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结合犬PD-L1的PD-L1抗体

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本发明涉及结合犬PD‑L1的PD‑L1抗体。具体地，本公开内容记载了包括具有特定特性的针对犬PD‑L1的犬源化抗体的抗体。本文件涉及结合这些抗体的犬PD‑L1的表位，以及结合这些表位的抗‑犬PD‑L1抗体，以及犬源化抗‑犬PD‑LI抗体在治疗狗的癌症中的用途。

著录项

公开/公告号CN112851816A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-05-28

原文格式PDF
申请/专利权人英特维特国际股份有限公司;
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申请/专利号CN202110355046.5
发明设计人 M.莫塞伊;张远征;D.巴特斯-莫罗佐夫;J.埃斯金;I.塔佩伊;
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申请日2015-09-29
分类号C07K16/28(20060101);C12N15/13(20060101);A61K39/395(20060101);A61P35/00(20060101);
代理机构72001 中国专利代理(香港)有限公司;
代理人李波;林毅斌
地址荷兰博克斯梅尔
入库时间 2023-06-19 11:09:54

说明书

本申请是申请日为2015年9月29日的中国专利申请 201580052709.9“ 结合犬PD-L1的PD-L1抗体”的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年9月30日提交的美国临时申请序列号62/057,541和于2015年6月8日提交的美国临时申请序列号62/172,511的权益，所述申请两者的内容以其整体通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及具有特定特性的抗-犬PD-L1抗体。本发明也涉及针对犬PD-L1的犬源化（caninized）抗体，其具有特定序列并对犬PD-L1具有高结合亲和力。本发明还涉及结合这些抗体的犬PD-L1的表位，以及结合这些表位的抗-犬PD-L1抗体。本发明还涉及本发明的抗体在治疗狗(包括癌症治疗)中的用途。

背景技术

主要在活化的T和B细胞上表达的免疫抑制性受体(程序性细胞死亡受体1，也被称为程序性死亡受体(PD-1))是与CD28和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)相关的免疫球蛋白超家族的一个成员。PD-1和类似家族成员是含有胞外Ig可变型(V-型)结构域(其结合其配体)和胞质尾区(其结合信号传导分子)的I型跨膜糖蛋白。PD-1的胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号传导基序：ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)和ITSM(基于免疫受体酪氨酸的转换基序)。

PD-1当结合程序性细胞死亡配体1(也被称为程序性死亡配体1(PD-L1))和/或程序性细胞死亡配体2(也被称为程序性死亡配体2(PD-L2))时减弱T-细胞应答。这些配体中的任一种与PD-1的结合负调节抗原受体信号传导。阻断PD-L1与PD-1的结合增强肿瘤特异性的CD8

PD-L1和PD-L2是含有胞外区域中的IgV-和IgC-样结构域以及不具有已知信号传导基序的短细胞质区域的I型跨膜配体。PD-L1和PD-L2两者组成型表达，或者可以在多种细胞类型(包括非造血组织以及各种肿瘤类型)中诱导。PD-L1不仅在B、T、髓样和树突细胞(DC)上表达，而且在周围细胞(诸如微血管内皮细胞和非淋巴器官例如心脏或肺)上表达。相对照而言，PD-L2仅存在于巨噬细胞和DC上。PD-1配体的表达模式提示，PD-1在维持外周耐受中起作用，并且还可以用于调节外周中的自身反应性T-和B-细胞应答。

在任何情况下，现在非常清楚的是，PD-1和PD-L1在至少某些人癌症中起关键作用，据推测通过介导免疫逃避。因此，PD-L1已经被显示在许多小鼠和人肿瘤上表达，且在大多数PD-L1阴性的肿瘤细胞系中可被IFN-γ诱导[Iwai 等人,

此外，Nomi 等人[

在其它研究中，用PD-L1转染鼠肥大细胞瘤系导致当与肿瘤特异性CTL克隆共培养时减少的肿瘤细胞裂解。当加入抗-PD-L1单克隆抗体时，裂解被恢复[Iwai 等人,

抗-PD-L1抗体还可用于慢性病毒感染中。在急性病毒感染后产生的记忆CD8

犬抗体(也称为免疫球蛋白G或IgG)是约150 Kd的大四聚体蛋白。每个IgG蛋白由两条相同的、各约25 Kd的轻链和两条相同的、各约50 Kd的重链构成。存在犬IgG的四个已知的IgG重链亚类，且其被称为IgGA、IgGB、IgGC和IgGD。存在两种类型的轻链：

用酶木瓜蛋白酶消化IgG抗体使抗体分子在铰链区断裂且导致形成三个片段。这些片段中的两个是相同的并且各自由与重链的VH和CH1结构域保持在一起的轻链组成。这些片段被称为“Fab”片段，并且其含有抗体的抗原结合部位。用木瓜蛋白酶消化所得的第三个片段被称为“Fc”，并且其含有通过二硫键保持在一起的两条重链的剩余部分。Fc因此含有由两条重链各自的CH2和CH3结构域组成的二聚体。尽管Fab使得抗体能够结合其相关表位，但Fc使得抗体能够介导免疫效应子功能诸如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、依赖抗体的吞噬作用(ADCP)和依赖补体的细胞毒性(CDC)。

本领域众所周知的是，IgG抗体通过使其Fc部分结合被称为Fc

依赖于针对治疗目的的单克隆抗体使用的方法需要设计符合目的的抗体或抗体片段以实现所需的治疗响应。例如，一些癌症治疗方法需要治疗用抗体具有增强的效应子功能，而其它需要显著减少或完全消除效应子功能。效应子功能的增强或消除可以通过如下实现：在抗体的Fc部分引入一个或多个氨基酸突变(取代)，从而增强或减少对Fc

本文中的任何参考文献的引用不应解释为承认此参考文献可作为本申请的“现有技术”得到。

发明内容

本发明提供了特异性结合犬程序性死亡配体1(犬PD-L1)的抗体及其抗原结合片段(包括分离的抗体和其分离的抗原结合片段)。在具体实施方案中，所述抗体及其片段是哺乳动物抗体。在更具体实施方案中，所述哺乳动物抗体是鼠(即小鼠)抗体。在本发明的一个相关方面，所述分离的抗体是犬源化抗体。在具体实施方案中，所述犬源化抗体是犬源化哺乳动物(例如小鼠)抗-犬PD-L1抗体。本发明的抗体及其抗原结合片段结合犬PD-L1，并且可以阻断犬PD-L1与犬程序性死亡受体1(PD-1)的结合。本发明还提供了此类抗体或其抗原结合片段在治疗疾病(例如治疗犬的癌症)中的用途。

在具体实施方案中，特异性结合犬PD-L1的抗体或其抗原结合片段包含三个轻链互补决定区(CDR)：CDR轻1(CDRL1)、CDR轻2(CDRL2)和CDR轻3(CDRL3)；和三个重链CDR：CDR重1(CDRH1)、CDR重2(CDRH2)和CDR重3(CDRH3)。

在某些实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在其它实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:13的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRH1包含SEQ IDNO:13的变体(例如，功能保守的变体)，其包含1规范结构类。在还有其它实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在还有其它实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:19的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRH1包含SEQ ID NO:19的变体(例如，功能保守的变体)，其包含1规范结构类。

在某些实施方案中，CDRH2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在其它实施方案中，CDRH2包含SEQ ID NO:14的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRH2包含SEQ IDNO:14的变体(例如，功能保守的变体)，其包含3B规范结构类。在还有其它实施方案中，CDRH2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在还有其它实施方案中，CDRH2包含SEQ ID NO:20的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRH2包含SEQ ID NO:20的变体(例如，功能保守的变体)，其包含3B规范结构类。

在某些实施方案中，CDRH3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在其它实施方案中，CDRH3包含SEQ ID NO:15的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRH3包含SEQ IDNO:15的变体(例如，功能保守的变体)，其包含10规范结构类。在还有其它实施方案中，CDRH3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在还有其它实施方案中，CDRH3包含SEQ ID NO:21的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRH3包含SEQ ID NO:21的变体(例如，功能保守的变体)，其包含8规范结构类。

在某些实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在其它实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:16的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRL1包含SEQ IDNO:16的变体(例如，功能保守的变体)，其包含2规范结构类。在还有其它实施方案中，CDRL1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:22。在还有其它实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:22的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRL1包含SEQ ID NO:22的变体(例如，功能保守的变体)，其包含3规范结构类。

在某些实施方案中，CDRL2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在其它实施方案中，CDRL2包含SEQ ID NO:17的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRL2包含SEQ IDNO:17的变体(例如，功能保守的变体)，其包含1规范结构类。在还有其它实施方案中，CDRL2包含SEQ ID NO:23。在还有其它实施方案中，CDRL2包含SEQ ID NO:23的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRL2包含SEQ ID NO:23的变体(例如，功能保守的变体)，其包含1规范结构类。

在某些实施方案中，CDRL3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在其它实施方案中，CDRL3包含SEQ ID NO:18的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRL3包含SEQ IDNO:18的变体(例如，功能保守的变体)，其包含1规范结构类。在还有其它实施方案中，CDRL3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在还有其它实施方案中，CDRL3包含SEQ ID NO:24的保守修饰的变体。在还有其它实施方案中，CDRL3包含SEQ ID NO:24的变体(例如，功能保守的变体)，其包含1规范结构类。

本发明还提供了给定抗体中的本发明的CDR(或其变体)中的两个或更多个(例如，包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDRH3和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的氨基酸序列)的组合。

在具体实施方案中，结合犬PD-L1的抗体及其抗原结合片段包含CDRH1，其包含SEQID NO:13、SEQ ID NO:13的保守修饰的变体或SEQ ID NO: 13的包含1规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)的氨基酸序列；CDRH2，其包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:14的保守修饰的变体或SEQ ID NO: 14的包含3B规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)的氨基酸序列；CDRH3，其包含SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:15的保守修饰的变体，或SEQ ID NO: 15的包含10规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)；CDRL1，其包含SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:16的保守修饰的变体或SEQ ID NO: 16的包含2规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)的氨基酸序列；CDRL2，其包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:17的保守修饰的变体或SEQ IDNO: 17的包含1规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)的氨基酸序列；和CDRL3，其包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:18的保守修饰的变体或SEQ ID NO: 18的包含1规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)的氨基酸序列。

在相关实施方案中，结合犬PD-L1的抗体及其抗原结合片段包含CDRH1，其包含SEQID NO:19、SEQ ID NO:19的保守修饰的变体或SEQ ID NO:19的包含1规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)的氨基酸序列；CDRH2，其包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:20的保守修饰的变体或SEQ ID NO: 20的包含3B规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)的氨基酸序列；CDRH3，其包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:21的保守修饰的变体或SEQ ID NO: 21的包含8规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)；CDRL1，其包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:22的保守修饰的变体或SEQ ID NO: 22的包含3规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)的氨基酸序列；CDRL2，其包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:23的保守修饰的变体或SEQ IDNO: 23的包含1规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)的氨基酸序列；和CDRL3，其包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:24的保守修饰的变体或SEQ ID NO: 24的包含1规范结构类的变体(例如，功能保守的变体)的氨基酸序列。

因此，在本发明的一个具体方面，本发明还提供了犬源化抗-犬PD-L1抗体。在某些实施方案中，所述犬源化抗-犬PD-L1抗体是犬源化哺乳动物(例如，鼠)抗-犬PD-L1抗体。在具体实施方案中，所述犬源化抗-犬PD-L1抗体(例如，犬源化哺乳动物抗-犬PD-L1抗体，诸如犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体)包含其已经被遗传修饰以增强、降低或消除一种或多种效应子功能的cFc。在这种类型的具体实施方案中，遗传修饰的cFc降低或消除一种或多种效应子功能。在其它具体实施方案中，遗传修饰的cFc增强一种或多种效应子功能。

在某些实施方案中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGB Fc区。在另一个此类实施方案中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGC Fc区。在具体实施方案中，所述效应子功能是被增强、降低或消除的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。在另一个实施方案中，所述效应子功能是被增强、降低或消除的依赖补体的细胞毒性(CDC)。在又另一个实施方案中，cFc区已被遗传修饰以增强、降低或消除ADCC和CDC两者。

