独活提取物在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途

摘要

本发明实施例提供了独活提取物在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途，本申请的独活提取物中包含的二氢欧山芹醇当归酸酯或欧前胡素具有减小动脉粥样硬化小鼠体内斑块面积，降低血管狭窄程度，进而抑制高脂饮食的ApoE‑/‑小鼠体内斑块的发生发展等作用，可以预期本发明所得到的化合物或含有它的独活提取物、药物组合物可以用于治疗和/或预防动脉粥样硬化，进一步地，可以用于制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及独活提取物新用途技术领域，特别是涉及独活提取物在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途。

背景技术

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是引起心血管疾病的主要原因，其症状通常在心肌梗塞、脑卒中和外周动脉疾病等并发症发生后才被发现。研究表明，动脉粥样硬化是脂质代谢失衡和持续炎症反应的结果，多种基因和环境因素导致血管内皮下脂质沉积、泡沫细胞形成和免疫细胞浸润，并逐渐形成凸向血管腔的脂质斑块，最终引起官腔狭窄和堵塞。斑块破裂和血栓形成最终可引起急性临床心脑血管事件如心肌梗死和缺血性脑卒中，致死致残率极高。因此抑制AS斑块进展是预防和延缓AS并发症的重要途径。据报道目前，临床上用于治疗AS的药物主要有：(1)降血脂药：主要通过降低总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)来缓解病情，其代表药物为他汀类和胆汁酸结合树脂类；(2)抗氧化药：主要通过对抗血液中氧自由基及氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)以达到治疗动脉粥样硬化的目的，代表药物有普罗布考和维生素E；(3)多稀脂肪酸类：该类药物一方面是调节血脂，另一方面是通过抑制血小板聚集，扩张血管，改善微循环达到治疗的目的；(4)多糖类：该类药物能够保护血管内皮细胞，阻止血管平滑肌细胞转移和增殖。其中，他汀类药物如辛伐他汀、瑞舒伐他汀等均取得了重大的治疗学进步。然而，即使如此，他汀类药物在AS及其相关的血管并发症的治疗和预防中只实现了约三分之一的治愈率。此外，这一类药物长期服用还具有一定的副作用，例如容易引起肠胃道不适、肝功能异常、肌肉关节疼痛、罕见横纹肌溶解症等，有时还会影响睡眠。传统中草药用于预防、治疗、诊断疾病过程中以其独特的多成分，多靶点，副作用小等特点日益受到国内外的关注。因此，以中药为来源寻找有效、低毒、价格低廉的治疗AS的单体药物成为现在及未来的研究目标。

独活(Radix Angelicae Pubescentis)为伞形科(Umbelliferae)植物重齿毛当归(Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan)的干燥根，最早记录于《神农本草经》，被列为上品。其味辛、苦，性微温，归肾、膀胱经，具有通痹止痛等功效。药理学研究表明独活具有抗炎、镇痛及镇静的作用；同时，具有抑制血小板聚集的作用。然而其对冠状动脉硬化是否有治疗作用，目前仍没有报道。

发明内容

发明人在研究中意外地发现，独活提取物中的主要成分二氢欧山芹醇当归酸酯(Columbianadin,CBN,结构式如式I所示)或欧前胡素(Imperatorin,IMP,结构式如式II所示)能够减小动脉粥样硬化小鼠体内斑块面积，改善血管狭窄程度，抑制高脂饮食的ApoE-/-小鼠体内斑块的发生发展，进而发挥抗动脉粥样硬化作用。本发明基于上述发现得以完成。

本申请第一部分提供了独活提取物在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途。

本申请第二部分提供了二氢欧山芹醇当归酸酯在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途。

本申请第三方面提供了欧前胡素在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途。

本申请第四方面提供了一种药物组合物，其包含二氢欧山芹醇当归酸酯或欧前胡素中的至少一种。

本申请第五方面提供了本申请第四方面的药物组合物在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途。

经发明人研究表明，本申请的独活提取物中包含的二氢欧山芹醇当归酸酯或欧前胡素具有减小动脉粥样硬化小鼠体内斑块面积，改善血管狭窄程度，进而抑制高脂饮食的ApoE-/-小鼠体内斑块的发生发展等作用，可以预期本发明所得到的化合物或含有它的独活提取物、药物组合物可以用于治疗和/或预防动脉粥样硬化，进一步地，可以用于制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一种实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。

图1显示了二氢欧山芹醇当归酸酯处理的小鼠主动脉血管油红O染色结果。

图2显示了二氢欧山芹醇当归酸酯处理的小鼠心脏主动脉窦油红O染色结果。

图3显示了二氢欧山芹醇当归酸酯处理的小鼠心脏主动脉窦HE染色结果。

图4显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对小鼠脾脏内Foxp3表达情况的影响。

图5显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对小鼠血清内血脂水平的影响。

图6显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对小鼠血清内炎症因子表达量的影响。

图7A显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对小鼠脾脏内Foxp3,PI3K,AKT,mTOR mRNA表达的影响。

图7B显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对小鼠外周血中Foxp3,PI3K,AKT,mTOR mRNA表达的影响。

