樟疫霉原生质体遗传转化菌株的筛选及其应用

摘要

本发明公开了樟疫霉原生质体遗传转化菌株的筛选及其转化体系的建立。本发明筛选一株致病性最强的樟疫霉菌株ATC 15400，通过PEG/CaCl2介导的方法将含有筛选标记的绿色荧光蛋白转到樟疫霉菌株ATC 15400基因组中，在G418选择培养基上筛选转化子。本发明实现了稳定高效的樟疫霉原生质体遗传转化，建立了一套完整的遗传转化方法，获得表达绿色荧光信号且稳定遗传的转化子，转化效率高、稳定性好。

说明书

技术领域

本发明属于樟疫霉遗传转化技术领域，具体涉及一种樟疫霉原生质体遗传转化方法。

背景技术

樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)引起的病害是农林生产上的严重病害，对农田、林木、园艺等经济体系造成巨大影响。其寄主范围很广，侵染约5000种植物，对环境和动植物的多样性造成了灾难性的后果。目前，对于樟疫霉的致病机理和寄主之间的互作机制尚不清楚。由于樟疫霉独特的二倍体营养生长特性以及缺少高效的分子遗传操作技术，在分子水平上的研究进展缓慢，而且疫霉种类繁多，同属不同种疫霉在生物学特性、遗传多态性及致病机制等方面存在较大差异，至今鲜少有对樟疫霉的致病机制的报道，这也限制了对樟疫霉侵染和致病机制深入认识。

遗传转化是研究病原菌生长发育与致病分子机制的基本方法和手段。目前已有多种遗传转化技术在疫霉研究生中得到应用，其中包括PEG/CaCl

发明内容

为了建立一套高效、稳定的樟疫霉遗传转化体系，本发明通过筛选后获得了致病性最强的樟疫霉菌株ATC 15400，通过PEG/CaCl

本发明提供了樟疫霉菌株ATCC MYA-4057在樟疫霉原生质体遗传转化中的应用。

进一步地，所述应用包括以下步骤，

步骤A，将樟疫霉菌株ATCC MYA-4057的菌丝置于酶解液中酶解，过滤后收集原生质体，反复离心重悬后取沉淀加入Mmg solution悬浮原生质体，使其终浓度为2×106/mL；

步骤B，将含有荧光标记的质粒DNA加入至步骤A获得的樟疫霉原生质体中于冰上静置10min，然后依次加入PEG溶液及PM培养液，在25℃下静置培养；

步骤C，将步骤B获得的培养液离心，并加入含有70μg/mL G418的P M固体培养基，混匀后倒入培养皿中，25℃培养2-3d；向培养皿中再倒入含70μg/mL G418的V8固体培养基，25℃下黑暗培养2-3d挑出转化子；

步骤D，将转化子转移到含有70μg/mL G418的V8固体培养基中，25℃下黑暗培养，连续培养3代，筛选性状稳定的转化子。

在某些实施例中，所述步骤A中酶解液的制备方法为，取0.06g的纤维素酶和0.15g溶壁酶，加入10mL 0.8M Mannitol，800μL 0.5M KCl，800μL 0.5M MES(pH5.7)，400μL 0.5MCaCl2和8mL dd H2O，再用0.22μm过滤器过滤，即得。

在某些实施例中，所述步骤A中酶解的条件为25℃、60rpm振荡50min。

在某些实施例中，所述步骤A中反复离心重悬的操作为，于4℃，1500rpm离心3min；离心后弃去上清，取沉淀加入35mL的W5 solution轻轻重悬原生质体；于4℃，1500rpm离心4min；再次离心后离心后弃去上清，加10mL的W5 solution轻轻重悬原生质体，在冰上放置30min，于4℃1500rpm离心4min。

在某些实施例中，所述步骤B中依次加入PEG溶液及PM培养液的具体操作为，分3次加580μL的PEG溶液，混匀后冰上放置20min；然后倒入2mL PM培养液，冰上放置2min，倒入8mL PM培养液，冰上放置2min，倒入10mL PM培养液。

在某些实施例中，所述步骤B中静置培养的时间为18-20h。

在某些实施例中，所述质粒为pTOReGFP质粒。

在某些实施例中，所述性状稳定指樟疫霉生活史各阶段都能发出荧光且生长发育没有发生变化。

在某些实施例中，所述樟疫霉菌株ATCC MYA-4057的菌丝获得方法为，将樟疫霉菌丝块接种到NPB固体培养基上，25℃培养2-3d；将菌落边缘切取菌丝块若干，放入装有50mLNPB液体培养基中，在25℃黑暗静置培养2.5d后，过滤收集菌丝。