本发明还提供了包含遗传修饰的cFc区的犬框架和/或全长重链。因此，本发明提供了抗体的全长重链，其中所述全长重链包含本发明的遗传修饰的cFc区和本发明的CDR。此类全长重链也可以与对应的犬轻(

在某些实施方案中，遗传修饰的cFc区包含SEQ ID NO:66(或SEQ ID NO:68)的氨基酸序列，其中下列氨基酸残基中的一至七个在所示位置被另一个氨基酸残基所替代：P4、D31、N63、G64、T65、A93或P95。取代P4、D31、N63、G64、T65、A93和/或P95的氨基酸单独地选自其它19种标准天然存在的氨基酸之一，如下表1中所列。本发明还提供了遗传修饰的cFc区的变体，其包含与此类遗传修饰的cFc区的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列，且保留了包含SEQ ID NO:66(或SEQ ID NO:68)的氨基酸序列的遗传修饰的cFc区的ADCC和/或CDC的增强、降低或消除的至少50%、75%、90%、95%或更多，其中下列氨基酸残基中的一个或多个被替代：即，在P4、D31、N63、G64、T65、A93或P95处。

在其它实施方案中，下列氨基酸残基中的二至五个在所示位置被另一个氨基酸残基所替代：P4、D31、N63、G64、T65、A93或P95。在这种类型的具体实施方案中，遗传修饰的cFc区包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸序列，其具有下列取代：P4A、D31A、N63A、A93G和P95A。在相关实施方案中，遗传修饰的cFc区包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸序列，其具有下列取代：P4A、D31A、N63A和P95A。在其它实施方案中，遗传修饰的cFc区包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸序列，其在D31和N63处具有取代。在这种类型的具体实施方案中，位置31处的天冬氨酸被谷氨酸残基、天冬酰胺残基或丙氨酸残基所替代，而位置63处的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基、组氨酸残基或丙氨酸残基所替代。在这种类型的更具体实施方案中，遗传修饰的cFc区包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸序列，其具有下列取代：D31A和N63A。在具体实施方案中，遗传修饰的cFc区由包含核苷酸变化的SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:67的核苷酸序列编码，所述核苷酸变化对应于其编码的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，遗传修饰的cFc区包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸序列，其在A93处具有取代。在这种类型的具体实施方案中，所述取代为A93G。在相关实施方案中，所述取代为A93S。如以其整体通过引用并入本文的于2014年7月30日提交的美国临时申请号62/030,812中所述，A93G的取代导致补体C1q结合的增强，其表明增加CDC活性。

在相关实施方案中，遗传修饰的cFc区还包含铰链区，所述铰链区包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在其它实施方案中，遗传修饰的cFc区还包含铰链区，所述铰链区包含SEQID NO:46的氨基酸序列。在还有其它实施方案中，遗传修饰的cFc区还包含铰链区，所述铰链区包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在还有其它实施方案中，遗传修饰的cFc区还包含遗传修饰的铰链区，所述遗传修饰的铰链区包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。

在替代实施方案中，本发明提供了犬IgGD Fc区，其具有来自犬IgGD抗体的遗传修饰的铰链区、来自犬IgGA抗体的铰链区、来自犬IgGB抗体的铰链区或来自犬IgGC抗体的铰链区。此外，本发明提供了抗体的全长重链，其中所述全长重链包含本发明的犬IgGD Fc区，其具有来自犬IgGD抗体的遗传修饰的铰链区、来自犬IgGA抗体的铰链区、来自犬IgGB抗体的铰链区或来自犬IgGC抗体的铰链区。此类全长重链也可以与对应的犬轻(

因此，本发明提供了犬IgGD Fc区，其还包含来自犬IgGD抗体的遗传修饰的铰链区。在这种类型的具体实施方案中，所述犬IgGD Fc区和遗传修饰的铰链区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列，其在位置10处包含脯氨酸残基(P10)。在更具体实施方案中，所述犬IgGD Fc区和遗传修饰的铰链区由SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码。在其它实施方案中，所述犬IgGD Fc区还包含来自犬IgGA抗体的铰链区。在这种类型的具体实施方案中，所述犬IgGD Fc区和铰链区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在更具体实施方案中，所述犬IgGD Fc区和铰链区由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码。在还有其它实施方案中，所述犬IgGD Fc区还包含来自犬IgGB抗体的铰链区。在这种类型的具体实施方案中，所述犬IgGD Fc区和铰链区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在更具体实施方案中，所述犬IgGD Fc区和铰链区由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码。在还有其它实施方案中，所述犬IgGD Fc区还包含来自犬IgGC抗体的铰链区。在这种类型的具体实施方案中，所述犬IgGD cFc区和铰链区包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在更具体实施方案中，所述犬IgGDcFc区和铰链区由SEQ ID NO:11的核苷酸序列编码。本发明还提供了包含这些犬IgGD Fc区和铰链区的犬源化抗体。在具体实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段特异性结合犬程序性死亡受体1(犬PD-1)。

因此，本发明提供了对犬PD-L1具有特异性和/或具有高结合亲和力的犬源化抗-犬PD-L1抗体。在具体实施方案中，所述犬源化抗-犬PD-L1抗体还具有阻断犬PD-L1与犬PD-1的结合的能力。此类特异性结合犬PD-L1的犬源化抗体或其抗原结合片段可包含本发明的犬IgG重链和犬

在具体实施方案中，所述犬源化抗-犬PD-L1抗体包含本发明的遗传修饰的cFc区。在替代实施方案中，所述犬源化抗-犬PD-L1抗体包含犬IgGD Fc区，其具有来自犬IgGD抗体的遗传修饰的铰链区、来自犬IgGA抗体的铰链区、来自犬IgGB抗体的铰链区或来自犬IgGC抗体的铰链区。本发明还提供了此类犬源化抗-犬PD-L1抗体，其包含本发明的犬框架与CDR的组合，所述CDR获得自小鼠抗-犬PD-L1抗体，即，三个轻链CDR：CDR轻1(CDRL1)、CDR轻2(CDRL2)和CDR轻3(CDRL3)，以及三个重链CDR：CDR重1(CDRH1)、CDR重2(CDRH2)和CDR重3(CDRH3)。

在具体实施方案中，所述犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体包含本发明的IgGB或IgGC的遗传修饰的cFc区，或者可替代地，犬IgGD Fc区，连同：来自犬IgGD抗体的遗传修饰的铰链区、来自犬IgGA抗体的铰链区、来自犬IgGB抗体的铰链区或来自犬IgGC抗体的铰链区，与获得自小鼠抗-犬PD-L1抗体的CDR的组合。此外，本发明不仅提供了如本文详述的具有特定CDR的犬源化小鼠抗-犬PD-L1抗体，而且还进一步提供了犬源化小鼠抗-犬PD-L1抗体，其包含那些CDR的保守修饰的变体以及包含(例如，共享)相同规范结构的变体。

因此，在具体实施方案中，犬源化抗-犬PD-L1抗体进一步包含互补决定区(CDR)，其中CDR具有下列规范结构：分别对于重链的CDR1、CDR2和CDR3的H1-1、H2-3B和H3-10。在甚至更具体的实施方案中，对应轻链的CDR具有下列规范结构：分别对于轻链的CDR1、CDR2和CDR3的L1-2、L2-1和L3-1。在其它实施方案中，犬源化抗-犬PD-L1抗体进一步包含互补决定区(CDR)，其中CDR具有下列规范结构：分别对于重链的CDR1、CDR2和CDR3的H1-1、H2-3B和H3-8。在这种类型的甚至更具体实施方案中，对应轻链的CDR具有以下规范结构：分别对于轻链的CDR1、CDR2和CDR3的L1-3、L2-1和L3-1。

在更具体实施方案中，本发明的犬源化抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链互补决定区1(VH CDR1)中的一个或多个。在另一个实施方案中，重链互补决定区2(VH CDR2)包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，重链互补决定区3 (VH CDR3)包含SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:21的氨基酸序列。在这种类型的具体实施方案中，所述犬源化抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH CDR1和包含SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:20的氨基酸序列的VH CDR2两者。

在另一个此类实施方案中，所述犬源化抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH CDR1和包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR3两者。在又另一个此类实施方案中，所述犬源化抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR2和包含SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:21的氨基酸序列的VH CDR3两者。在又另一个此类实施方案中，所述犬源化抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR2和包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR3。

在具体实施方案中，所述犬源化抗体或抗原结合片段还含有包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链互补决定区1(VH CDR1)。在相关实施方案中，轻链互补决定区2 (VL CDR2)包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，轻链互补决定区3 (VL CDR3)包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在这种类型的具体实施方案中，所述犬源化抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:16或SEQID NO:22的氨基酸序列的VL CDR1和包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VLCDR2两者。在另一个此类实施方案中，所述犬源化抗体或抗原结合片段含有包含SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL CDR1和包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL CDR3两者。在又另一个此类实施方案中，所述犬源化抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL CDR2和包含SEQ ID NO:18或SEQID NO:24的氨基酸序列的VL CDR3两者。在又另一个此类实施方案中，所述犬源化抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL CDR2和包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL CDR3。

本发明还提供了包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列和SEQ ID NO:28或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列的犬源化抗体或这些犬源化抗体的抗原结合片段。本发明还提供了包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有90％、95％、98％或99％同一性和SEQ ID NO:32或与SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有90％、95％、98％或99％同一性的犬源化抗体或这些犬源化抗体的抗原结合片段。

在具体实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:26(或与SEQ ID NO:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242处的P、A、G或S，(ii)位置269处的A、G或S，(iii)位置301处的A、G或S，(iv)位置302处的G、P或A，(v)位置303处的T、A、G或S，(vi)位置331处的A、G或S，和(vii)位置333处的P、A、G或S。在其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:28或30(或与SEQ ID NO:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240处的P、A、G或S，(ii)位置267处的A、G或S，(iii)位置299处的A、G或S，(iv)位置300处的G、P或A，(v)位置301处的T、A、G或S，(vi)位置329处的A、G或S，和(vii)位置331处的P、A、G或S。在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:32(或与SEQ ID NO:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238处的P、A、G或S，(ii)位置265处的A、G或S，(iii)位置297处的A、G或S，(iv)位置298处的G、P或A，(v)位置299处的T、A、G或S，(vi)位置327处的A、G或S，和(vii)位置329处的P、A、G或S。

在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:26(或与SEQ ID NO:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242处的P、A、G或S，(ii)位置269处的A，(iii)位置301处的A，(iv)位置302处的G、P或A，(v)位置303处的T、A、G或S，(vi)位置331处的A、G或S，和(vii)位置333处的P、A、G或S。在其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:28或30(或与SEQ ID NO:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240处的P、A、G或S，(ii)位置267处的A，(iii)位置299处的A，(iv)位置300处的G、P或A，(v)位置301处的T、A、G或S，(vi)位置329处的A、G或S，和(vii)位置331处的P、A、G或S。在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:32(或与SEQ ID NO:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238处的P、A、G或S，(ii)位置265处的A，(iii)位置297处的A，(iv)位置298处的G、P或A，(v)位置299处的T、A、G或S，(vi)位置327处的A、G或S，和(vii)位置329处的P、A、G或S。

在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:26(或与SEQ ID NO:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242处的A，(ii)位置269处的A，(iii)位置301处的A，(iv)位置302处的P，(v)位置303处的A，(vi)位置331处的G，和(vii)位置333处的A。在其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:28或30(或与SEQ ID NO:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240处的A，(ii)位置267处的A，(iii)位置299处的A，(iv)位置300处的P，(v)位置301处的A，(vi)位置329处的G，和(vii)位置331处的A。在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:32(或与SEQID NO:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238处的A，(ii)位置265处的A，(iii)位置297处的A，(iv)位置298处的P，(v)位置299处的A，(vi)位置327处的G，和(vii)位置329处的A。