图7C显示了二氢欧山芹醇当归酸酯对小鼠主动脉内Foxp3,PI3K,AKT,mTOR mRNA表达的影响。

图8显示了欧前胡素处理的小鼠主动脉血管油红O染色结果。

图9显示了欧前胡素处理的小鼠心脏主动脉窦HE染色结果。

图10显示了欧前胡素处理的小鼠心脏主动脉窦油红O染色结果。

图11显示了欧前胡素对小鼠脾脏内Foxp3表达情况的影响。

图12显示了欧前胡素对小鼠血清内血脂水平的影响。

图13显示了欧前胡素对小鼠血清内炎症因子表达量的影响。

图14A显示了欧前胡素对小鼠脾脏内Foxp3,PI3K,AKT,mTOR mRNA表达的影响。

图14B显示了欧前胡素对小鼠外周血中Foxp3,PI3K,AKT,mTOR mRNA表达的影响。

图14C显示了欧前胡素对小鼠主动脉内Foxp3,PI3K,AKT,mTOR mRNA表达的影响。

图15显示了独活提取物处理的小鼠心脏主动脉窦HE染色结果。

图16显示了独活提取物处理的小鼠心脏主动脉窦油红O染色结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请中的实施例所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请第一方面提供了独活提取物在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途。

在本申请第一方面的一些实施方式中，所述独活提取物中包含二氢欧山芹醇当归酸酯或欧前胡素中的至少一种。

发明人在研究中发现，二氢欧山芹醇当归酸酯和欧前胡素均为独活提取物的主要成分，发明人通过研究发现，二氢欧山芹醇当归酸酯和欧前胡素均能够降低动脉上脂质含量，减少动脉粥样斑块的形成，从而能够用于制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物，因此含有二氢欧山芹醇当归酸酯和/或欧前胡素的独活提取物也相应地具有治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途。

本申请对独活提取物的制备方法不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，例如可以采用超声提取、微波提取、乙醇回流提取等方法获得。

本申请第二方面提供了二氢欧山芹醇当归酸酯在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途。

本申请第三方面提供了欧前胡素在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途。

本申请第四方面提供了一种药物组合物，其包含二氢欧山芹醇当归酸酯或欧前胡素中的至少一种。

在本申请第四方面的一些实施方式中，所述二氢欧山芹醇当归酸酯以单体形式提供或以独活提取物形式提供。

在本申请第四方面的一些实施方式中，所述欧前胡素以单体形式提供或以独活提取物形式提供。

在本申请第四方面的一些实施方式中，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在本申请第四方面的一些实施方式中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂选自溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和抗氧化剂中的至少一种。

本申请第五方面提供了本申请第四方面的药物组合物在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物中的用途。

如本文使用的，术语“治疗”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对已经罹患动脉粥样硬化进行处理，以期对所述疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本文使用的，术语“预防”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对可能罹患本发明所述的动脉粥样硬化或者对本发明所述动脉粥样硬化具有罹患风险的动物个体采用本发明的药物进行处理，以期对所述疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。

可采用制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本发明药物组合物的原料的有效成分，与一种或更多种药学可接受的载体混合，然后形成所需的剂型，来制备本发明的药物组合物。

如本文所用的，“药学上可接受的”表示当以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上。

本发明药物组合物中可用的“药学上可接受的载体”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的载体包括药学领域常规的溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂、和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。

如本文使用的，术语“药物组合物”具有其一般含义。此外，本发明所述的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本发明的药物组合物的原料的有效成分，任选地与一种或更多种药学可接受的载体混合，然后形成所需的剂型，来制备本发明的药物组合物。根据本发明的药物组合物，其为可以适用于口服给药、胃肠外给药或局部给药、外用给药的药物制剂。本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。具体地说，根据本发明的药物组合物，所述的药物剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射液、注射用粉剂、透皮贴剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂、口服溶液、口服混悬液、注射用乳剂、口服乳剂等、缓释片剂、控释片剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

用于口服施用的剂型可包括例如片剂、丸剂、硬或软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、散剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、小丸剂、酏剂等，并不限于此。除了活性成分外，这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时，其还可包含药用添加剂，例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。

用于肠道外施用的剂型可包括例如注射剂、药用滴剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、乳膏、喷雾剂、混悬剂、乳剂、栓剂、贴剂等，并不限于此。

根据本公开的药物组合物可口服或非肠道例如经直肠、经局部、经皮肤、经静脉内、经肌内、经腹膜内或经皮下施用。

如本文使用的，术语“个体”或者“动物个体”具有其一般含义，并且在本文中可以指罹患或可能罹患本发明所述动脉粥样硬化的个体或动物个体，还可以指为了某种目的例如为了科学研究目的而使用的个体或动物个体。具体地说，所述的个体例如是动物个体，特别是哺乳动物个体，例如人、猪、狗、猫、牛、羊、马、大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、猴等。更具体地说，本发明所述的个体是人。

活性成分二氢欧山芹醇当归酸酯或欧前胡素的药学可接受的剂量，即施用剂量，可以根据待治疗对象的年龄、性别和体重、待治疗的具体疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、施用途径和诊断者的判断而改变。考虑这些因素确定施用剂量在本领域技术人员的水平范围内。一般的剂量可以是0.01-1000mg/kg/日，具体地1-100mg/kg/日。然而，本公开的范围不以任何方式受限于所述施用剂量。

材料与方法

1.实验动物

选用6-8周龄SPF级雄性ApoE-/-小鼠(品系C57BL/6J)作为模型动物，选用同周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠作为对照动物，体质量21-30g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国医学科学院放射医学放射所(天津)SPF级动物房，每日光照12h，并于实验开始前1周适应饲养。所有动物实验均严格按照“实验动物护理和使用指南”进行，并经天津中医药大学动物伦理委员会(中国天津)批准实施。

