吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐的作为抗病毒新药的用途

摘要

本发明涉及吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐的新药用途，该新药用途具体涉及吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐在制备用于治疗和/或预防病毒感染及病毒感染引起的并发症如肺炎，炎症风暴的药物中的应用。本发明首次将吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐用于制备治疗和/或预防病毒感染及病毒感染引起的适应症如肺炎，炎症风暴等。

说明书

技术领域

本发明涉及吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐的新药用途，该新药用途具体涉及吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐在制备用于治疗和/或预防病毒感染及病毒感染引起的并发症如肺炎，炎症风暴的药物中的应用。

背景技术

冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征（MERS）和严重急性呼吸综合征（SARS）等较严重疾病。

2020年1月12日，世界卫生组织将2019年12月以来新出现的新型冠状病毒正式命名为2019-nCoV ，该新型冠状病毒是以前从未在人体中发现过的冠状病毒新毒株 。

人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法可以对症处理，因此需根据患者临床情况进行治疗。

鼠肝炎病毒（MHV）是小鼠的天然病原体，与SARS-CoV2病毒、SARS病毒、MERS病毒同属冠状病毒贝塔亚家族，在传播方式、发病机制、累及的组织器官以及引发的病理改变等诸多方面都有相似的特征。MHV包括多个毒株，如MHV-1, MHV-2, MHV-3, MHV-JHM (MHV-4),MHV-A59 和MHV-S。其中，MHV-A59毒株可以通过鼻腔滴注，在小鼠引发病毒性肺炎（Coronavirus MHV-A59 infects the lung and causes severe pneumonia in C57BL/6mice. Virol Sin. 2014 Dec; 29(6): 393–402），因此，该模型是研究SARS-CoV-2病毒乃至其他冠状病毒感染人类的理想模型（Of Mice and Men: The Coronavirus MHV andMouse Models as a Translational Approach to Understand SARS-CoV-2 Viruses.2020 Aug; 12(8): 880）。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是目前对对于2019-nCoV新型冠状病毒所致疾病尚无特异治疗药物的问题。

如式（I）所示，吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）于1964年首先在细菌中发现其作为一种辅酶存在。

（I）

随后的研究证实，PQQ是一种水溶性的物质，可作为电子的受体或供体参与氧化还原酶的酶促反应。PQQ广泛存在于动植物中，在人体组织广泛分布，其中在母乳中含量最高。PQQ具有广泛的生物学功能，主要包括：（1）刺激微生物、植物、动物生长；（2）动物发育和繁殖必需的营养因子；（3）清除过多的自由基，保护机体免受氧化损伤；（4）提供神经营养和保护作用。人体实验显示，PQQ能够改善睡眠和认知，降低血浆中炎症因子IL-6和C-反应蛋白（CRP）的表达。有学者提出将PQQ归类为第14种维生素，现已作为保健品在美国和日本上市。

申请人通过大量的研究和实验，惊奇的发现：吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐对治疗和/或预防病毒感染及病毒感染引起的适应症如肺炎，炎症风暴具有很好的疗效，在人群观察中发现，口服PQQ能够显著减少感冒的发生频率。

本发明为吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐提供了新的药用用途，并为人们提供了一种以吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐为有效成分的药物组合物。

采用吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐为有效成分的药物具有如下优点：

1）稳定，PQQ具有独特的邻苯醌结构，在化学性质方面相对稳定，这种特性使其能参与20000次氧化还原循环，自由基清除活性显著高于维生素C（Altern Med Rev. 2009Sep;14(3):268-77）；

2）安全，PQQ的大鼠半数致死剂量为1000-2000毫克/公斤体重，每天每公斤体重100毫克连续14天，未发现任何不良反应（Regul Toxicol Pharmacol. 2014 Oct;70(1):107-21）。

将吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐用于制备治疗和/或预防病毒感染及病毒感染引起的适应症如肺炎，炎症风暴，目前未见报道。

附图说明

图1 是PQQ体外抑制MHV病毒噬菌斑形成的效果示意图。

图1中，纵坐标表示的是噬斑的数量，横坐标表示的是PQQ的浓度；*表示p﹤0.05

图2是小鼠肺脏的形态图（照片），其中，模型组是小鼠经MHV病毒感染引发肺部炎症五天后肺脏的形态图；模型+PQQ治疗组是小鼠经鼻腔滴注MHV-A59病毒并用PQQ灌胃五天后肺脏的形态图；空白对照组正常小鼠的肺脏的形态图。