在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:26(或与SEQ ID NO:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242处的P，(ii)位置269处的A、G或S，(iii)位置301处的A、G或S，(iv)位置302处的G，(v)位置303处的T，(vi)位置331处的A，和(vii)位置333处的P。在其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:28或30(或与SEQ ID NO:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240处的P，(ii)位置267处的A、G或S，(iii)位置299处的A、G或S，(iv)位置300处的G，(v)位置301处的T，(vi)位置329处的A，和(vii)位置331处的P。在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:32(或与SEQ ID NO:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238处的P，(ii)位置265处的A、G或S，(iii)位置297处的A、G或S，(iv)位置298处的G，(v)位置299处的T，(vi)位置327处的A，和(vii)位置329处的P。

在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:26(或与SEQ ID NO:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242处的P，(ii)位置269处的A，(iii)位置301处的A，(iv)位置302处的G，(v)位置303处的T，(vi)位置331处的A，和(vii)位置333处的P。在其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:28或30(或与SEQ ID NO:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240处的P，(ii)位置267处的A，(iii)位置299处的A，(iv)位置300处的G，(v)位置301处的T，(vi)位置329处的A，和(vii)位置331处的P。在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:32(或与SEQID NO:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238处的P，(ii)位置265处的A，(iii)位置297处的A，(iv)位置298处的P，(v)位置299处的T，(vi)位置327处的A，和(vii)位置329处的P。

在其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:26(或与SEQ ID NO:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242处的P、A、G或S，(ii)位置269处的A、G或S，(iii)位置301处的A、G或S，(iv)位置302处的G，(v)位置303处的T，(vi)位置331处的A、G或S，和(vii)位置333处的P、A、G或S。在其它此类实施方案中，抗体的重链包含SEQID NO:28或30(或与SEQ ID NO:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240处的P、A、G或S，(ii)位置267处的A、G或S，(iii)位置299处的A、G或S，(iv)位置300处的G，(v)位置301处的T，(vi)位置329处的A、G或S，和(vii)位置331处的P、A、G或S。在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:32(或与SEQ ID NO:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238处的P、A、G或S，(ii)位置265处的A、G或S，(iii)位置297处的A、G或S，(iv)位置298处的G，(v)位置299处的T，(vi)位置327处的A、G或S，和(vii)位置329处的P、A、G或S。

在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:26(或与SEQ ID NO:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242处的P、A、G或S，(ii)位置269处的A，(iii)位置301处的A，(iv)位置302处的G，(v)位置303处的T，(vi)位置331处的A、G或S，和(vii)位置333处的P、A、G或S。在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:28或30(或与SEQ ID NO:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240处的P、A、G或S，(ii)位置267处的A，(iii)位置299处的A，(iv)位置300处的G，(v)位置301处的T，(vi)位置329处的A、G或S，和(vii)位置331处的P、A、G或S。在其它此类实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:32(或与SEQ ID NO:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238处的P、A、G或S，(ii)位置265处的A，(iii)位置297处的A，(iv)位置298处的G，(v)位置299处的T，(vi)位置327处的A、G或S，和(vii)位置329处的P、A、G或S。

在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:26(或与SEQ ID NO:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242处的A，(ii)位置269处的A，(iii)位置301处的A，(iv)位置302处的G，(v)位置303处的T，(vi)位置331处的G，和(vii)位置333处的A。在还有其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:28或30(或与SEQ IDNO:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240处的A，(ii)位置267处的A，(iii)位置299处的A，(iv)位置300处的G，(v)位置301处的T，(vi)位置329处的G，和(vii)位置331处的A。在其它此类实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:32(或与SEQ ID NO:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238处的A，(ii)位置265处的A，(iii)位置297处的A，(iv)位置298处的G，(v)位置299处的T，(vi)位置327处的G，和(vii)位置329处的A。此外，本发明提供了还包含犬轻链的犬源化抗体或其抗原结合片段，所述犬轻链包含SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:44的氨基酸序列。

因此，本发明还提供了犬源化抗体或其抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链。在相关实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链和包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列的轻链。在另一个实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。在相关实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。

在又另一个实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。在相关实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链和包含SEQID NO:44的氨基酸序列的轻链。在又另一个实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链。在相关实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链。

本发明还提供了犬源化抗体或其抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链。在相关实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链。在另一个实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。在相关实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。

本发明还提供了犬源化抗体或其抗原结合片段，其含有包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。在相关实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。在另一个实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链。在相关实施方案中，所述犬源化抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链。

本发明还提供了核酸，其编码本发明的任何氨基酸序列，包括本发明的犬源化抗体的CDR、cFc区、具有铰链区的cFc区以及重链和轻链。本发明还提供了包含本发明的一种或多种核酸的表达载体。本发明还提供了包含本发明的一种或多种表达载体的宿主细胞和使用此类宿主细胞表达本发明的犬源化抗体的CDR和/或cFc区和/或具有铰链区的cFc区和/或重链和/或轻链的方法。本发明还提供了宿主细胞，其已被基因工程改造以在不存在此类载体的情况下表达本发明的犬源化抗体的CDR和/或cFc区和/或具有铰链区的cFc区和/或重链和/或轻链。在具体实施方案中，本发明的这些核酸、表达载体、多肽或宿主细胞可用于制备抗体的方法中。

在具体实施方案中，所述抗体是重组抗体或其重组抗原结合片段。在相关实施方案中，所述可变重链结构域和可变轻链结构域通过柔性接头连接以形成单链抗体。

在某些实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段(例如，分离的抗体或其分离的抗原结合片段)，其特异性结合犬PD-L1，并且当其结合犬PD-L1时，所述抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO:82的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基。在相关实施方案中，特异性结合犬PD-L1的抗体或其抗原结合片段也结合SEQ ID NO:83的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基。在还有其它实施方案中，特异性结合犬PD-L1的抗体或其抗原结合片段也结合SEQ ID NO:82的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基和SEQ ID NO:83的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基。在具体实施方案中，这些抗体和/或其抗原结合片段阻断犬PD-L1与犬PD-1的结合。在相关实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在这种类型的具体实施方案中，所述抗体是单克隆鼠抗-犬PD-L1抗体。在更具体实施方案中，所述单克隆抗体是犬源化抗体。在又更具体实施方案中，所述单克隆抗体是犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体。

在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO:82的2至5个氨基酸残基。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO:82的6至12个氨基酸残基。在还有其它实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO:82的13至20个氨基酸残基。在相关实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO:83的2至5个氨基酸残基。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO:83的6至11个氨基酸残基。

在还有其它实施方案中，提供了单克隆抗体或其抗原结合片段，其与本发明的抗-犬PD-L1抗体中的一种或多种交叉竞争与犬PD-L1结合。在具体实施方案中，交叉竞争性抗体及其抗原结合片段结合犬PD-L1且阻断犬PD-L1与犬PD-1的结合。在更具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与4F9(或具有4F9的6个CDR的抗体)交叉竞争结合犬PD-L1。在其它更具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与5F12(或具有5F12的6个CDR的抗体)交叉竞争结合犬PD-L1。在还有其它实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与4F9和5F12两者交叉竞争结合犬PD-L1。

在具体实施方案中，本发明的单克隆抗体是鼠抗体。在其它实施方案中，所述单克隆抗体是犬源化抗体。在更具体实施方案中，本发明的单克隆抗体是犬源化鼠抗体。

此外，本发明提供了针对犬PD-L1的抗体(例如，犬源化抗体)，其包含本发明的CDR或具有本文提供的相应规范结构的CDR的变体，和/或结合PD-L1的SEQ ID NO:82和/或83的氨基酸序列。在这种类型的具体实施方案中，犬源化抗体-犬PD-L1结合的解离常数(Kd)为1X 10

本发明进一步提供了以低于1 X 10

本发明还提供了以大于1 X 10

本发明还提供了以慢于1 X 10

在相关实施方案中，所述抗体(例如，犬源化抗体)或其抗原结合片段刺激对肿瘤或病原体的抗原特异性记忆应答。在具体实施方案中，所述抗体(例如，犬源化抗体)或其抗原结合片段刺激体内抗体应答。在其它具体实施方案中，所述抗体(例如，犬源化抗体)或其抗原结合片段刺激动物受试者中的免疫应答。在更具体实施方案中，所述动物受试者是犬科动物。在一个相关实施方案中，所述动物受试者是猫科动物。

因此，本发明的任何抗体(例如，犬源化抗体)可以在动物受试者中表现出一种、两种、三种、四种、五种或所有这些特性，即前述与犬PD-L1的解离常数，前述与犬PD-L1结合的结合常数，前述从犬源化抗体-犬PD-L1结合复合物解离的解离速率，刺激对肿瘤或病原体的抗原特异性记忆应答，刺激体内抗体应答，和/或刺激免疫应答。

在更具体实施方案中，本发明的抗体和/或其抗原结合片段结合犬PD-L1且还阻断犬PD-L1与PD-1的结合。在甚至更具体实施方案中，本发明的犬源化抗体及其抗原结合片段结合犬PD-L1且阻断犬PD-L1与PD-1的结合。

如上所述，本发明的抗体(及其抗原结合片段)，包括某些前述抗体(及其抗原结合片段)，可以是单克隆抗体(及其抗原结合片段)，哺乳动物抗体(及其抗原结合片段)，例如，鼠(小鼠)抗体(及其抗原结合片段)，犬源化抗体(及其抗原结合片段)，包括犬源化鼠抗体(及其抗原结合片段)。在某些实施方案中，所述抗体(及其抗原结合片段)是分离的。

在具体实施方案中，所述抗体是重组抗体或其抗原结合片段。在相关实施方案中，所述可变重链结构域和可变轻链结构域通过柔性接头连接以形成单链抗体。

在具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是Fab片段。在其它实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是Fab'片段。在其它实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是(Fab')

在具体实施方案中，犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或抗原结合片段增加所治疗的动物受试者(例如，犬科动物或猫科动物)的免疫应答。

本发明还提供了编码本发明的抗体及其部分(包括CDR)中的任一种的核酸(包括分离的核酸)。在某些实施方案中，本发明提供了编码本发明的犬源化抗体的轻链或其部分中的任一种的核酸(包括分离的核酸)。类似地，本发明提供了编码本发明的犬源化抗体的重链或其部分中的任一种的核酸(包括分离的核酸)。本发明还提供了包含本发明的一种或多种核酸(包括分离的核酸)的表达载体。因此，本发明提供了编码本发明的犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或其部分的核酸。在相关实施方案中，此类抗体或抗原结合片段可用于制备药物以治疗犬科动物和/或猫科动物受试者中的癌症。可替代或结合地，本发明提供了本发明的任何抗体或抗体片段用于诊断用途的用途。在又额外实施方案中，提供了包含本文公开的任何犬源化抗体或抗原结合片段的试剂盒。在具体实施方案中，提供了表达载体，其包含编码本发明的任何犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或抗原结合片段的分离的核酸。本发明还提供了包含本发明的一种或多种表达载体的宿主细胞。在具体实施方案中，本发明的这些核酸、表达载体或多肽可用于制备抗体的方法中。

本发明还提供了抗原肽(包括分离的抗原肽)，其由包含SEQ ID NO:82和/或SEQID NO:83的氨基酸序列的80个或更少个氨基酸残基组成。在相关实施方案中，所述抗原肽(包括分离的肽)由包含SEQ ID NO:82和/或SEQ ID NO:83的氨基酸序列的60个或更少个氨基酸残基组成。在相关实施方案中，所述抗原肽(包括分离的肽)由包含SEQ ID NO:82和/或SEQ ID NO:83的氨基酸序列的11至45个氨基酸残基组成。在还有其它实施方案中，所述抗原肽由来自SEQ ID NO:83的氨基酸序列的5至20个氨基酸残基组成。在还有其它实施方案中，所述抗原肽由来自SEQ ID NO:83的氨基酸序列的5至11个氨基酸残基组成。

本发明还提供了抗原肽(包括分离的肽)，其由包含与SEQ ID NO:82和/或SEQ IDNO:83的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的80个或更少个氨基酸残基组成，且结合本发明的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在相关实施方案中，所述抗原肽(包括分离的抗原肽)由包含与SEQ ID NO:82和/或SEQ ID NO:83的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的60个或更少个氨基酸残基组成，且结合分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在其它实施方案中，所述肽由来自与SEQ ID NO:82的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的5个至20个氨基酸残基组成，且结合分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在其它实施方案中，所述肽由来自与SEQ ID NO:83的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的5个至11个氨基酸残基组成，且结合分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，所述哺乳动物抗体是4E9。在其它实施方案中，所述哺乳动物抗体是5F12。