2.动物饲料

ApoE-/-小鼠饲以21％脂肪和0.15％胆固醇“高脂饲料”，“高脂饲料”购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

3.主要仪器

体视镜：Axiocam ERc 5s

显微镜：Nikon，ECLIPSE E400

酶标仪：Manufacturer Perkin Elmer Singapore Pte.Ltd Singapore,EnSpireTM,230008880

恒温培养箱：上海爱朗仪器有限公司，SLI-700

石蜡包埋机：徕卡显微系统(上海)有限公司，HistoCore Arcadia H 220-240V

石蜡切片机：Leica Biosystems Nussich Gmbh Heideiberger Strasse 17-19D-69226Nussioch Germany,RM2235

冰冻切片机：徕卡显微系统(上海)有限公司，CM1900-1-1

低温离心机：Kendro Laboratory Pruducts

万分之一天平：瑞士Mettler Toledo公司，AX205

4.主要试剂

OCT包埋剂：SAKURA Tissue-Tek O.C.T.Compound 4583

瑞舒伐他汀：默沙东中国有限公司生产，混悬于0.5％羧甲基纤维素钠混悬剂中

雷帕霉素：默沙东中国有限公司生产，混悬于0.5％羧甲基纤维素钠混悬剂中

羧甲基纤维素钠：上海润捷化学试剂有限公司

生理盐水：衡水秉让医疗器械商贸有限公司

ELISA试剂盒：武汉爱博泰克生物科技有限公司(ABclonal Technology)

血脂检测试剂盒：南京建成生物工程研究所

油红O试剂盒：北京索莱宝科技有限公司

HE染色试剂盒：北京索莱宝科技有限公司

二氢欧山芹醇当归酸酯：成都德斯特科技有限公司，溶于0.5％羧甲基纤维素钠混悬剂中

欧前胡素：成都德斯特科技有限公司，溶于0.5％羧甲基纤维素钠混悬剂中

5.实验方法

5.1主动脉血管油红O染色

小鼠麻醉后，迅速开胸将胸腔主动脉部位取下，生理盐水冲洗，在解剖显微镜下小心去除主动脉周围的脂肪组织及其他组织，并将其纵向剪开，放入4％多聚甲醛中固定24小时。蒸馏水漂洗10s，60％异丙醇浸洗5min进行同步化。将同步化的血管放入预先配置好的油红O工作液(饱和油红O原液：双蒸水＝3:2，混匀，室温放置5-10min)浸染10min，60％异丙醇分化、水洗，直至斑块清晰呈鲜红色，其余部分呈白色后，双蒸水漂洗2次。取出主动脉，平铺于载玻片上，在体视镜下拍照保存。

5.2心脏主动脉窦油红O染色

小鼠麻醉后，分离心脏，OCT包埋并于冰冻切片机(-20℃)切片，自主动脉根部起横截面冰冻连续切片，于主动脉瓣初始处开始收集，每张厚度为9μm，每只鼠收集20张组织切片。蒸馏水充分洗涤切片1min后，60％异丙醇浸洗10s；油红O工作液染色5min；之后使用60％异丙醇分化至组织斑块清晰，自来水冲洗1min后Mayer苏木素复染1min；自来水冲洗8min；最后甘油明胶封片，室温晾干。40倍镜下观察内壁脂质浸润情况并拍照保存。

5.3心脏主动脉窦HE染色

分离小鼠心脏，放入4％多聚甲醛中固定，经脱水、透明、浸蜡等步骤后，行常规石蜡连续切片，苏木精-伊红(HE)染色。具体步骤如下：

①脱水、透明、浸蜡处理：流水冲洗4h；60％乙醇1h；80％乙醇1h；95％乙醇30min；二甲苯I10min；二甲苯II 10min；石蜡I1h；石蜡II 1h；石蜡III 1h；

②石蜡包埋经以上步骤处理过的组织；

③在石蜡切片机上进行切片，切片厚度为5μm；

④将切片脱蜡水化：二甲苯I10min；二甲苯II 10min；无水乙醇I 5min；无水乙醇II 5min；95％乙醇3min；75％乙醇3min；流水冲洗5min；

⑤常规HE染色：苏木素染色5min；流水冲洗5min；1％盐酸乙醇酸化4秒；流水冲洗10min；伊红染色2min；过水3秒；

⑥常规脱水透明，中性树胶封片：70％乙醇2min；80％乙醇2min；95％乙醇1min；100％乙醇I1min；二甲苯I1min；二甲苯II 2min；中性树胶封片。

40倍镜下观察动脉粥样硬化斑块病变面积并拍照保存，利用图像分析仪评估斑块面积，测量AS斑块横截面积(PA)、血管管腔横截面积(LA)，计算校正斑块面积(斑块面积/血管管腔面积，PA/LA)，以百分比(％)表示。

5.4脾脏免疫组化(IHC)染色

分离小鼠脾脏，放入4％多聚甲醛中固定，经脱水、透明、浸蜡等步骤后，行常规石蜡连续切片，免疫组化(IHC)染色。具体步骤如下：

①脱水、透明、浸蜡处理：流水冲洗4h；60％乙醇1h；80％乙醇1h；95％乙醇30min；二甲苯I10min；二甲苯II 10min；石蜡I1h；石蜡II 1h；石蜡III 1h；

②石蜡包埋经以上步骤处理过的组织；在石蜡切片机上进行切片，切片厚度为5μm；

③将切片脱蜡水化：二甲苯I10min；二甲苯II 10min；无水乙醇I 5min；无水乙醇II 5min；95％乙醇3min；75％乙醇3min；流水冲洗5min；