在某些实施例中，樟疫霉菌丝置于0.8M Mannitol中漂洗俩次后，25℃、60rpm振荡10min后用于转化。

在某些实施例中，所述NPB液体培养基的制备方法为，用1L蒸馏水高压灭菌120克冰冻豌豆，去除残留的豌豆，加入K

在某些实施例中，vitamin stock配方为：Biotin 0.0002g，Folic acid 0.0002g，l-inositol 0.0120g，Nicotinic acid 0.0600g，Pyridoxine-HCl 0.1800g，Riboflavin0.0150g，Thiamine-HCl 0.3800g，Coconut milk 50ml，加ddH

trace elements配方为：FeC

与现有技术相比，本发明实现了樟疫霉原生质体遗传转化菌株筛选及其转化体系的建立，建立了一套完整的遗传转化方法，获得了高强度表达绿色荧光蛋白且稳定遗传的转化菌株，本发明通过改进转化条件包括菌株的筛选、酶解时间、酶解温度、酶解液浓度及抗性筛选浓度，成功获得了具强荧光表达的转化子，转化效率达15％左右。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中11个樟疫霉分离株在3种寄主上造成的平均病斑大小示意图，其中从左到右依次为序号1-11菌株。

图2为实施例3中酶解液酶解菌丝50min后显微镜下效果图。

图3为实施例4中樟疫霉ATCC 15400对G418的抗性检测结果示意图。

图4为实施例4中樟疫霉CBS 144.22对G418的抗性检测结果示意图。

图5为实施例4中樟疫霉Pc-1(7541)对G418的抗性检测结果示意图。

图6为实施例5中GFP转化子图片。

图7为实施例6中转化子绿色荧光蛋白基因的PCR扩增电泳图谱；

图中，M：DNA Marker；WT：樟疫霉野生型；EV：空白载体；GFP：pTOReGFP质粒；PcGFP-1、PcGFP-3、PcGFP-5：GFP转化子。

图8为实施例6转化子荧光显微镜检测结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例中涉及的培养基和缓冲液配方：

V8培养基：取100mL V8汁，CaCO

PM培养基：用1L蒸馏水高压灭菌120克冰冻豌豆，去除残留的豌豆，加入Mannitol91.1g，CaCl

NPB培养基：用1L蒸馏水高压灭菌120克冰冻豌豆，去除残留的豌豆，加入K

其中，vitamin stock配方为：Biotin 0.0002g，Folic acid 0.0002g，l-inositol0.0120g，Nicotinic acid 0.0600g，Pyridoxine-HCl 0.1800g，Ri boflavin 0.0150g，Thiamine-HCl 0.3800g，Coconut milk 50ml，加ddH

trace elements配方为：FeC

酶解液：取0.06g的纤维素酶和0.15g溶壁酶，加入10mL 0.8M Mann itol，800μL0.5M KCl，800μL 0.5M MES(pH5.7)，400μL 0.5M CaCl

PEG solution：PEG4000 24g，H

W5 solution：KCl 0.093g，CaCl

G418购自索莱宝公司。

实施例中涉及载体的来源：

pTOReGFP质粒(含pHAM34启动子，G418抗性)来源于南京农业大学植保院卵菌与真菌分子生物学实验室。

实施例1樟疫霉原生质体遗传转化菌株筛选

(1)用来自不同地区和寄主的11株樟疫霉分离株(表1)进行毒力筛选。将新鲜生长的5mm直径的樟疫霉菌饼接种于定植在杜鹃叶片正面，培养于保湿的培养皿中，25℃培养3d，3天后测量创面周围病变的直径。

(2)在苹果赤道处被刺伤的伤口处(大约5mm深)接种新鲜生长的5mm直径的樟疫霉菌饼，培养于保湿的培养皿中，25℃培养3d，3天后测量创面周围病变的直径。

(3)将10μL游动孢子悬浮液(10

(4)上述测定重复三次。使用Origin 2020计算和分析重复试验测量值的平均值。结果如图1所示，ATCC 15400在所有寄主中致病性最强，同时与其他菌株相比，在每个寄主上也都具有最强的致病性。