本发明还提供了包含任何前述抗原肽的融合蛋白。在具体实施方案中，所述融合蛋白包含此抗原肽和非犬哺乳动物IgG抗体的Fc区。在更具体实施方案中，所述融合蛋白包含非犬哺乳动物IgG抗体的Fc区。在某些实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是鼠IgG。在替代实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是人IgG。在其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是马IgG。在还有其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是猪IgG。在还有其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是牛IgG。

在具体实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是IgG1。在其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是IgG2a。在还有其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是IgG3。在还有其它实施方案中，所述非犬哺乳动物IgG抗体是IgG4。

在其它实施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和麦芽糖结合蛋白。在还有其它实施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和β-半乳糖苷酶。在还有其它实施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和谷胱甘肽S-转移酶。在还有其它实施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和硫氧还蛋白。在还有其它实施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和Gro EL。在还有其它实施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和NusA。

本发明还提供了编码本发明的抗原肽和相应的融合蛋白的核酸(包括分离的核酸)。本发明还提供了包含这些核酸的表达载体和包含本发明的一种或多种表达载体的宿主细胞。

此外，本发明包括药物组合物，其包含本发明的抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段，来自犬PD-L1的抗原肽(包括分离的抗原肽)，包含来自本发明的犬PD-L1的抗原肽的融合蛋白，编码本发明的抗原性片段和/或融合蛋白的核酸(包括分离的核酸)，包含此类核酸的表达载体，或其任何组合，以及药学上可接受的载体或稀释剂。

在具体实施方案中，此类药物组合物还包含抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段。在更具体实施方案中，所述抗-犬PD-1抗体是犬源化鼠抗-犬PD-1抗体或犬源化鼠抗-犬PD-1抗体的抗原结合片段。在相关实施方案中，此类药物组合物还包含抗-犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，所述抗-犬CTLA-4抗体是犬源化鼠抗-犬CTLA4抗体或犬源化鼠抗-犬CTLA4抗体的抗原结合片段。

因此，本发明提供了包含下列中的一种、两种、三种或更多种的药物组合物：抗-犬PD-L1抗体、抗-犬PD-1抗体、抗-犬CTLA-4抗体、抗-犬PD-L1抗体的抗原结合片段、抗-犬PD-1抗体的抗原结合片段或抗-犬CTLA-4抗体的抗原结合片段。在具体实施方案中，此类抗-犬蛋白(即，抗-犬PD-L1、PD-1或CTLA-4)抗体或其抗原结合片段是鼠抗-犬蛋白抗体。在其它实施方案中，此类抗-犬蛋白抗体或其抗原结合片段是犬源化抗-犬蛋白抗体。在更具体实施方案中，所述抗-犬蛋白抗体或其抗原结合片段是犬源化鼠抗-犬蛋白抗体。

此外，本发明提供了增加免疫细胞的活性的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在某些实施方案中，所述方法用于治疗癌症。在其它实施方案中，所述方法用于治疗感染或传染病。在还有其它实施方案中，本发明的犬源化抗体或其抗原结合片段用作疫苗佐剂。在具体实施方案中，包含犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段的药物组合物可以在犬源化鼠抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段和/或犬源化鼠抗-犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段之前、之后或同时施用。

通过参考以下附图简述和详述将更好地理解本发明的这些和其它方面。

附图说明

图1显示作为OD 650/490相比log mAb (nM)的函数的两种小鼠抗-犬PD-L1 mAb针对犬PD-L1的反应性的ELISA结果。被称为4F9和5F12的两种mAb，显示了与犬PD-L1的强烈和剂量依赖性的结合。

图2显示用小鼠抗-犬PD-L1 mAb的配体阻断。测试被称为4F9和5F12的两种mAb抑制PD-L1与CHO细胞上表达的PD-1结合的能力。两种mAb都阻断PD-L1与PD-1的结合，尽管mAb4F9是比5F12更强的抑制剂。

具体实施方式

缩写

贯穿本发明的详述和实施例，将使用以下缩写：

ADCC　　　抗体依赖性细胞毒作用

CDC　　　依赖补体的细胞毒性

CDR　　　免疫球蛋白可变区中的互补性决定区，针对人抗体使用Kabat编号系统定义

CHO　　　中国仓鼠卵巢

EC50　　　导致50%功效或结合的浓度

ELISA　　　酶联免疫吸附测定

FR　　　抗体构架区：不包括CDR区的免疫球蛋白可变区。

HRP　　　辣根过氧化物酶

IFN　　　干扰素

IC50　　　导致50%抑制的浓度

IgG　　　免疫球蛋白G

Kabat　　　由Elvin A. Kabat [

mAb　　　单克隆抗体(也表示为Mab或MAb)

MES　　　2-(N-吗啉代)乙磺酸

MOA　　　作用机制

NHS　　　正常人血清

PCR　　　聚合酶链反应

PK　　　药物代谢动力学

SEB　　　葡萄球菌肠毒素B

TT　　　破伤风类毒素

V区　　　在不同抗体之间在序列上可变的人IgG链的区段。其延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的Kabat残基113。

VH　　　免疫球蛋白重链可变区

VK　　　免疫球蛋白

定义

为了可以更容易地理解本发明，下面特别地定义了某些技术和科学术语。除非在本文件别处特别地定义，本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

如本文(包括所附权利要求书)中所使用，词语的单数形式诸如“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”包括它们的对应复数形式，除非上下文另外清楚地指明。

“活化”在其应用于细胞或受体时指用配体活化或处理细胞或受体，除非上下文另外指出或明确地指出。“配体”包括天然和合成的配体，例如，细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和衍生自抗体的结合化合物。“配体”也包括小分子，例如，细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可以指如被内部机制以及被外部或环境因子调节的细胞活化。

分子的“活性”可以描述或指分子与配体或与受体的结合，催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性，其它分子的活性的调节等。分子的“活性”还可以指调节或维持细胞-与-细胞相互作用(例如，黏附)的活性，或维持细胞的结构(例如，细胞膜或细胞骨架)的活性。“活性”也可以意指比活性，例如，[催化活性]/[mg蛋白]或[免疫学活性]/[mg蛋白]，生物区室中的浓度等。“活性”可以指先天性或适应性免疫系统的组分的调节。

“施用”和“处理”当其应用于动物(例如，犬实验受试者)、细胞、组织、器官或生物学流体时指外源药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物(例如，犬受试者)、细胞、组织、器官或生物学流体的接触。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。“治疗(Treat)”或“治疗(treating)”是指向具有一种或多种疾病症状或被怀疑患有药剂对其具有治疗活性的疾病的兽医受试者(例如，犬科动物或猫科动物)内部或外部施用治疗剂，诸如含有本发明的抗体或抗原结合片段的组合物。因此，“施用(administration)”和“处理(treatment)”还包括通过试剂、诊断剂、结合化合物或另一种细胞体外和先体外后体内处理例如细胞。

通常，所述药剂以有效地减轻和/或改善接受治疗的受试者或群体中的一种或多种疾病症状的量施用，无论是以任何临床上可测量的程度上诱导此类症状的消退还是抑制此类症状的进展。有效地减轻任何具体疾病症状的治疗剂的量(也被称为“治疗有效量”)可以根据因素诸如受试者(例如，犬科动物)的疾病状态、年龄和重量以及药物组合物在受试者中引起期望应答的能力而变化。疾病症状是否已经减轻或改善，可以通过兽医或其他熟练的卫生保健提供者通常使用的任何临床测量来评价，以评估该症状的严重程度或进展状态。尽管本发明的一个实施方案(例如，治疗方法或制品)可能不会在减轻每个受试者中的靶疾病症状中都有效，但其应当减轻统计学上显著数目的受试者中的靶疾病症状，如通过本领域已知的任何统计学检验(诸如斯氏t-检验、卡方检验、根据Mann和Whitney的U-检验、Kruskal-Wallis检验(H-检验)、Jonckheere-Terpstra-检验和Wilcoxon-检验)所确定的。

术语“免疫应答”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由以上细胞或肝产生的可溶性大分子 (包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致癌细胞(cancerous cell)、被病原体感染的细胞或组织、或侵入病原体对哺乳动物身体(例如，犬身体)的选择性损伤、破坏、或从其消除。

术语“受试者”包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如，犬科动物、猫科动物或人)，且最优选犬科动物。

如本文中所用，术语“犬科动物”包括所有家养狗，家犬(Canis lupus familiaris或Canis familiaris)，除非另外指出。

如本文中所用，术语“猫科动物”指猫科(Felidae)的任何成员。该科的成员包括野生、动物园和家养成员，诸如猫亚科的任何成员，例如猫类、狮类、虎类、美洲狮类、美洲虎类、豹类、雪豹类、黑豹类、北美山狮类、猎豹类、猞猁、山猫类、狞猫类或其任何杂交品种。猫类还包括家养猫类、纯种和/或杂种的伴侣猫类(companion cats)、观赏猫类(show cats)、实验室猫类、克隆猫类以及野生或未驯服猫类。

已发现犬PD-1包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列[于2013年12月20日提交的美国临时申请号61/918,946，其内容在此以其整体并入本文]。在具体实施方案中，犬PD-L1由包含SEQ ID NO:49的核苷酸序列的核酸编码。

已发现犬PD-L1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列[于2013年12月20日提交的美国临时申请号61/918,946，同上]。在具体实施方案中，犬PD-L1由包含SEQ ID NO:55的核苷酸序列编码。

如本文中所用，在例如抗体的氨基酸序列中用另一个氨基酸残基“取代氨基酸残基”等同于用另一个氨基酸残基“替代氨基酸残基”，并且表示在氨基酸序列中的特定位置处的具体氨基酸残基已经由不同的氨基酸残基替代(或取代)。例如，一种此类取代(替代)被表示为IgGB或IgGC氨基酸序列的Fc区的P4A，在这种情况下，IgGB的Fc区或IgGC的Fc区的氨基酸序列的氨基酸位置4处的脯氨酸残基已经被丙氨酸残基取代(替代)。

因此，此类取代可以被特别设计，即，通过例如重组DNA技术在氨基酸序列中的特定位置处有目的地用丝氨酸替代丙氨酸。或者，例如，基于细胞产生的抗体结合该抗原上的给定区域(例如，含有表位或其部分的区域)和/或使得该抗体包含保留与其替代的CDR相同的规范结构的特定CDR的能力，抗体的特定氨基酸残基或氨基酸残基串可以通过更自然的选择过程而被一个或多个氨基酸残基替代。此类取代/替代可以导致“变体”CDR和/或变体抗体。

序列同一性指当最佳比对两个多肽序列时两个多肽的氨基酸在等同位置处相同的程度。如本文中所用，当两个序列的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列100%“相同”。因此，当两个氨基酸序列的50%的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列50%“相同”。序列比较在给定蛋白(例如，所比较的蛋白，或多肽的一部分)包含的氨基酸残基的邻接块上进行。在具体实施方案中，考虑可能否则改变两个氨基酸序列之间的一致性的所选缺失或插入。

序列相似性包括相同的残基和不相同的、生化上相关的氨基酸。下文讨论共享相似特性且可互换的生化相关的氨基酸。

以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS:Altschul, S.F., 等人,

犬源化的抗-犬抗原抗体

如本文中所用，如果抗体结合包含犬抗原(例如犬PD-L1)的氨基酸序列的一部分的多肽，但不结合缺乏所述犬抗原(例如犬PD-L1)的序列的该部分的其它犬蛋白，则该抗体被称为特异性结合包含给定抗原序列(在这种情况下，犬抗原(例如犬PD-L1)的氨基酸序列的一部分)的多肽。例如，特异性地结合包含犬PD-L1的多肽的抗体可以结合犬PD-L1的FLAG®标记的形式，但将不特异性结合其它FLAG®标记的犬蛋白。当抗体或衍生自抗体的抗原结合部位的结合化合物对犬抗原或其变体或突变蛋白的亲和力是其对测试的任何其它犬抗原的亲和力的至少10倍、更优选至少20倍以及甚至更优选至少100倍时，其“特异性”结合其犬抗原或其变体或突变蛋白。