④3％H

⑤热修复：柠檬酸钠煮沸10min，自然冷却；EDTA修复，煮20分钟；用柠檬酸缓冲液，高压锅修复，喷气后5分钟；PBS洗3次，每次5min；

⑥封闭：5％BSA半小时；

⑦抗体孵育：Foxp3(eBioscience)以1：1000比例稀释后，4度冰箱孵育24h；平衡室温30-40min；PBS洗3次，每次10min；二抗Anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology,CST)以1：10000比例稀释后孵育半小时；PBS洗3次，每次5min；

⑧滴加SABC，孵育20min；PBS洗3次，每次5min；加DAB显色剂；苏木复染5min；冲水5min；盐酸酒精分化2-3秒；冲水10min；

⑨依次将放入75％酒精-95％酒精-100％酒精-100酒精-二甲苯I-二甲苯II,各5min；

⑩封片，400倍镜下观察。

5.5小鼠血脂水平测定

小鼠末次干预后，禁食不禁水12h。麻醉后，采用眼球摘除法，从眼眶静脉丛采集血液标本约1.5-2mL，置于离心管中，静置2h后，于4℃，3000r/min离心10min。离心后将血清保存于-80℃冰箱冻存备用。采用血脂试剂盒，根据说明书指导，检测血清内总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量。

5.6血清炎症因子检测

参照5.5方法收集血清，从-80℃冰箱取出，根据说明书指导，采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测血清中TNF-α,TGF-β,IFN-γ,MMP-2,MMP-9的含量，相应抗体包含于试剂盒中，按说明书进行操作。

5.7Real-time PCR

RT-PCR检测外周血、主动脉和脾脏内Foxp3,PI3K,AKT,mTOR mRNA表达情况，具体步骤如下：

①总RNA的提取

提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10*10

②RNA反转与定量

将溶解后的RNA置于冰上，取1.5ul测量并记录吸光度以及总RNA浓度(260/280正常值：1.8-2.0)参照逆转录试剂盒步骤翻转成cDNA，以GAPDH为内参，基于目标基因上下游引物，按照20μL反应体系进行45个循环的扩增，设置条件为，95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火30s。据2

5.8统计学分析

采用Graphpad Prism 5软件统计数据并进行分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法进行配对t检验，以P<0.05定为有统计学差异。

6、动物模型建立及分组

适应性饲养1周后，C57BL/6J野生型小鼠饲以普通饲料，作为对照组(n＝10)；ApoE-/-小鼠饲给以“高脂饲料”，连续喂养12周以建立AS模型。ApoE-/-小鼠随机分为三组，包括：模型组，阳性药物组和给药组，其中，模型组和阳性药物组每组12只，给药组根据实验需要可再次分组，具体分组情况见各实施例。

制备例1独活提取物的制备

称取独活饮片10kg，置圆底烧瓶中，分别用95％乙醇和60％乙醇加热回流提取，料液比为1:10，提取时间每次2小时，合并两次提取液，过滤。将提取液置于旋转蒸发仪中浓缩，减压干燥，得到独活提取物，称重计算提取物得率为14％。将得到的干燥独活提取物储存于干燥器中备用。

二氢欧山芹醇当归酸酯对AS的效果

实施例1二氢欧山芹醇当归酸酯对AS小鼠主动脉血管斑块及心脏主动脉窦内脂质的影响

给药方式：采用本申请的动物模型，进行灌胃给药，其中，给药组分为低剂量组(1mg/ml二氢欧山芹醇当归酸酯，给药量10ml/kg)、中剂量组(2mg/ml二氢欧山芹醇当归酸酯，给药量10ml/kg)和高剂量组(4mg/ml二氢欧山芹醇当归酸酯，给药量10ml/kg)，每组12只；阳性药物组给予0.4mg/ml瑞舒伐他汀，给药量10ml/kg；模型组和对照组以10ml/kg给药量给予0.5％羧甲基纤维素钠，每日灌胃给药一次，给药4周。四周后处死小鼠，采用上述实验方法取血以及相应组织，进行生物学实验。

主动脉斑块是动脉粥样硬化一个非常重要的评价指标，所以，在本研究中将小鼠主动脉血管进行油红染色来考察化合物对主动脉血管内斑块的影响。油红O能特异性的使组织和细胞内脂质以及脂蛋白等染色，主动脉油红O染色呈红色部位说明动脉粥样硬化斑块。参见5.1的方法对小鼠主动脉血管进行油红O染色，结果如图1所示。由图1可知，各组中，小鼠主动脉血管油红O染色都显示出红色脂质(图1中箭头所示)，然而肉眼可见的是模型组中，脂质的量明显增多，而各药物组的脂质明显比模型组少。

参见5.2的方法进行小鼠心脏主动脉窦油红O染色，结果如图2所示，其中，A图为各组小鼠主动脉窦油红O染色结果，B图为采用ImageJ软件对A图中的斑块部位进行定量分析，检测AS斑块内脂质含量。结果显示与模型组相比，阳性药物组及给药组的脂质含量(粥样斑块面积)明显减少(n＝6，***P<0.001)。说明本申请的二氢欧山芹醇当归酸酯能够明显减少动脉中的粥样斑块的产生。

