捷伦科技公司，型号1290)的三重四极杆质谱仪(安捷伦科技公司，型号6495)上进行的。表4中描述了所使用的LC梯度，其中缓冲液A由含0.1％甲酸的水组成，并且缓冲液B由含0.1％甲酸的乙腈组成。

表4.LC梯度

SRM-MS分析同时监测样品中的天然C1q肽片段和同位素标记的肽。收集了两个过渡(天然和重标记)的峰面积，并且报告了天然C1q肽和同位素标记的C1q肽。对于每个C1q标准品和QC样品，通过LC-SRM-MS分析的C1q蛋白的数据输出产生了六个测量结果，所述测量结果由来自下表5中示出的三种所选肽中的每种所选肽的两个过渡测量结果(天然和重标记)组成。

表5.C1q靶肽的m/z过渡和碰撞能量。

表5中的三种肽中的每种肽均来自C1q的不同亚基。将源自亚基B的肽片段用作定量肽(本文中被称为亚基B肽)，并且将源自亚基A(本文中被称为亚基A肽)和C(本文中被称为亚基C肽)的肽用作确认性肽。同位素标记的ISP具有与三种所选肽中的每种所选肽相同的氨基酸序列，并且在本文中被称为同位素标记的亚基A对照肽、同位素标记的亚基B对照肽和同位素标记的亚基C对照肽。

基于先前的结果选择表5中列出的三种肽，所述结果表明，这些肽是用于对LC-SRM-MS/MS测定中的C1q浓度进行定量的最佳肽。这些肽的选择部分地基于人与猴(食蟹猴)之间的肽序列的保守性。图1示出了突出亚基A肽的人、猴(食蟹猴)、小鼠和大鼠C1q的亚基A的序列比对。图2示出了突出亚基B肽的人、猴(食蟹猴)、小鼠和大鼠C1q的亚基B的序列比对。图3示出了突出亚基C肽的人、猴(食蟹猴)、小鼠和大鼠C1q的亚基C的序列比对。最初测试了C1q的A亚基、B亚基和C亚基中的每一个的多种胰蛋白酶肽。表2中列出了所测试的肽。

结果

使用LC-SRM-MS/MS对每个C1q标准样品和每个C1q QC样品进行分析。对于每个样品，记录了6个信号：对应于天然亚基A肽的信号、对应于天然亚基B肽的信号、对应于天然亚基C肽的信号、对应于同位素标记的亚基A对照肽的信号、对应于同位素标记的亚基B对照肽的信号和对应于同位素标记的亚基C对照肽的信号。出于测定性能故障排除的目的，同位素标记的肽的数据用作内部对照。

对于三种所选肽(亚基A肽、亚基B肽和亚基C肽)中的每一种，通过绘制从C1q标准样品记录的归一化LC-SRM-MS信号相对于那些样品的对应的标称浓度产生校准曲线。图4示出了使用与亚基A肽相对应的信号产生的校准曲线。图5示出了使用与亚基B肽相对应的信号产生的校准曲线。图6示出了使用与亚基C肽相对应的信号产生的校准曲线。对于图4-6，黑点表示在浓度L1-L6下的C1q标准样品。蓝色三角形表示在LLOQ、LQC、MQC、HQC和ULOQ浓度下的C1q QC样品。

在产生校准曲线之后，然后通过将QC样品中的三种靶肽中的每一种的LC-SRM-MS/MS信号与对应的校准曲线进行比较来确定QC样品的浓度。通过将所确定的浓度与QC样品的标称浓度进行比较来评估测定的准确度。表6-8中示出了比较的结果。

表6.使用源自C1q A亚基的靶肽SLGFC(Cam)DTTNK(SEQ ID NO:41)进行测定的准确度。

表7.使用源自C1q B亚基的靶肽IAFSATR(SEQ ID NO:29)进行测定的准确度。

表8.基于源自C1q C亚基的靶肽QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)校准C1q测定。

这些结果证明测定既准确又灵敏。所述结果还证明，使用源自C1q的亚基B的肽IAFSATR(SEQ ID NO:29)提供了最佳结果，因为由LC-SRM-MS/MS记录的响应很高，并且信号无背景干扰。

LLOQ和检测极限(LOD)

如图7的左图和中间图所示，在亚基A肽和亚基B肽的LLOQ浓度(0.27μg/mL)下记录的质谱图在与空白和双空白样品中的肽峰位于相同采集时间处表现出很少或没有背景峰。然而，如图7的右图所示，所记录的亚基C肽的质谱图在空白和双空白样品中均表现出背景峰。空白样品中的背景峰的曲线下面积为样品峰的曲线下面积的大约5％。总体而言，如图8所示，在LLOQ浓度下的亚基A肽、亚基B肽和亚基C肽的信噪比分别为51、36、94，并且在检测极限(LOD)浓度下的亚基A肽、亚基B肽和亚基C肽的信噪比分别为7、9和6。