如本文中所用，术语“抗体”指表现出所需生物学活性的任何形式的抗体。因此，其以最宽泛的意义使用并且具体涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、犬源化抗体、完全犬抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体。“亲本抗体”是在对抗体进行修饰以用于预期用途(诸如对抗体进行犬源化以用作犬治疗用抗体)之前通过将免疫系统暴露于抗原而获得的抗体。

如本文中所用，除非另外指明，“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合被全长抗体结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')

“Fab片段”含有一条轻链和一条重链的C

“可结晶段”(“Fc”)区含有包含抗体的C

“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的一部分或片段，所述重链的一部分或片段含有V

“F(ab')

“Fv区”包含重链和轻链两者的可变区，但缺乏恒定区。

术语“单链Fv”或“scFv”抗体指包含抗体的V

如本文中所用，术语“规范结构”指抗体的重链和轻链的高变区中每一个在其所处的构架内所采用的局部构象。对于每个高变区，存在少量的规范结构(通常用简单整数诸如1或2等表示)，其可以从对应的高变区的氨基酸序列以高准确度预测(尤其是在其构架的氨基酸序列的背景内，如下文中对于对应的犬源化鼠抗-犬PD-L1的可变结构域所提供的)。关于给定CDR的氨基酸序列的修饰是否将导致结合其抗原结合配偶体的能力的保持或丧失，这些规范结构可以是决定性的[参见，Chothia 和 Lesk,

“结构域抗体”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫学功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个V

“二价抗体”包含两个抗原结合部位。在一些情况下，所述两个结合部位具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的(参见下文)。

在某些实施方案中，本文的单克隆抗体还包括骆驼源化单结构域抗体。[参见, 例如, Muyldermans等人,

如本文中所用，术语“双抗体”指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，所述片段包含连接至同一多肽链中的轻链可变结构域(V

通常，当活性基于摩尔表示时，本发明的抗体或抗原结合片段保留其犬PD-L1结合活性的至少10%(当与亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留亲本抗体的犬抗原(例如，PD-L1)结合亲和力的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多。还预期，本发明的犬源化抗体或抗原结合片段可以包括没有实质性改变其生物学活性的保守或非保守氨基酸取代(被称为抗体的“保守变体”或“功能保守的变体”)。

“分离的抗体”指纯化状态，并且在此背景下意指所述分子基本上不含其它生物学分子(诸如核酸、蛋白、脂质、碳水化合物)或其它材料(诸如细胞碎片和生长培养基)。通常，术语“分离的”不意指完全不存在此类材料或不存在水、缓冲液或盐，除非其以实质上妨碍如本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。

如本文中所用，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中所述第一和第二抗体来自不同物种。[U.S. 4,816,567; 和Morrison 等人,

如本文中所用，术语“犬源化抗体”指含有来自犬和非犬(例如，鼠)抗体两者的序列的抗体形式。通常，犬源化抗体将包含至少一个(且通常两个)可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上全部高变环均对应于非犬免疫球蛋白的那些(例如，如下所示例，包含6个鼠抗-犬PD-L1 CDR)，以及所有或基本上全部的犬框架。

术语“全犬抗体”指仅包含犬免疫球蛋白蛋白序列的抗体。如果在小鼠中、在小鼠细胞中或在源于小鼠细胞的杂交瘤中产生，则全犬抗体可含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。或者，如果在大鼠中、在大鼠细胞中或在源于大鼠细胞的杂交瘤中产生，则全犬抗体可能含有大鼠碳水化合物链。类似地，“大鼠抗体”指仅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。

每个轻/重链对的可变区形成抗体结合部位。因此，一般而言，完整抗体具有两个结合部位。除了在双功能或双特异性抗体中，所述两个结合部位一般而言是相同的。

通常，重链和轻链两者的可变结构域包含位于相对保守的构架区(FR)内的三个高变区，也被称为互补性决定区(CDR)。CDR通常侧接所述构架区，从而使得能够结合特定表位。通常，从N末端到C末端，轻链和重链可变结构域两者均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常根据

如本文中所用，术语“高变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补性决定区”或“CDR”(即，轻链可变结构域中的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链可变结构域中的CDRH1、CDRH2和CDRH3)的氨基酸残基。[参见Kabat 等人，

如本文中所用，术语“犬框架”指除本文中定义为CDR残基的高变区残基以外的犬抗体的重链和轻链的氨基酸序列。在两条链中，天然犬CDR的氨基酸序列均被对应的外源CDR(例如，来自小鼠抗体的那些)替代。任选地，犬抗体的重链和/或轻链可以含有一些外源非CDR残基，例如，以便在犬抗体内保持所述外源CDR的构象，和/或修饰Fc功能，如下文所示例的。

如本文中所用，“抗-犬PD-L1抗体”指针对犬PD-L1(例如，在哺乳动物诸如小鼠或兔子中)产生并且特异性结合犬PD-L1的抗体。“特异性结合犬PD-L1”的抗体或“特异性结合包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的多肽”的抗体，是与其它抗原相比表现出优先结合犬PD-L1(例如，“特异性”结合犬PD-L1)的抗体。所述结合不需要绝对的结合特异性。如果其结合对样品中犬PD-L1的存在是决定性的，或者如果其能够改变犬PD-L1的活性而不会过度干扰犬样品中的其它分子的活性，例如，不会产生不期望的结果诸如诊断背景下的假阳性或在治疗背景下的副作用，则抗-犬PD-L1抗体被认为对于犬PD-L1特异性。抗-犬PD-L1抗体所必需的特异性程度可取决于所述抗体的预期用途，并且至少由其用于预期目的的适合性所限定。设想的方法的抗体或衍生自抗体的抗原结合部位的结合化合物以与任何其它抗原的亲和力的至少两倍、优选至少十倍、更优选至少20倍、且最优选至少100倍的亲和力结合其抗原或其变体或突变蛋白。

因此，本发明提供了(例如，特异性)结合犬PD-L1的犬源化抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段(包括分离形式)以及此类抗体或其片段的用途。在具体实施方案中，提供了来自鼠抗-犬PD-L1抗体的鼠抗-犬PD-L1 CDR，已经显示，其既结合犬PD-L1又阻断犬PD-L1结合其受体，例如，犬PD-1。可以将这些CDR插入本发明的修饰的犬框架中，以制备犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体，如本文所示例的。

更具体地，本发明的“犬源化鼠抗-PD-L1抗体”指这样的抗体，其包含来自鼠抗-犬PD-L1抗体的三个重链CDR和三个轻链CDR，连同犬框架或修饰的犬框架。修饰的犬框架包含如本文所示例的一个或多个氨基酸变化，所述变化进一步使所述犬源化抗体的有效性最优化，例如，以增强、降低或消除抗体效应子功能；以提高其与犬抗原(例如，犬PD-L1)的结合和/或提高其阻断犬抗原(例如，犬PD-L1)结合其天然结合配偶体(例如，在其中抗原为犬PD-L1的情况下是犬PD-1)的能力。

“同源性”指当将它们最佳地比对时两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性。当在两个对比的序列中的位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据时，则所述分子在该位置是同源的。同源性百分比是两个序列共有的同源位置的数目除以比较的位置的总数×100。例如，如果当将序列最佳地比对时两个序列的10个位置中的6个是匹配的或同源的，则所述两个序列是60%同源的。通常，当比对两个序列时进行所述比较以给出最大同源性百分比。

“分离的核酸分子”意指基因组、mRNA、cDNA或合成来源或其一些组合的DNA或RNA，所述DNA或RNA与在自然界中在其中发现所述分离的多核苷酸的多核苷酸的全部或部分无关，或与在自然界中它没有与其连接的多核苷酸连接。为了本公开的目的，应当理解，包含特定核苷酸序列的“核酸分子”不包括完整染色体。除了指定的序列以外，“包含”指定的核酸序列的分离的核酸分子还可以包括，多达10个或甚至多达20个或更多个其它蛋白或其部分或片段的编码序列，或可以包括可操作连接的控制叙述的核酸序列的编码区的表达的调节序列，和/或可以包括载体序列。

短语“控制序列”指可操作连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达所必需的DNA序列。适合用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

当核酸位于与另一个核酸序列的功能关系中时，所述核酸是“可操作连接的”。例如，前序列或分泌型前导序列的DNA与多肽的DNA可操作连接，如果其表达为参与所述多肽的分泌的前蛋白的话；启动子或增强子与编码序列可操作连接，如果其影响所述序列的转录的话；或核糖体结合位点与编码序列可操作连接，如果其被定位从而促进翻译的话。通常，“可操作连接的”意指，所连接的DNA序列是邻接的，且在分泌型前导序列的情况下，是邻接的且在阅读相中。然而，增强子不必须是邻接的。连接通过在方便的限制位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

如本文中所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且所有此类名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其衍生出的培养物，而不考虑转移的次数。还应当理解，由于故意的或非故意的突变，并非所有后代都具有精确地相同的DNA含量。包括具有相同功能或生物学活性的突变体后代，如在最初转化的细胞中所筛选的。当意指不同名称时，它从上下文是清楚的。

如本文中所用，“种系序列”指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可以使用未重排的免疫球蛋白序列的任意合适的来源。人种系序列可以例如获得自美国国立卫生研究院的国家关节炎和肌肉骨骼疾病和皮肤疾病研究所(National Institute of Arthritisand Musculoskeletal and Skin Diseases of the United States NationalInstitutes of Health)的网站上的JOINSOLVER

犬源化抗体的特性

在犬科动物中，存在被称为A、B、C和D的四种IgG重链。这些重链代表了四个不同的狗IgG亚类，被称为IgGA、IgGB、IgGC和IgGD。这四种重链的DNA和氨基酸序列由Tang等人首次鉴定[

治疗用单克隆抗体的开发是一个复杂的过程，其需要协调一套复杂的活动以生成所需的抗体。这些包括最优化抗体特异性，亲和力，功能活性，在工程改造的细胞系中的表达水平，长期稳定性，效应子功能的消除或增强，以及商业上可行的制造和纯化方法的开发。考虑到本发明的目标，并且除了活化免疫系统细胞的能力之外，针对犬PD-L1的犬源化或犬单克隆抗体最佳地具有三种额外的属性：

1. 缺乏效应子功能诸如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)；

2. 相对长的体内半衰期；和

3. 易于使用工业标准技术(诸如基于A蛋白层析的技术)进行大规模纯化。

无一天然存在的犬IgG亚类满足所有这些标准。例如，IgGB可以使用A蛋白纯化，但具有高水平的ADCC活性。IgGC也具有相当大的ADCC活性。另一方面，IgGA弱结合A蛋白，但显示出不期望的ADCC活性。此外，IgGC和IgGD均不能在A蛋白柱上纯化，尽管IgGD未显示出ADCC活性。另外，IgGC具有短血清半衰期，因为其不结合犬FcRn受体。本发明通过提供修饰的对犬抗原(例如，犬PD-L1)特异性的犬IgG抗体来克服了这个难题；此类抗体缺乏效应子功能(诸如ADCC和CDC)、表现出相对长半衰期并且可以使用工业标准的A蛋白层析容易地进行纯化。

迄今为止，先前尚未描述遗传修饰的犬IgG，其缺乏ADCC和CDC效应子功能两者并且另外，可以通过A蛋白层析进行纯化。如本文所公开的，在犬IgG中的一个位置上的单个取代(类似于人和小鼠IgG中的取代)，诸如N297A或D265A，不会完全消除对应的犬抗体中的ADCC和CDC效应子功能两者。例如，尽管人或鼠抗体中的取代N297和D265各自均导致废除与Fc