实施例2二氢欧山芹醇当归酸酯对AS小鼠心脏主动脉窦内斑块的影响

采用与实施例1相同的给药方式。

ApoE-/-小鼠在喂养高脂饲料后会产生明显的主动脉粥样硬化病变症状。为进一步验证二氢欧山芹醇当归酸酯处理对AS模型小鼠的保护作用，采用5.3的方法，对小鼠心脏主动脉窦进行HE染色及定量分析，观察小鼠主动脉窦内斑块的病理变化，结果如图3所示。

图3的A图为各组小鼠心脏主动脉窦HE染色结果，B图为A图的定量结果。从图A中可以看出，对照组小鼠主动脉形态正常，镜下观察可见内膜完整，连续性好，中膜边缘清晰，平滑肌细胞排列整齐，管腔内无赘生物，说明无粥样硬化斑块形成。然而，模型组小鼠主动脉可见内膜明显增生，AS斑块病变向官腔内突起，平滑肌细胞增生，纤维帽厚度较薄，其下可见大量梭形胆固醇结晶，肌纤维分离断裂，可见由泡沫细胞组成的脂质条纹及无结构样坏死物，即为粥样硬化病变斑块，再次确定小鼠动脉粥样硬化模型建立成功。与模型组小鼠相比，给药组小鼠AS病变得到不同程度的控制，官腔内粥样斑块病变面积明显减少。在小鼠主动脉根部AS斑块面积百分比统计中，模型组较对照组有明显的粥样斑块形成，然而不同剂量的二氢欧山芹醇当归酸酯可有效的抑制AS斑块的形成，且呈剂量依赖性，差异具有统计学意义(n＝6，*P<0.05，***P<0.001，与模型组相比)；实验结果证实二氢欧山芹醇当归酸酯各给药组对AS斑块形态学的抑制效果呈剂量依赖性。

实施例3二氢欧山芹醇当归酸酯对AS小鼠脾脏内Foxp3表达情况的影响

近年来AS属于慢性免疫性炎症性疾病已被很多研究证实，研究显示CD4

采用与实施例1相同的给药方式，不同的是，阳性药物组给予0.03mg/ml雷帕霉素，给药量10ml/kg。

采用5.4的方法，对小鼠脾脏进行免疫组化染色，结果见图4的A图，图中箭头指示Foxp3阳性细胞，图4的B图为A图中Foxp3阳性细胞数量的定量结果，即每样本400倍镜下均匀选取10个视野进行计数。从图4的A图中可以看出，与对照组比较，模型组ApoE-/-小鼠脾脏内Foxp3阳性细胞几乎不可见；从B图的定量结果中可以看出，与模型组比较，各给药组脾脏内Foxp3阳性细胞数量明显增加(n＝6，*P<0.01，**P<0.01)。经比较发现，随着二氢欧山芹醇当归酸酯药物剂量的增加，脾脏内Foxp3表达也相应增加，且呈现剂量依赖性(n＝6,**P<0.01,*P<0.05)。

实施例4二氢欧山芹醇当归酸酯对AS小鼠血清内血脂水平的影响

高脂血症与AS的发生密切相关，不仅可以直接引起AS血管内膜损伤，还可以改变血管内皮细胞通透性，导致粥样斑块形成。高脂血症具体表现为血液中TC,TG,LDL-C中一种或多种水平高于正常范围，HDL-C低于正常范围。因此，在复制小鼠AS模型后检测血脂水平作为检测模型成功与否以及观察二氢欧山芹醇当归酸酯对AS作用的评价指标。

本实施例采用与实施例1相同的给药方式，并采用5.5的方法，检测小鼠血脂水平，结果如图5所示。其中，A图显示了小鼠血清中总胆固醇(TC)水平，B图显示了小鼠血清中甘油三酯(TG)水平，C图显示了小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，D图显示了小鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平；从A图中可以看出，模型组小鼠血清TC的水平显著高于对照组小鼠(***P<0.001，n＝5)，表现为明显的高胆固醇血脂；而二氢欧山芹醇当归酸酯干预后小鼠血清TC含量显著下降，且差异具有统计学意义(**P<0.01，n＝5)。从B图中可以看出，与对照组相比，模型组小鼠血清TG的含量显著上升，二氢欧山芹醇当归酸酯干预后，小鼠血清TG的含量相比于模型组明显降低(**P<0.01，***P<0.001，n＝5)；同时C图显示了模型组小鼠血清LDL-C的水平显著高于对照组小鼠，二氢欧山芹醇当归酸酯干预后各组LDL-C的水平显著下降，且呈剂量依赖性抑制(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝5)。此外，根据D图可以看出，与对照组小鼠相比，模型组小鼠血清HDL-C的水平显著下降(*P<0.05，n＝5)。这些结果表明，二氢欧山芹醇当归酸酯能不同程度的降低高脂饮食的ApoE-/-小鼠血清中各种类型的胆固醇的聚积，且从结果中还可以看出，二氢欧山芹醇当归酸酯降低血脂中胆固醇的作用具有剂量依赖性。

实施例5二氢欧山芹醇当归酸酯对AS小鼠血清内炎症因子的影响

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，临床研究发现斑块内炎症是引起斑块易损的关键因素，斑块破裂几乎总是与炎症共存，因此炎症因子的表达对于评价动脉粥样硬化情况至关重要。发明人在研究中发现，AS发生过程中往往伴随着促炎因子TNF-α,MMP-2,MMP-9的高表达和/或抗炎因子TGF-β的表达下降。