由于本公开的方法可以用于在同一仪器上进行连续实验，因此重要的是要确保来自最后一个样品的残留不会干扰下一个样品的测定。对在实践本公开的方法期间的仪器残留进行测量。

首先记录空白消化样品的LC-SRM-MS色谱图。之后，立即在同一仪器上记录在ULOQ浓度(66.7μg/mL)下的C1q QC样品的质谱图。最后，在分析了ULOQ样品后，在同一台仪器上分析第二个空白消化样品。如图9所示，在分析ULOQ样品的亚基A、亚基B或亚基C肽之前或之后，空白消化色谱图没有显著变化。这些结果证明，用于本公开的方法的仪器残留是最小的。

为了检查抗体药物的存在是否会干扰本公开的方法，将不同浓度(0、20μg/mL或2000μg/mL)的双特异性抗体添加到在双空白(仅空白基质，无内标物；L00)浓度下的C1q参考样品中。如图10所示，双特异性抗体的添加在所记录的质谱图中未产生任何显著变化。

将在LQC、MQC和HQC浓度(分别为0.8μg/mL、6.3μg/mL和50.0μg/mL)下的C1q参考样品在不存在双特异性抗体的情况下温育或与0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL或2000μg/mL的双特异性抗体一起温育，并且使用LC-SRM-MS/MS进行分析。C1q测定中的双特异性抗体的这些浓度对应于纯血清中的1mg/mL、2mg/mL或100mg/mL的双特异性抗体。为了使这些浓度符合药代动力学，当以50mg/kg的剂量施用时，双特异性抗体6的峰值血清浓度(C

还在以不同稀释剂和不同稀释因子稀释的样品中测试了本公开的方法中的内源性C1q信号的回收率。所测试的稀释剂包含与20μg/mL的双特异性抗体一起温育的2％消耗的人血清、2％消耗的人血清、0.1％BSA和Tris-HCl溶液。将这些样品稀释20倍、50倍和100倍，并且然后使用LC-SRM-MS/MS分析稀释度。如图12所示，即使在较高的稀释因子下，双特异性抗体的添加也改善了亚基A、亚基B和亚基C肽信号的回收率。使用0.1％BSA和Tris-HCl稀释的样品中的信号回收率较低。在图12中，每组中的蓝色或第一条与使用与20μg/mL的双特异性抗体一起温育的2％消耗的人血清稀释的样品相对应；每组中的橙色或第二条对应于用2％消耗的人血清稀释的样品；每组中的绿色或第三条对应于用0.1％BSA稀释的样品；每组中的紫色或第四条对应于用Tris-HCl稀释的样品。

还对使用不同稀释剂从C1q参考标准品回收信号进行测试。将在LQC、MQC和HQC浓度(分别为0.8μg/mL、6.3μg/mL和50.0μg/mL)下的C1q参考样品用与20μg/mL的双特异性抗体一起温育的2％消耗的人血清、2％消耗的人血清或0.1％BSA进行稀释。如图13所示，双特异性抗体改善了亚基A、亚基B和亚基C肽信号的回收率。在图13中，每组中的蓝色或第一条与使用与20μg/mL的双特异性抗体一起温育的2％消耗的人血清稀释的样品相对应；每组中的橙色或第二条对应于用2％消耗的人血清稀释的样品；每组中的绿色或第三条对应于用0.1％BSA稀释的样品。

为了测试本公开的方法的稀释线性度，将合并的人血清、雄猴和雌猴样品分别稀释20倍、50倍和100倍。使用本公开的方法确定这些经过稀释的样品中的内源性C1q的浓度。下表9中示出了此测试的结果。

表9.内源性C1q的稀释线性度测试。

使用C1q QC样品在LLOQ、LQC、MQC、HQC和ULOQ浓度下测试了本公开的方法的样品制备可重复性。对于注射可重复性，将同一QC样品的等分试样在同一天(日内)或不同天(日间)注射到测定仪器中。对于样品制备可重复性，可以在同一天(日内)或不同天(日间)从QC溶液中制备样品。测试了每种条件的3个样品，并且每种条件的3个样品的相对标准偏差在下表10中示出。