为了生成缺乏效应子功能的犬IgGB和IgGC的变体，可以生成修饰的犬IgGB或修饰的犬IgGC重链。鉴定了存在于这些犬可结晶段区(cFc)的两者中的总共七个氨基酸残基，用于此类可能的取代。对于犬IgGB的Fc的SEQ ID NO:66的氨基酸序列和犬IgGC的Fc的SEQ IDNO:68的氨基酸序列两者，这七个氨基酸残基是：P4、D31、N63、G64、T65、A93和P95。因此，SEQID NO:2的氨基酸序列与SEQ ID NO:66的氨基酸序列的不同在于在位置：4、31、63、64、65、93和95处的氨基酸残基对于全部七个位置均为“X”(或三字母代码“Xaa”)，表示这七个氨基酸位置可以是二十个天然氨基酸中的任一个(参见下表1的第1列中的列表)，在SEQ ID NO:66的氨基酸序列中，位置4、31、63、64、65、93和95处的氨基酸残基分别为脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)和脯氨酸(P)。类似地，SEQ ID NO:4的氨基酸序列与SEQ ID NO:68的氨基酸序列的不同在于在位置4、31、63、64、65、93和95处的氨基酸残基对于全部七个位置均被列为“X”(或三字母代码“Xaa”)，表示这七个氨基酸位置可以是二十个天然氨基酸中的任一个。SEQ ID NO:2的氨基酸序列由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码，而SEQ ID NO:4的氨基酸序列由SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，所述cFc包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，其具有下列取代：P4(A、G或S)、D31(A、G或S)、N63(A、G或S)、G64(A或P)、T65(A、G或S)、A93(G或S)和P95(A、G或S)；其中P4(A、G或S)表示在位置4处的脯氨酸残基被丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸残基替代，类似地，G64(A或P)表示在位置64处的甘氨酸残基被脯氨酸或丙氨酸残基所取代，等等。在具体实施方案中，所述cFc包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，其具有下列取代：P4A、D31A、N63A、G64P、T65A、A93G和P95A。

在相关实施方案中，所述cFc包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，其含有7个称为Xaa的氨基酸，其具有下列氨基酸残基：A4、A31、A63、G64、T65、G93和A95，即，SEQ ID NO:68的氨基酸序列，其具有下列五(5)个氨基酸残基变化：P4A、D31A、N63A、A93G和P95A，且七个氨基酸残基中剩余的两个，G64和T65，由SEQ ID NO:68的氨基酸序列保持不变。

SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的氨基酸序列在七个氨基酸位置处均含有“X”(或三字母代码“Xaa”)，表示这七个氨基酸位置可以是列于下表1的第1列中的二十个天然氨基酸中的任一个。值得注意的是，SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32在其各自的序列内包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQID NO:4的氨基酸序列。在所述氨基酸序列的这七个位置中的一处或多处的氨基酸残基的特定实例在上下文中描述，并且因此被包括于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32的单独氨基酸序列的种类里，以及包含这些序列的犬源化抗体内。

下文中提供的表10将cIgGB Fc(SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:2)和cIgGC Fc(SEQID NO:68和SEQ ID NO:4)的如本文所公开的可被替代的七个氨基酸位置与包含这些cFc氨基酸序列的全长犬重链(即，SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:32)的氨基酸位置具体关联。因此，可以通过使用下表10而容易地将全长序列IgGB或IgGC中的实际位置与其包含的cFc的位置协调。

在具体实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，其包含(i)位置242处的P、A、G或S，(ii)位置269处的D、A、G或S，(iii)位置301处的N、A、G或S，(iv)位置302处的G、P或A，(v)位置303处的T、A、G或S，(vi)位置331处的A、G或S和(vii)位置333处的P、A、G或S。在其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:28或30的氨基酸序列，其包含(i)位置240处的P、A、G或S，(ii)位置267处的D、A、G或S，(iii)位置299处的N、A、G或S，(iv)位置300处的G、P或A，(v)位置301处的T、A、G或S，(vi)位置329处的A、G或S和(vii)位置331处的P、A、G或S。在其它实施方案中，抗体的重链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，其包含(i)位置238处的P、A、G或S，(ii)位置265处的D、A、G或S，(iii)位置297处的N、A、G或S，(iv)位置298处的G、P或A，(v)位置299处的T、A、G或S，(vi)位置327处的A、G或S和(vii)位置329处的P、A、G或S。

本发明还提供了修饰的犬IgGD，其包含来自IgGA、IgGB或IgGC的铰链区以替代其天然IgGD铰链区。或者，可以如表5中所示通过用脯氨酸残基替代丝氨酸残基来遗传修饰所述IgGD铰链区。此类修饰可导致缺乏fab臂交换的犬IgGD。可以使用重组DNA技术的标准方法来构建修饰的犬IgGD[例如，Maniatis 等人,

本发明还提供了全长犬重链，其可以与对应的轻链匹配以得到犬源化抗体。因此，本发明进一步提供了犬源化鼠抗-犬抗原抗体(包括分离的犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体)和使用所述抗体或其抗原结合片段治疗疾病(例如，在犬中治疗癌症)的方法。

此外，本发明提供了犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或抗原结合片段，其结合犬PD-L1且阻断犬PD-1结合犬PD-L1。在某些实施方案中，所述犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体包含如本文所述的修饰的犬IgGB Fc、修饰的犬IgGC Fc或修饰的缺乏fab臂交换的犬IgGD。

结合犬抗原(例如，犬PD-L1)的抗体或其抗原结合片段可包含如本文所述的鼠抗-犬抗体的互补性决定区(CDR)中的一个、两个、三个、四个、五个或六个。所述一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR可以独立地选自下文提供的那些的CDR序列。在进一步实施方案中，结合犬PD-L1的抗体或其抗原结合片段包含犬抗体

在其它实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其特异性结合PD-L1且具有犬抗体

“保守修饰的变体”或“保守取代”指用具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸取代蛋白中的氨基酸，从而使得所述变化可以经常在不改变蛋白的生物活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，一般而言，在多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代不会实质上改变生物学活性[参见，例如，Watson等人,

示例性保守氨基酸取代

本发明也考虑本发明的抗体的功能保守变体。如本文中所用的“功能保守变体”指这样的抗体或片段，其中一个或多个氨基酸残基已经被改变，而不改变期望的特性，诸如抗原亲和力和/或特异性。此类变体包括、但不限于用具有类似特性的氨基酸替代一个氨基酸，诸如上表I的保守氨基酸取代。

核酸

本发明进一步包括编码本文公开的犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体和其抗原结合片段的免疫球蛋白链的核酸(参见下述实施例)。

本发明中还包括编码免疫球蛋白多肽的核酸，当通过BLAST算法(其中选择算法的参数以在各个参照序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配)执行对比时，所述免疫球蛋白多肽包含的氨基酸序列与本文提供的CDR和/或犬cFc和/或抗体的氨基酸序列具有至少约70%同一性，优选地至少约80%同一性，更优选地至少约90%同一性和最优选地至少约95%同一性(例如，95%、96%、97%、98%、99%、100%)。本发明进一步提供了编码免疫球蛋白多肽的核酸，当用BLAST算法(其中选择算法的参数以在各个参照序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配)执行对比时，所述免疫球蛋白多肽包含的氨基酸序列与任何参照氨基酸序列具有至少约70%相似性，优选地至少约80%相似性，更优选地至少约90%相似性和最优选地至少约95%相似性(例如，95%、96%、97%、98%、99%、100%)。

本发明还提供了包含本发明的核酸(包括分离的核酸)的表达载体，其中所述核酸可操作连接至控制序列，当用所述载体转染宿主细胞时，所述控制序列被宿主细胞识别。还提供了包含本发明的表达载体的宿主细胞和用于生产本文公开的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在培养基中培养携带编码抗体或抗原结合片段的表达载体的宿主细胞，和从宿主细胞或培养基分离所述抗原或其抗原结合片段。

犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体例如可以通过本领域已知的方法重组产生。可用作用于表达本文公开的抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，且包括从美国典型培养物保藏中心(ATCC)可得的许多无限增殖化的细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平，选择特别优选的细胞系。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系，诸如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分或片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过如下产生抗体：将所述宿主细胞培养足以允许所述抗体在宿主细胞中的表达，或者更优选地，使所述抗体分泌至宿主细胞在其中生长的培养基中的时间段。

使用标准的蛋白纯化方法，可以从培养基回收抗体。此外，可以使用许多已知技术增强本发明的抗体(或来自其的其它部分)从生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是一种用于增强在特定条件下的表达的常见方法。连同欧洲专利号0216 846、0 256 055和0 323 997和欧洲专利申请号89303964.4完整地或部分地讨论了GS系统。

一般而言，在特别的细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有在所述细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白特征性的糖基化模式。因此，抗体的特别的糖基化模式将取决于用于产生所述抗体的特定细胞系或转基因动物。然而，由本文提供的核酸分子编码或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体构成本发明，其不依赖于所述抗体可能具有的糖基化模式。类似地，在具体实施方案中，具有仅包含未岩藻糖基化的

本发明进一步包括本文公开的犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体的抗体片段。所述抗体片段包括F(ab)

在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如，犬恒定区，诸如IgGA、IgGB、IgGC和IgGD犬重链恒定区或其变体。在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如，犬轻链恒定区，诸如

抗体工程改造

本发明的犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体可被工程改造以包括亲本(即，犬)单克隆抗体的犬框架中的修饰，例如以改善抗体的特性，如下文所详述的。

交叉阻断抗体和表位结合

与4F9和/或5F12交叉竞争的交叉阻断抗体及其抗原结合片段，包括犬源化的交叉阻断抗体及其抗原结合片段，是本发明的一部分。此外，与本发明的任何抗-犬PD-L1抗体或其片段结合相同表位的抗体及其抗原结合片段也形成本发明的一部分。交叉阻断抗体和抗原结合片段可以基于它们在标准结合测定(例如，BIACore

肽和融合蛋白疫苗

包含由抗-犬PD-L1 mAb识别的表位(或其部分)的肽和包含此类肽的融合蛋白可以用作引发阻断PD-L1与PD-1的结合的抗体且导致T细胞活化和免疫应答的增强的疫苗。此类疫苗可用作疾病诸如癌症的治疗用疫苗或用作对其它疫苗的免疫应答的增强剂。为了使用这些肽作为疫苗，这些肽中的一种或多种可以化学或通过重组DNA技术的技术与载体蛋白偶联，以增强这些肽的免疫原性且引发肽特异性抗体。用于将肽偶联至载体蛋白的技术是本领域技术人员已知的。肽(和相应的融合蛋白)疫苗可用于通过例如肌内(IM)、皮下(S/C)、口服、喷雾或卵内（

药物组合物和施用

为了制备犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段的药物或无菌组合物，可以将其与药学上可接受的载体或赋形剂混合[参见，例如，

通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，可以制备治疗剂和诊断剂的制剂，所述制剂呈例如冷冻干燥粉末、浆剂、水溶液或悬浮液的形式[参见，例如，Hardman, 等人(2001)

单独地或与另一种试剂组合地施用的抗体组合物的毒性和治疗功效可以通过标准药物操作在细胞培养物或实验动物中确定，例如

施用模式可以变化。合适的施用途径包括口服、直肠、跨粘膜、经肠、肠胃外；肌内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入法、局部、皮肤、经皮或动脉内。在具体实施方案中，可以通过侵袭性途径(诸如通过注射)来施用犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段。在本发明的进一步实施方案中，静脉内地、皮下地、肌内地、动脉内地、肿瘤内地或通过吸入、气溶胶递送，施用鼠抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段或其药物组合物。通过非侵袭性途径(例如，口服地；例如，在丸剂、胶囊或片剂中)的施用也在本发明范围内。

还可以通过输注来施用本文公开的药物组合物。用于施用药物组合物的众所周知的植入物和模块形式的实例包括: 美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以受控的速率分配药物的可植入的微量输注泵；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的可变流可植入的输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多室区室(multi-chamber compartment)的渗透药物递送系统。许多其它此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员众所周知的。

或者，人们可以以局部方式而不是全身方式施用犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体，例如，通过将抗体直接注射进特征在于免疫病理学的关节炎关节或病原体诱导的病灶中，经常在贮库(depot)或持续释放制剂中。此外，可以在靶向药物递送系统中施用抗体，例如，在用组织特异性抗体包被的脂质体中，所述组织特异性抗体靶向例如特征在于免疫病理学的关节炎关节或病原体诱导的病灶。所述脂质体将选择性地靶向患病组织和被患病组织摄入。