本实施例采用与实施例1相同的给药方式，与实施例1不同的是，阳性药物组分为瑞舒伐他汀组和雷帕霉素组，其中，瑞舒伐他汀组给予4mg/kg瑞舒伐他汀，雷帕霉素组给予0.3mg/kg雷帕霉素，每组6只；采用5.6的ELISA检测法，检测各组小鼠血清中炎症因子变化趋势，结果如图6所示，其中，A图为TGF-β的表达量变化情况，B图为TNF-α的表达量变化情况，C图为MMP-2的表达量变化情况，D图为MMP-9的表达量变化情况。

从A图中可以看出，对照组小鼠血清中的TGF-β含量为49055.2pg mL

从B图中可以看出，对照组小鼠血清中的TNF-α含量为185.301pg mL

从C图中可以看出，对照组小鼠血清中的MMP-2含量为47.1398pg mL

从D图中可以看出，对照组鼠血清中的MMP-9含量为89861.9pg mL

通过以上实验可知，二氢欧山芹醇当归酸酯在不同剂量时能够上调抗炎因子TGF-β表达，以及下调促炎症因子TNF-α，MMP-2及MMP-9的表达，从而改善AS的免疫炎症微环境，因此表明，二氢欧山芹醇当归酸酯能够通过调整炎症因子的表达，达到改善或治疗AS的目的。

实施例6二氢欧山芹醇当归酸酯对AS小鼠外周血、主动脉和脾脏内Foxp3,PI3K,AKT,mTOR mRNA表达的影响

研究证明：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)通路是一条十分确切的Treg细胞分化的内源性抑制通路，在调控TGF-β诱导Treg细胞外周分化方面发挥关键性作用。研究显示AS患者体内PI3K/Akt/mTOR信号通路可被生长因子(IGF-1、VEGF等)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、炎症反应等因素激活。由此可见，由于AS特殊的免疫微环境，导致该通路活性增强，Treg细胞外周分化减少，进而其分泌的TGF-β减少；而TGF-β含量降低，反过来又会作用于Treg细胞外周分化，最终形成恶性循环，造成Treg细胞数量进行性下降。因此，选择合适药物抑制PI3K/Akt/mTOR通路，促进AS体内患者Treg外周细胞分化，增加Treg细胞数量，恢复CD4

本实施例采用与实施例1相同的分组和给药方式，采用5.7的方法，采用实时荧光定量技术检测ApoE-/-小鼠外周血、主动脉和脾脏内PI3K、AKT、mTOR以及Foxp3的mRNA的表达情况，可有效反应二氢欧山芹醇当归酸酯对ApoE-/-小鼠体内PI3K/Akt/mTOR通路的调节作用，结果如图7A、图7B和图7C所示，其中图7A为小鼠脾脏内Foxp3,PI3K,AKT,mTOR mRNA表达情况；图7B为小鼠外周血中Foxp3,PI3K,AKT,mTOR mRNA表达情况；图7C为小鼠主动脉内Foxp3,PI3K,AKT,mTOR mRNA表达情况。

从图7A、图7B和图7C中可以看出，二氢欧山芹醇当归酸酯能够有效抑制AS小鼠主动脉和脾脏中PI3K和AKT的mRNA表达(与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01，n＝6)；且在外周血、主动脉和脾脏中均能够有效抑制mTOR mRNA的表达(与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01，n＝6)；此外，二氢欧山芹醇当归酸酯可有效增加给药组小鼠外周血、主动脉和脾脏内Foxp3mRNA的表达(与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，n＝6)，说明二氢欧山芹醇当归酸酯能够有效抑制PI3K/Akt/mTOR通路，促进Foxp3表达，进而能够促进AS体内患者Treg外周细胞分化，增加Treg细胞数量，恢复CD4

通过以上结果可以看出，二氢欧山芹醇当归酸酯能够有效抑制PI3K/Akt/mTOR通路，促进Foxp3的mRNA的表达，还具有降低血脂含量和调节炎症因子表达等作用，因此能够降低动脉上脂质含量，减小动脉粥样斑块面积，且效果与临床治疗动脉粥样硬化阳性药物-他汀类大致相同，因此本申请的二氢欧山芹醇当归酸酯能够用于治疗和/或预防动脉粥样硬化，进而能够用于制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物。

欧前胡素对AS的效果

实施例7欧前胡素对AS小鼠主动脉血管斑块面积的影响

给药方式：采用本申请的动物模型，进行灌胃给药，其中，给药组分为低剂量组(1mg/ml欧前胡素，给药量10ml/kg)、中剂量组(2mg/ml欧前胡素，给药量10ml/kg)和高剂量组(4mg/ml欧前胡素，给药量10ml/kg)；阳性药物组给予0.4mg/ml瑞舒伐他汀，给药量10ml/kg；模型组和对照组以10ml/kg给药量给予0.5％羧甲基纤维素钠，每日灌胃给药一次，给药4周。四周后处死小鼠，采用上述实验方法取血以及相应组织，进行生物学实验。

参见5.1的方法对小鼠主动脉血管进行油红O染色，结果如图8所示。从图8中可以看出，对照组小鼠胸腔主动脉整个内壁均无红色染色，提示无病变斑块。模型组小鼠血管内壁可见大面积连续红色的病变斑块(图中箭头所示)，说明通过12周高脂饮食饲养，ApoE-/-小鼠成功复制了AS模型。欧前胡素处理的给药组小鼠主动脉血管内壁同样可见硬化粥样病变斑块，但斑块呈现不连续散在分布，与模型组小鼠相比，斑块面积明显减少(图中箭头所示)。