图3是图2所示小鼠肺脏的病理切片HE染色图。

图4是17名服用PQQ一年内与未服用PQQ前一年内出现感冒症状的均值对比图。

**表示p﹤0.01。

具体实施方式

实验1：PQQ体外抑制MHV病毒噬菌斑的形成

病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆，也可用于在细胞水平检测病毒的感染、增殖的能力。

材料与方法

MHV-A59病毒株购至苏州西山生物技术有限公司，PFU/毫升为1.4X10

具体实验步骤：

1、将L929细胞培养于六孔板至约密度为90%以上，吸弃培养基，用PBS洗两遍；

2、每孔加入MOI为0.001的MHV病毒 600ul，共9孔，其中3孔不加PQQ，3孔加PQQ至1uM，3孔加PQQ至10uM；

3、将六孔板置于37℃培养箱内培养2h，每30min摇晃一次孔板以确保MHV分布均匀，2h后吸弃MHV溶液，用PBS洗两遍，加入含有1.5%羧甲基纤维素（重量比，下同）和2%（体积比，下同）的FBS的MEM（1.5%CMC+2%FBS）

4、养箱培养三天，先准备好PBS，dd水，结晶紫染料，在外面试验台进行如下操作：

1）吸弃含有1.5%羧甲基纤维素和2%的FBS的MEM培养基，用PBS清洗2-3遍；

2）加入4%多聚甲醛，每孔400ul（12孔板，以确保空中央也能完全被覆盖）；

3）吸弃多聚甲醛，用dd水洗两遍，每遍2min；

用结晶紫染色，每孔400ul，15min；

5）用dd水冲洗直到吸弃时无明显颜色变化。

5、计数每孔噬斑数量

六孔板底部标记笔画九宫格，显微镜下计数噬斑

结果：

参见图1，MOI 0.001组三孔噬斑分别为54、48、41；MOI 0.001+1uM PQQ组三孔噬斑分别为35、32、39；MOI 0.001+10uM PQQ组三孔噬斑分别为23、、32、34。

实验结果显示，

与MOI 0.001组相比较，1μM 和10μM浓度的PQQ能够明显抑制鼠肝炎病毒对L929细胞对噬斑形成数量（p<0.05）

实验2：PQQ抑制MHV病毒感染引发的肺部炎症

材料与方法

MHV小鼠病毒性肺炎实验流程。

C57BL/B6小鼠经鼻腔滴注MHV-A59病毒引发病毒性肺炎，通过该模型在体检测PQQ抑制贝塔型冠状病毒引发小鼠病毒性肺炎的能力。

材料与方法

实验材料：戊巴比妥钠，多聚甲醛，肝素钠，灭菌好的EP管，dd水，PQQ。

MHV-A59病毒株购至苏州西山生物技术有限公司，PFU/毫升为1.4X10

六周龄小鼠分3组，每组8只

配药，配麻醉：麻醉剂：戊巴比妥钠用生理盐水溶解（或者PBS）配置成1%的溶液，按照小鼠体重，40mg/kg，腹腔注射麻醉。

配置PQQ水溶液（用灭菌双蒸水配置）

PQQ灌胃剂量为30毫克/公斤体重/天（mg/kg/d），即PQQ二钠盐34mg/kg/d 配置成6.8mg/ml，取27.2mg的PQQ二钠盐溶于3ml的水中，分装后于-20℃保存。

小鼠麻醉后空对照组经鼻给生理盐水，另两组经鼻给MHV,PFU=1.4×10

连续给药5天，最后一次给药后4小时，小鼠麻醉，解剖，取肺脏多聚甲醛固定保存用于HE切片染色。

实验结果

如图2所示，病毒性肺炎模型组小鼠肺脏色泽暗红，充血明显，模型+PQQ治疗组肺脏明显色泽变浅、充血减轻，更接近空白对照组。

如图3所示，肺组织病理切片图，模型组可见显著炎症细胞浸润渗出，空腔肺泡面积明显减少，模型+PQQ治疗组上述病变明显减轻，更接近空白对照组。

以上实验结果表明PQQ能显著抑制MHV病毒感染引发的肺部炎症。

实验3： PQQ对人体感冒发生频率的影响

感冒是一种常见的急性上呼吸道病毒性感染性疾病，多由鼻病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、腺病毒等引起。临床表现为鼻塞、喷嚏、流涕、发热、咳嗽、头痛等，多呈自限性。部分流感病毒感染早期也会表现为感冒样症状。大多散发，冬、春季节多发，季节交替时多发。

材料与方法

PQQ作为保健食品已经在美国/日本/欧盟上市，申请人征集了17人进行服用PQQ前后的对比实验，17人的年龄在24-81岁之间，男女比例7:10，所服用的是美国产的JarrouFormulas吡咯喹啉醌PQQ（20mg/粒），剂量为每天20-40毫克。

结果

经实验发现，17人在服用PQQ一年内与未服用PQQ前一年内出现感冒症状的均值有明显的差异，服用PQQ一年内出现感冒症状的次数明显下降。