施用方案取决于几个因素，包括治疗用抗体的血清或组织周转率、症状的水平、治疗用抗体的免疫原性和靶细胞在生物基质中的可及性。优选地，施用方案递送足够的治疗用抗体以实现靶疾病状态的改善，同时使不希望的副作用最小化。因此，递送的生物制剂的量部分地取决于特定治疗用抗体和要治疗的状况的严重程度。可得到选择治疗用抗体的适当剂量的指南[参见，例如，Wawrzynczak

适当剂量的确定由兽医做出，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗的参数或因素。通常，所述剂量开始于稍微小于最适剂量的量，并且它在此后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用达到期望的或最适的效果。重要的诊断措施包括例如炎症的症状的诊断措施或产生的炎性细胞因子的水平的诊断措施。

可以通过连续输注或通过例如每天1次、每周1-7次、每周1次、每2周1次、每月1次、每2月1次、每季度1次、每半年1次、每年1次等施用的剂量来提供本文公开的抗体或其抗原结合片段。可以例如静脉内地、皮下地、局部地、口服地、鼻地、直肠地、肌内地、大脑内地、脊柱内地或通过吸入提供剂量。总每周剂量通常是至少0.05 μg/kg体重，更通常是至少0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg、10 μg/kg、100 μg/kg、0.25 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0mg/ml、10 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg或更多[参见

如本文中所用，“抑制”或“治疗”或“处理”包括与病症相关的症状的发展的延迟和/或此类病症的症状的严重性的减少。该术语还包括改善既有的不受控制的或不希望的症状，预防另外的症状，和改善或预防此类症状的基础原因。因此，该术语表示，已经给脊椎动物受试者赋予有益的结果，所述脊椎动物受试者具有病症、疾病或症状或具有发展此类病症、疾病或症状的可能。

如本文中所用，术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”指这样的本发明的犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段的量：当单独地或与另外的治疗剂组合地施用于细胞、组织或受试者时，所述量有效地引起疾病或状况的一种或多种症状或此类疾病或状况的进展的可测量的改善。治疗有效剂量进一步指，足以导致症状的至少部分改善的结合化合物的量，例如，相关的医学状况的治疗、治愈、预防或改善，或此类状况的治疗、治愈、预防或改善的速率的增加。当应用于单独施用的个别活性成分时，治疗有效剂量表示单独的该成分。当应用于组合时，治疗有效剂量表示产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合地、连续地还是同时地施用。有效量的治疗剂将导致诊断测量或参数改善至少10%；经常至少20%；优选地至少约30%；更优选地至少40%，和最优选地至少50%。在使用主观测量来评估疾病严重程度的情况下，有效量还可以导致主观测量的改善。

其它组合疗法

如前面所述，犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种其它治疗剂(诸如化疗剂)一起共同施用。所述抗体可以连接至所述试剂(作为免疫复合物)，或可以与所述试剂分开施用。在后一种情况(分开施用)下，所述抗体可以在所述试剂之前、之后或同时施用，或可以与其它已知的疗法一起共同施用。

在具体组合疗法中，犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段可以与犬源化鼠抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段[例如，如公开于2013年12月20日提交的美国临时申请系列号61/918,946以及2014年7月30日提交的美国临时申请序列号62/030,812，2014年12月16日提交的临时申请序列号62/092,496，PCT/EP2014/078655 (WO2015091911)和PCTEP2014/078653 (WO2015/091910)中的，其内容全部以其整体通过引用并入本文]和/或犬源化鼠抗-犬细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)抗体或其抗原结合片段共同施用。因此，可以共同施用这三种犬源化鼠抗-犬蛋白(即，抗-犬PD-L1、PD-1或CTLA-4)抗体或其抗原结合片段的任何组合。例如，犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段可以在犬源化鼠抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段和/或犬源化鼠CTLA-4抗体或其抗原结合片段之前、之后或同时施用。此外，犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段与犬源化鼠抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段和/或犬源化鼠CTLA-4抗体或其抗原结合片段的组合也可以与其它已知的疗法共同施用，即，之前、之后或同时施用。

试剂盒

还提供了试剂盒，其包含一种或多种组分，其包括但不限于如本文所讨论的特异性结合PD-L1的抗体或抗原结合片段(例如，犬源化鼠抗-犬PD-L1抗体或其抗原结合片段)，其与一种或多种额外组分结合，包括但不限于如本文所讨论的犬源化鼠抗-犬PD-1抗体或其抗原结合片段，和/或犬源化鼠抗-犬CTLA-4抗体或其抗原结合片段，药学上可接受的载体和/或化疗剂。在替代实施方案中，所述试剂盒可以包含一种或多种肽，其包含由如上所讨论的抗-犬PD-L1 mAb识别的表位或其部分(或包含表位或其部分的融合蛋白)。结合组合物和/或化疗剂或包含表位或其部分的肽(或包含表位或其部分的融合蛋白)可以配制为纯组合物或与药学上可接受的载体组合于药物组合物中。

在一个实施方案中，所述试剂盒包括一个容器中(例如，无菌玻璃或塑料小瓶中)的本发明的结合组合物，例如犬源化鼠抗-犬PD-L1(或其抗原结合片段)或其药物组合物和/或另一个容器中(例如，无菌玻璃或塑料小瓶中)的其药物组合物和/或化疗剂和/或一个或多个其它容器中(例如，无菌玻璃或塑料小瓶中)的犬源化鼠抗-犬PD-1(或其抗原结合片段)和/犬源化鼠抗-犬CTLA-4(或其抗原结合片段)或其药物组合物。

如果试剂盒包括用于肠胃外施用于受试者的药物组合物，则所述试剂盒也可以包括用于执行此施用的设备。例如，所述试剂盒可以包括一个或多个皮下注射针头或如上面讨论的其它注射设备。所述试剂盒还可以包括包装插页，其包括关于所述试剂盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，此信息帮助宠物主人和兽医有效地和安全地使用包封的药物组合物和剂型。例如，以下关于本发明的组合的信息可以提供在插页中：药物代谢动力学、药物动力学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告信息、预防措施、不良反应、过量给药、适当剂量和施用、供应规格、适当储存条件、参考文献、生产商/分销商信息和专利信息。

为了方便起见，可以将本文公开的抗体或特异性结合剂提供在试剂盒(即，具有关于执行诊断或检测测定的说明书的预定量的试剂的包装组合)中。在用酶标记抗体的情况下，所述试剂盒将包括所述酶需要的底物和辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。另外，可能包括其它添加剂，诸如稳定剂、缓冲剂(例如，封闭缓冲剂或裂解缓冲剂)等。各种试剂的相对量可以宽泛地变化，以提供实质上最优化测定的灵敏度的试剂溶液的浓度。具体地，所述试剂可以提供为干粉，经常是冷冻干燥的，包括赋形剂，其在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液。

实施例

在此以其整体通过引用并入的于2013年12月20日提交的美国临时申请号61/918,946和于2014年7月30日提交的美国临时申请号62/030,812提供了：SEQ ID NO:49的犬PD-1(cPD-1)的全长核苷酸序列[SEQ ID NO:69包括信号序列]；SEQ ID NO:50的对应的翻译的氨基酸序列[SEQ ID NO:70包括信号序列]；编码犬PD-1的胞外结构域(ECD)的核苷酸序列，SEQ ID NO:51；犬PD-1的ECD的氨基酸序列，SEQ ID NO:52；犬PD-1 ECD加GT接头以及人IgG1 Fc基因的Fc部分的核苷酸序列，SEQ ID NO:53；和犬PD-1 ECD加GT接头以及人IgG1Fc基因的Fc部分的氨基酸序列，SEQ ID NO:54[SEQ ID NO:81包括信号序列]。

在此以其整体通过引用并入的于2013年12月20日提交的美国临时申请号61/918,946和于2014年7月30日提交的美国临时申请号62/030,812还提供了：SEQ ID NO:55的犬PD-L1(cPD-L1)的全长核苷酸序列[SEQ ID NO:71包括信号序列]；SEQ ID NO:56的对应的翻译的氨基酸序列[SEQ ID NO:72包括信号序列]；编码犬PD-L1的胞外结构域(ECD)的核苷酸序列，SEQ ID NO:57；犬PD-L1的ECD的氨基酸序列，SEQ ID NO:58；犬PD-L1 ECD加GT接头以及人IgG1 Fc基因的Fc部分的核苷酸序列，SEQ ID NO:59；和PD-L1 ECD加GT接头以及人IgG1 Fc基因的Fc部分的氨基酸序列，SEQ ID NO:60。

通过检索NCBI基因库数据库(登录号XM_543338.4)，鉴定编码全长犬PD-1 (cPD-1)的核酸。翻译的氨基酸序列(登录号XP_543338.3)对应于推定的犬PD-1蛋白，其如下进一步鉴定：检索基因库(NCBI)蛋白数据库，并将鉴定的氨基酸序列与鼠、猫和人PD-1氨基酸序列比对。合成了针对CHO细胞进行了密码子最优化的、与全长犬PD-1基因对应的DNA序列，并将其克隆进命名为p96793的质粒中。预期的犬PD-1的DNA和蛋白序列与已知的PD-1 DNA和蛋白序列的对比导致编码犬PD-1的胞外结构域(ECD)的DNA序列和犬PD-1的ECD的氨基酸序列的鉴定。

合成了除了GT接头和8个组氨酸残基以外还编码犬PD-1的ECD的DNA序列，并将其克隆至命名为LPD2726的质粒中。化学合成了对应于犬PD-1 ECD加GT接头以及人IgG1 Fc基因的Fc部分的核酸序列，并将其克隆至命名为LPD2727的质粒中。犬PD-1 ECD和人IgG1 Fc的Fc部分包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列(包括信号序列)。

通过检索NCBI基因库数据库(登录号XM_541302.4)，鉴定编码全长犬PD-L1的核酸。通过如下鉴定对应于推定的犬PD-L1蛋白的翻译的氨基酸序列(登录号XP-541302.4)：检索基因库(NCBI)蛋白数据库，并将鉴定的序列与已知的PD-L1小鼠和人序列比对。

编码犬PD-L1的DNA与已知的PD-L1序列的比较鉴定出对应于犬PD-L1的ECD结构域的DNA序列(其针对CHO细胞进行了密码子最优化)。犬PD-L1的ECD的预期氨基酸序列是SEQID NO:58。合成了编码PD-L1 ECD加GT接头以及8个组氨酸残基的DNA，并将其克隆至命名为LPD2695的质粒中。

化学合成了编码犬PD-L1 ECD加GT接头以及人IgG1 Fc的Fc部分的氨基酸序列的DNA序列，并将其克隆至命名为LPD2697的质粒中。犬PD-L1 ECD加GT接头以及人IgG1的Fc部分包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。

将编码PD-1ECD-HIS、PD-1ECD-Fc、PDL-L1 ECD-HIS和PD-L1ECD-Fc蛋白的表达质粒转染至HEK 293细胞中，并使用A蛋白(对于Fc融合蛋白)或镍(Ni

全长犬PD-1 DNA序列：信号序列

核苷酸序列SEQ ID NO:49无信号序列。

全长犬PD-1氨基酸序列：信号序列

氨基酸序列SEQ ID NO:50无信号序列

犬PD-1胞外结构域DNA序列：SEQ ID NO:51 (密码子最优化用于在CHO细胞中表达)

犬PD-1胞外结构域：SEQ ID NO:52

犬PD-1胞外结构域 – 人IgG1 Fc DNA序列：SEQ ID NO: 53 (密码子最优化用于在HEK-293细胞中表达)

犬PD-1胞外结构域 – 人IgG1 Fc融合蛋白：信号序列

全长犬PD-L1 DNA序列：信号序列

核苷酸序列SEQ ID NO:55无信号序列。

全长犬PD-L1：信号序列

氨基酸序列SEQ ID NO:56无信号序列

犬PD-L1胞外结构域DNA序列：SEQ ID NO:57 (密码子最优化用于在CHO细胞中表达)