实施例8欧前胡素对AS小鼠心脏主动脉窦内斑块的影响

采用与实施例7相同的给药方式，并采用5.3的方法，对小鼠主动脉窦进行HE染色及定量分析，观察小鼠主动脉的病理变化，结果如图9所示。

图9的A图为各组小鼠主动脉HE染色结果，B图为A图的定量结果。从图A中可以看出，对照组小鼠主动脉形态正常，镜下观察可见内膜完整，连续性好，中膜边缘清晰，平滑肌细胞排列整齐，管腔内无赘生物，说明无粥样硬化斑块形成。然而，模型组小鼠主动脉可见内膜明显增生，AS斑块病变向官腔内突起，平滑肌细胞增生，纤维帽厚度较薄，其下可见大量梭形胆固醇结晶，肌纤维分离断裂，可见由泡沫细胞组成的脂质条纹及无结构样坏死物，即为粥样硬化病变斑块，再次确定小鼠动脉粥样硬化模型建立成功。与模型组小鼠相比，各给药组小鼠AS病变得到不同程度的控制，官腔内粥样斑块病变面积明显减少。图B显示了小鼠心脏主动脉窦内AS斑块面积百分比统计结果，模型组有明显的粥样斑块形成，然而阳性药物与不同剂量的IMP可有效的抑制AS斑块的形成，差异具有统计学意义(**P<0.01，***P<0.001，n＝6，与模型组相比)；实验结果证实欧前胡素各给药组对AS形态学的抑制效果。

实施例9欧前胡素对AS小鼠心脏主动脉窦内脂质的影响

采用与实施例7相同的给药方式，并采用5.2的方法对心脏主动脉窦进行油红O染色，结果如图10所示，其中，A图为小鼠心脏主动脉窦油红O染色结果，箭头指示为红色染色斑块，B图为采用ImageJ软件对斑块部位进行测量分析，以检测AS斑块内脂质含量。

从图10的A图中可以看出，对照组小鼠主动脉形态正常，血管内壁无红色染色斑块；模型组小鼠可见血管内膜增厚，血管内壁可见大量油红O染色的红色斑块，这也从另一方面提示我们AS模型复制成功。IMP给药组小鼠血管内壁同样可见红色脂质浸润，但其红色染色的粥样斑块面积与模型组相比明显减少。B图为采用ImageJ软件对A图中的斑块部位进行定量分析，检测AS斑块内脂质含量。结果显示与模型组相比，阳性药物组及给药组的脂质含量(粥样斑块面积)明显减少(n＝6，***P<0.001)。说明本申请的欧前胡素能够明显减少动脉中粥样斑块内脂质的产生。

实施例10欧前胡素对AS小鼠脾脏内Foxp3表达情况的影响

采用与实施例7相同的给药方式，不同的是，阳性药物组给予0.4mg/kg雷帕霉素。采用5.4的方法，对小鼠脾脏进行免疫组化染色，结果见图11的A图，图11的B图为A图中Foxp3阳性细胞数量的定量结果，即每样本在400倍镜下均匀选取10个视野进行计数。

从A图中可以看出，对照组比较，模型组ApoE-/-小鼠脾脏内Foxp3阳性细胞几乎不可见；而与模型组比较，给予雷帕霉素的阳性药物组小鼠以及不同欧前胡素给药剂量的给药组小鼠中，脾脏内Foxp3表达增加(Foxp3阳性细胞见A图中箭头所示)。从B图的定量结果也可看出，欧前胡素中剂量组ApoE-/-小鼠脾脏内Foxp3表达显著增加，具有统计学差异(**P<0.01，n＝6)，由此说明，欧前胡素能够提高AS模型鼠中Foxp3的表达，进而具有调节性T细胞数量和控制炎症的作用，进而起到治疗AS的作用。

实施例11欧前胡素对AS小鼠血清内血脂水平的影响

本实施例采用与实施例7相同的给药方式，并采用5.5的方法，检测小鼠血脂水平，结果如图12所示，其中，A图显示了小鼠血清中总胆固醇(TC)水平，B图显示了小鼠血清中甘油三酯(TG)水平，C图显示了小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，D图显示了小鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平；从A图中可以看出，模型组小鼠血清TC的水平显著高于对照组小鼠(***P<0.001，n＝5)，表现为明显的高胆固醇血脂；而IMP干预后小鼠血清TC含量显著下降，且差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01,n＝5)。与对照组相比，模型组小鼠血清TG和LDL-C的含量均显著上升，然而IMP干预后，高剂量组能有效的降低小鼠血清TG的含量(**P<0.01,n＝5)；低剂量组LDL-C的水平显著下降(*P<0.05，n＝5)。此外，从D图中还可以看出，与对照组小鼠相比，模型组小鼠血清HDL-C的水平显著下降(*P<0.05，n＝5)，然而低剂量IMP干预后，小鼠血清HDL-C的水平明显升高(*P<0.05，n＝5)。这些结果表明IMP能不同程度的降低高脂饮食的ApoE-/-小鼠血清中胆固醇的聚积。

实施例12欧前胡素对AS小鼠血清内炎症因子的影响

本实施例采用与实施例7相同的给药方式，采用5.6的ELISA检测法，检测各组小鼠血清中炎症因子变化趋势，结果如图13所示，其中，A图为TNF-α的表达量变化情况，B图为TGF-β的表达量变化情况，C图为MMP-2的表达量变化情况，D图为MMP-9的表达量变化情况，E图为IFN-γ的表达量变化情况。