表10.本公开的方法的注射和样品制备可重复性

对于样品稳定性，分别使在LLOQ、LQC、MQC、HQC和ULOQ浓度(分别为0.3μg/mL、0.8μg/mL、6.3μg/mL、50.0μg/mL和66.7μg/mL)下的C1q QC样品经历三个冻融循环，或在通过C1q测定确定其C1q浓度之前，将其储存在自动取样器中持续48小时。如图14所示，本公开的方法的准确度受三个冻融循环或在自动取样器中储存48小时的影响不显著。在图14中的图表的顶行中，每组中的第一条对应于在冷冻前进行新鲜分析的样品；每组中的第二条对应于经历三个冻融循环的样品。在图14中的图表的底行中，每组中的第一条对应于进行新鲜分析的样品；每组中的第二条对应于在自动进样器中储存48小时之后进行分析的样品。

在单独的实验中，还测试了72小时的储存，并且没有观察到样品降解或损失。

重同位素标记的肽；称为内部标准肽(ISP)，具有与亚基A、亚基B和亚基C肽相同的氨基酸序列。在存在和不存在每个ISP的情况下，分析了在LLOQ、LQC、MQC、HQC和ULOQ浓度(分别为0.3μg/mL、0.8μg/mL、6.3μg/mL、50.0μg/mL和66.7μg/mL)下的C1q QC样品。表11中示出了此分析的结果。包含ISP不会干扰分析。因此，同位素标记的肽用于保留时间确认、仪器性能校准和故障排除目的。

表11.在具有或不具有同位素标记的内部标准肽的情况下的C1q测定变化

本公开的方法用于对用双特异性抗体处理的猴的血液样品中存在的C1q蛋白的浓度进行定量。表12中示出了猴组的名称和剂量水平。

表12.猴组的名称和剂量水平

通过慢推注静脉内注射以2mL/kg的剂量体积向第1组施用经过稀释的同种型对照抗体。通过慢推注静脉内注射以2mL/kg的剂量向第2组、第3组和第4组施用经过稀释的双特异性抗体。根据以下时间表收集0.5mL血液样品：在第1天收集给药前样品和给药后大约5分钟的样品；在给药后24小时、72小时和168小时收集后续样品；在给药后第14天、给药后第42天和给药后第56天中的每一天也收集一次样品。收集后将血液样品离心持续1小时，并且然后将所采集的血清样品分成4等份试样，每份50μL。

将每种猴血清样品在100mM pH 7.5的Tris-HCl和20μg/mL的双特异性抗体中稀释50倍。然后使5μL的每种经过稀释的猴血清样品变性并且在56℃下在20μL的8M尿素和10mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)中通过摇晃30分钟进行还原。然后将5μL的50mM碘乙酰胺添加到每种样品中，并且然后在25℃下将样品在摇晃下在黑暗中温育30分钟。在向每种样品中添加100μL的0.01μg/μL胰蛋白酶之前，先添加10μL的适当的同位素标记的内部标准肽溶液(参见实例1)。然后，在37℃下将样品在摇晃下在黑暗中温育4小时。向样品中添加5μL的20％甲酸以淬灭胰蛋白酶消化反应。在通过LC-SRM-MS/MS对样品进行分析之前，将样品混合并且以4680rpm离心持续5分钟。

对于每个猴血清样品，使用LC-SRM-MS/MS记录对应于亚基A肽、亚基B肽和亚基C肽的信号以及对应于同位素标记的内部标准肽的信号。

然后，通过将亚基A肽、亚基B肽和亚基C肽的信号与校准曲线(如实例1所描述产生的)进行比较来确定经过给药的猴血清样品中的每个血清样品中的C1q的浓度。表13-15中示出了如由亚基A肽、亚基B肽和亚基C肽确定的C1q的浓度。图15-17中描绘了猴血液中的C1q浓度的给药后时间过程。图15示出了使用亚基A肽进行定量的给药猴样品中的C1q的浓度。图16示出了使用亚基B肽进行定量的给药猴样品中的C1q的浓度。图17示出了使用亚基C肽进行定量的给药猴样品中的C1q的浓度。在图15-17中，蓝线对应于第1组中的猴，红线对应于第2组中的猴，绿线对应于第3组中的猴，并且紫线对应于第4组中的猴。

表13.通过源自C1q A亚基的靶肽SLGFCDTTNK(SEQ ID NO:26)对经过给药的猴血液样品的C1q浓度进行定量。

*估计的C1q浓度。浓度低于LLOQ(0.27μg/mL)但高于LOD(0.027μg/mL)。

表14.通过源自C1q B亚基的靶肽IAFSATR(SEQ ID NO:29)对经过给药的猴血液样品的C1q浓度进行定量。

*估计的C1q浓度。浓度低于LLOQ(0.27μg/mL)但高于LOD(0.027μg/mL)。

表15.通过源自C1q C亚基的靶肽QTHQPPAPNSLIR(SEQ ID NO:36)对经过给药的猴血液样品的C1q浓度进行定量。

*估计的C1q浓度。浓度低于LLOQ(0.27μg/mL)但高于LOD(0.027μg/mL)。