犬PD-L1胞外结构域蛋白：SEQ ID NO:58

犬PD-L1胞外结构域 – 人IgG1 Fc DNA序列：SEQ ID NO:59 (密码子最优化用于在HEK-293细胞中表达)

犬PD-L1胞外结构域 – 人IgG1 Fc融合蛋白：

SEQ ID NO:60

在17天时间段内，将总共三只Balb/c小鼠免疫多次(每次10 µg)。免疫抗原是犬PD-L1 ECD-Fc融合蛋白。在免疫后，从各小鼠采集血清并测试其与犬PD-L1 ECD-HIS标记的蛋白的反应性。将具有最高血清抗-PD-L1 ECD-HIS效价的小鼠的脾细胞与骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞系融合。融合后约2周，通过ELISA测试来自推定杂交瘤细胞的上清液与PD-L1 ECD-HIS标记的蛋白的反应性。将在ELISA中产生强阳性信号的杂交瘤通过有限稀释进行亚克隆并再次测试与犬PD-L1 ECD-HIS标记的蛋白的反应性。

通过ELISA证实由杂交瘤分泌的抗体与犬PD-L1的ECD的反应性。使用CELLine生物反应器(Integra-biosciences)培养杂交瘤细胞10-30天。最初将细胞保持在补充有4 mM L谷氨酰胺和10% 超低IgG胎牛血清(FBS)的DMEM(来自Gibco)中。将杂交瘤细胞以约2x10

将全长犬PD-1基因克隆至质粒p96793中。在该质粒中，PD-1蛋白的表达由hCMV启动子驱动。将CHO DXB11细胞(dhfr-)维持于补充有10%胎牛血清的MEM-α(Gibco)中。通过使用Lipofectamine (Invitrogen)的脂质体介导的基因递送，在含有约6 x10

使用基于表达犬PD-1的CHO细胞系的基于细胞的ELISA(CELISA)测定来证明小鼠抗-犬PD-L1抗体阻断犬PD-L1和其受体犬PD-1之间的相互作用(例如，阻断其结合)的能力。使用连同犬PD-L1/h Fc蛋白一起的该测定证实配体阻断，如下：

1. 在96-孔板中接种cPD-1 CHO细胞，并使细胞生长至95-100％汇合。

2. 将抗-cPDL1 mAb 3倍稀释于CHO培养基中，以30 µg/mL开始，100μL/孔。在CHO培养基中将cPD-L1-hFc添加至4 µg/ml，100μL/孔，在稀释板中在37℃、5% CO

3. 从细胞包被的板上吸出细胞培养基，用PBS + 0.05% Tween20和1x CHO培养基洗板3次。

4. 将来自稀释板的共温育的cPD-L1 mAb/PD-L1 Fc加入细胞包被的板中。100uL/孔。在37℃、5% CO

5. 用PBS + 0.05% Tween 20洗板6次(使用手工洗涤规程)。

6. 在CHO培养基中加入抗-人Fc-HRP (Calbiochem) (1:2500)，100ul/孔，在37℃/5% CO

7. 用PBS + 0.05% Tween20洗板5次(使用手工洗涤规程)。

8. 加入100μl/孔TMB mircowell底物。在室温下温育10分钟。使用来自Pierce的一步底物。

9. 用100μl/孔1.5M磷酸终止。

10. 在ELISA读数器上测量A450 – A620。

使用标准分子生物学方法从每个杂交瘤分离mRNA后，鉴定小鼠VH和VL链的DNA序列和编码其CDR的DNA序列。本文例举的两种抗体的重链和轻链的可变区的序列提供于下表12中。来自这些杂交瘤的CDR的预测氨基酸序列的SEQ ID NO列于下表2中：

为了产生犬源化抗体，有必要鉴定编码犬IgG的重链和轻链的DNA序列。犬重链的核苷酸和氨基酸序列可以获得自NCBI基因和蛋白数据库。存在犬IgG的四种已知IgG亚类：IgGA、IgGB、IgGC和IgGD，以及两种类型的轻链：

不受任何特定方法束缚，产生具有各种犬和小鼠序列含量的抗PDL-1单克隆抗体的变体的方法涉及以下常规方案：

i) 确定小鼠mAb的VH和VL链的核苷酸序列；

ii) 鉴定小鼠mAb的H和L链CDR；

iii) 鉴定合适的犬IgG的H和L链；

iv) 确定犬IgG H和L链的核苷酸序列；

v) 用编码各小鼠CDR的核苷酸序列替代编码内源性犬H和L链CDR的核苷酸序列。另外，任选地用来自小鼠构架区的所选残基替代一些犬构架残基；

vi) 合成来自步骤(v)的核苷酸并将其插入合适的表达质粒中；将质粒转染至适当的细胞(例如，HEK 293细胞)中；

vii) 从HEK 293上清液中纯化表达的抗体；以及

viii) 测试纯化的抗体与犬PD-L1的结合。

实施例4

为了生成缺乏效应子功能的犬IgG变体，生成许多突变犬IgGB重链 [参见，在此以其整体通过引用并入的于2014年7月30日提交的美国临时申请号62/030,812]。这些变体可包括重链氨基酸序列的Fc部分中的下列单个或组合取代之一：P4A、D31A、N63A、G64P、T65A、A93G和P95A。将变体重链(即，含有此类氨基酸取代)克隆至表达质粒中，并连同含有编码轻链的基因的质粒一起转染入HEK 293细胞中。评价从HEK 293细胞表达和纯化的完整抗体与Fc

具有铰链序列的修饰的cFc或天然cFc

铰链区序列

犬PD-1/PD-L1序列

天然cFc序列

CDR氨基酸序列

个别取代的犬源化重链

潜在具体取代是在P4、D31、N63、G64、T65、A93和P95。

氨基酸残基位置的相互关系

个别未取代的犬源化重链和轻链

重链和轻链的可变区

修饰的Fc

cIgGD Fc (D铰链中的S-->P) fab臂交换 [SEQ ID NO:6]

cIgGD Fc (D铰链中的S-->P) fab臂交换 [SEQ ID NO:5]

cIgGD Fc (A铰链) fab臂交换 [SEQ ID NO:8]

cIgGD Fc (A铰链) fab臂交换 [SEQ ID NO:7]

cIgGD Fc (B铰链) fab臂交换 [SEQ ID NO:10]

cIgGD Fc (B铰链) fab臂交换 [SEQ ID NO:9]

cIgGD Fc (C铰链) fab臂交换 [SEQ ID NO:12]

cIgGD Fc (C铰链) fab臂交换 [SEQ ID NO:11]

天然Fc

个别取代的重链

个别未取代的犬源化重链和轻链

4F9-VL3-cL-κ [SEQ ID NO:38]

4F9-VL3-cL-κ [SEQ ID NO:37]

5F12-VL3–cLκ [SEQ ID NO:44]

5F12-VL3–cLκ [SEQ ID NO:43]

小鼠抗-犬PDL-1:4F9的可变区

重链: DNA序列 [SEQ ID NO:73]

重链: 氨基酸序列 [SEQ ID NO:74]

轻链: DNA序列 [SEQ ID NO:75]

轻链: 氨基酸序列 [SEQ ID NO:76]

小鼠抗-犬PDL-1:抗-PDL-1 5F12的可变区

重链: DNA序列 [SEQ ID NO:77]

重链: 氨基酸序列 [SEQ ID NO:78]

轻链: DNA序列 [SEQ ID NO:79]

轻链: 氨基酸序列 [SEQ ID NO:80]

抗体与其相关蛋白抗原的相互作用通过该抗体的特定氨基酸(互补位)与靶抗原的特定氨基酸(表位)的结合来介导。表位是通过免疫球蛋白引起特定反应的抗原决定簇。表位由所述抗原表面上的一组氨基酸组成。目标蛋白可含有几个由不同抗体识别的表位。由抗体识别的表位被分为线性表位或构象表位。线性表位由蛋白中的一段连续氨基酸序列形成，而构象表位由这样的氨基酸构成：所述氨基酸在一级氨基酸序列中是不连续的(例如，相距远)，但在三维蛋白折叠后汇聚在一起。

表位定位指鉴定由抗体在其靶抗原上识别的氨基酸序列(即，表位)的方法。鉴定由单克隆抗体(mAb)在靶抗原上识别的表位具有重要应用。例如，其可以有助于开发新的治疗剂、诊断剂和疫苗。表位定位还可以有助于选择最优化的治疗用mAb并帮助阐明其作用机制。PD-L1上的表位信息还可以阐明独特的癌症表位并定义疫苗的保护或致病作用。表位鉴定还可以基于鉴定的肽表位与载体蛋白或其它免疫刺激剂的化学或遗传偶联导致亚单位疫苗的开发。

表位定位可以使用多克隆或单克隆抗体进行，并且根据表位的疑似性质(即，线性的相比构象的)采用几种方法用于表位鉴定。定位线性表位是更直接的并且相对更容易进行。出于此目的，用于线性表位定位的商业性服务经常采用肽扫描。在这种情况下，化学合成靶蛋白的短肽序列的重叠集合，并测试其结合目标抗体的能力。该策略快速，高通量，并且执行起来相对便宜。另一方面，定位不连续的表位在技术上更有挑战性，并且需要更专门的技术诸如单克隆抗体连同其靶蛋白的X射线共结晶晶体分析法(x-ray co-crystallography)、氢-氘(H/D)交换、与酶促消化偶联的质谱分析法以及本领域技术人员已知的几种其它方法。

采用基于化学交联和质谱法检测的方法来鉴定由抗-犬PD-L1 mAb识别的表位[CovalX

由抗-犬PD-L1 MAB识别的PD-L1表位

本文中引用的所有参考文献都通过引用并入，其程度如同每篇单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被明确地且单独地指出通过引用并入一样。申请人根据37 C.F.R. §1.57(b)(1)意图用该通过引用并入的声明来表示每个和每篇单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，它们中的每一个按照37 C.F.R. §1.57(b)(2)清楚地鉴定，即使此引用不紧接于通过引用并入的专用声明。如果有的话，在说明书中包括的通过引用并入的专用声明不以任何方式弱化该通过引用并入的一般声明。本文中对参考文献的引用无意承认：所述参考文献为相关的现有技术，其也不构成关于这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。

本发明在范围上不受本文描述的具体实施方案限制。实际上，除了本文描述的那些以外，本领域技术人员从前述描述和附图将明白本发明的各种修改。此类修改意图落入所附权利要求的范围内。

前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践本发明。除了本文显示和描述的那些以外，本领域技术人员从前述描述将明白本发明的各种修改，并且所述修改落入所附的权利要求的范围内。

序列表

<110> Intervet, Inc.

Intervet International, BV

Mohamad, Morsey

Yuanzheng, Zhang

Bartels-Morozov, Denise

Erskine, Jason

Tarpey, Ian

<120> 结合犬PD-L1的PD-L1抗体

<130> 23837 WO

<150> 62/057541

<151> 2014-09-30

<150> 62/172511

<151> 2015-06-08

<160> 83

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的犬序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(12)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (91)..(93)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (187)..(195)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (277)..(279)

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<220>

<221> misc_feature

<222> (283)..(285)

<223> n是a、c、g或t

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cagtttnnnn nnnnntatcg cgtggtgagc gtgctgccga ttggccatca ggattggctg 240

aaaggcaaac agtttacctg caaagtgaac aacaaannnc tgnnnagccc gattgaacgc 300

accattagca aagcgcgcgg ccaggcgcat cagccgagcg tgtatgtgct gccgccgagc 360

cgcgaagaac tgagcaaaaa caccgtgagc ctgacctgcc tgattaaaga tttttttccg 420

ccggatattg atgtggaatg gcagagcaac ggccagcagg aaccggaaag caaatatcgc 480

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cataaccatt atacccagga aagcctgagc catagcccgg gcaaa 645

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的犬序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

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<222> (63)..(65)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

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<222> (93)..(93)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (95)..(95)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 2

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Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Xaa Leu

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Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的犬序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(12)

<223> n是a、c、g或t

<220>

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<222> (91)..(93)

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的犬序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

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<222> (31)..(31)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

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<222> (63)..(65)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

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<222> (93)..(93)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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Pro Lys Glu Ser Thr Cys Lys Cys Ile Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu

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Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

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