从结果中可以看出，模型组与对照组比较，TNF-α、MMP-2、MMP-9以及IFN-γ的含量明显升高，而抗炎因子TGF-β的含量明显降低，差异有统计学意义(**P<0.01，***P<0.001，n＝5)，这也说明在动脉粥样硬化发生的过程中确实伴有炎症反应的增加；而IMP给药后的各给药组组与模型组相比，TNF-α、MMP-2、MMP-9以及IFN-γ的含量均有程度的降低(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)，抗炎因子TGF-β的表达则增加(**P<0.01,***P<0.001，n＝5)，这说明IMP在高脂饮食的ApoE-/-小鼠中具有良好的抗炎作用。

实施例13欧前胡素对ApoE-/-小鼠外周血、主动脉和脾脏内Foxp3,PI3K,AKT,mTORmRNA表达的影响

采用与实施例7相同的给药方式，按照5.7的方法，采用实时荧光定量技术检测ApoE-/-小鼠脾脏、外周血、主动脉中PI3K、AKT、mTOR以及Foxp3的mRNA的表达情况，结果如图14A、14B和14C所示。

从图14A可以看出，欧前胡素处理的给药组能够有效抑制AS小鼠脾脏中PI3K、AKT和mTOR的mRNA表达(与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01，n＝5)；此外，欧前胡素可有效增加AS脾脏内Foxp3 mRNA的表达(**P<0.01，n＝5)；从图14B和图14C中可见，外周血和主动脉中呈现出相似的规律。

可见，欧前胡素能够抑制PI3K/Akt/mTOR通路，最终起到缩小和稳定AS斑块的作用。

通过以上结果可以看出，欧前胡素能够有效抑制PI3K/Akt/mTOR通路，促进Foxp3的mRNA的表达，还具有降低血脂含量和调节炎症因子表达等作用，因此能够降低动脉上脂质含量，减小动脉粥样斑块的形成，且效果与临床治疗动脉粥样硬化阳性药物-他汀类大致相同，因此本申请的欧前胡素能够用于治疗和/或预防动脉粥样硬化，进而能够用于制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物。

独活提取物对AS的效果

实施例14独活提取物对AS小鼠心脏主动脉窦内斑块的影响

给药方式：采用制备例1的独活提取物，溶于0.5％羧甲基纤维素钠混悬剂中，配置成浓度为21mg/mL的独活提取物灌胃用药。

采用本申请的动物模型，以10ml/kg给药量进行灌胃给药，阳性药物组给予4mg/kg瑞舒伐他汀，模型组和对照组以10ml/kg给药量给予0.5％羧甲基纤维素钠，每日灌胃给药一次，给药4周。四周后处死小鼠，采用上述实验方法取血以及相应组织，进行生物学实验。

采用5.3的方法，对小鼠主动脉窦进行HE染色及定量分析，观察小鼠主动脉的病理变化，结果如图15所示。

图15的A图为各组小鼠主动脉HE染色结果，B图为A图的定量结果。从图A中可以看出，对照组小鼠主动脉形态正常，管腔内无赘生物，无粥样硬化斑块形成。然而，模型组小鼠主动脉可见内膜明显增生，AS斑块病变向官腔内突起，其下可见大量梭形胆固醇结晶以及由泡沫细胞组成的脂质条纹及无结构样坏死物，即为粥样硬化病变斑块，再次确定小鼠动脉粥样硬化模型建立成功。与模型组小鼠相比，给药组(图15中标注为独活提取物组)小鼠AS病变程度得到控制，官腔内粥样斑块病变面积明显减少。图B显示了小鼠心脏主动脉窦内AS斑块面积百分比统计结果，模型组有明显的粥样斑块形成，然而阳性药物与独活提取物组可有效的抑制AS斑块的形成，差异具有统计学意义(***P<0.001，n＝6)；实验结果证实独活提取物组对AS形态学的抑制效果。

实施例15独活提取物对AS小鼠心脏主动脉窦内脂质的影响

采用与实施例14相同的给药方式，并采用5.2的方法对心脏主动脉窦进行油红O染色，结果如图16所示，其中，A图为小鼠心脏主动脉窦油红O染色结果，B图为采用ImageJ软件对斑块部位进行测量分析，以检测AS斑块内脂质含量。

从图16的A图中可以看出，对照组小鼠主动脉形态正常，血管内壁无红色染色斑块；模型组小鼠可见血管内膜增厚，血管内壁可见大量油红O染色的红色斑块，这也从另一方面提示我们AS模型复制成功。独活提取物组小鼠血管内壁同样可见红色脂质浸润，但其红色染色的粥样斑块面积与模型组相比明显减少。B图为采用ImageJ软件对A图中的斑块部位进行定量分析，检测AS斑块内脂质含量。结果显示与模型组相比，阳性药物组及给药组的脂质含量(粥样斑块面积)明显减少(n＝6，***P<0.001)。说明本申请的独活提取物能够明显减少动脉中粥样斑块内脂质的产生。

以上实施例的结果说明，本申请的二氢欧山芹醇当归酸酯、欧前胡素以及含有二氢欧山芹醇当归酸酯或欧前胡素中至少一种的独活提取物具有降低血脂含量、调节炎症因子表达等作用，从而能够降低动脉上脂质含量，减小动脉粥样斑块的形成，能够用于治疗和/或预防动脉粥样硬化，进而能够用于制备治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。