表1来自不同地区和寄主的樟疫霉分离株的信息

实施例2樟疫霉菌丝的收集

(1)将实施例1中序号1-6的樟疫霉菌丝块接种到NPB固体培养基上，25℃培养2-3d；

(2)将步骤(1)的菌落边缘切取菌丝块若干，放入装有50mL NPB液体培养基中，在25℃黑暗静置培养2.5d后，过滤收集菌丝，即获得所述樟疫霉菌丝。

实施例3樟疫霉原生质体的制备

(1)将实施例2获得的樟疫霉菌丝置于35mL 0.8M Mannitol中50mL离心管中漂洗俩次后，25℃、60rpm振荡10min；

(2)将漂洗后的樟疫霉菌丝置于20mL酶解液的50mL离心管中，离心管平躺，25℃、60rpm振荡50min，以70μm细胞筛网过滤菌丝收集樟疫霉原生质体后置于50mL离心管中，于4℃，1500rpm离心3min；离心后弃去上清，取沉淀加入35mL的W5 solution轻轻重悬原生质体；于4℃,1500rpm离心4min；再次离心后离心后弃去上清，加10mL的W5 solution轻轻重悬原生质体，在冰上放置30min，于4℃1500rpm离心4min；

(3)收集原生质体，去上清，加入Mmg solution悬浮樟疫霉原生质体，使其终浓度为2×10

实施例4樟疫霉对G418的敏感性测定

选择菌株CBS 144.22、ATCC 15400、Pc-1(7541)接种到V8培养基培养3d后，沿菌落边缘用直径5mm的打孔器打取菌丝块，转接到G418浓度分别在分别为0，10，20，30，40，50，60，70，80和90μg/ml的V8培养基上，置于25℃培养2-3d，观察生长情况并测量菌落大小，其生长结果如图3-5所示。

实施例5樟疫霉的遗传转化

将30μg质粒DNA(30-40μL)加入1mL步骤(A)获得的樟疫霉CBS 144.22、ATCC15400、Pc-1(7541)原生质体中，混匀后冰上静置10min；

然后分3次加580μL的PEG溶液，混匀后冰上放置20min；

然后倒入2mL PM培养液，冰上放置2min，倒入8mL PM培养液，冰上放置2min，倒入10mL PM培养液，在25℃下静置培养19h；

2000rpm离心5min，加入25mL含有70μg/mL G418的PM固体培养基，混匀后倒入培养皿中，25℃培养2-3d；向培养皿中倒入含70μg/mL G418的V8固体培养基，25℃下黑暗培养2-3d挑出转化子，如图4所示；

将转化子转移到加入含有70μg/mL G418的V8固体培养基中，25℃下黑暗培养，连续培养3代，筛选性状稳定的转化子，所述性状稳定是指樟疫霉生活史各阶段都能发出较强的绿色荧光且生长发育没有发生变化。

实施例6樟疫霉转化子的检测

1、PCR检测

(1)转化子基因组DNA的提取

(a)从实施例4获得的转化子菌落上刮取菌丝置于2mL离心管中，加入600μL CTAB和600μL氯仿，振荡混匀，置于28℃，200rpm摇床摇9min；

(b)离心管于4℃13200rpm离心10min，取400μL上清于1.5mL离心管中，加入预冷800μL无水乙醇，4℃13200rpm离心10min；

(c)弃去上清，65℃烘箱10min，加入65℃的25μL ddH

(2)转化子的PCR验证

根据转入的绿色荧光蛋白基因的序列，分别设计一对特异性引物：

SEQ ID NO.1，GFP-F：5’-AGGCTCATTCTCCTTTTCACTC-3’

SEQ ID NO.2，GFP-R：5’-GGCCTTCTTTTGAAAACAATCG-3’

分别以步骤(1)提取的DNA为模板，进行PCR扩增。

PCR反应体系为:模板1μL,10×Taq Buffer 2.5μL，上下游引物各0.4μL，2.5mMdNTP Mix 2.5μL，rTaq 0.25μL，补ddH

PCR反应程序为：94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，循环32次；72℃10min。

PCR扩增后产物经1％琼脂凝胶电泳检测，其如图5所示：图中，M：DNA Marker；WT：樟疫霉野生型；EV：空白载体；GFP：pTOReGFP质粒；PcGFP-1、PcGFP-3、PcGFP-5：GFP转化子。

同时以未进行GFP转化的樟疫霉野生型和空白载体作为阴性对照，其不能扩增出目的条带，pTOReGFP作为阳性对照和其他转化子均可扩增eG FP条带约为500bp，与预期片段大小一致，可以确定转化成功。

2、转化子的荧光显微镜观察

挑取PCR检测为阳性的转化子的菌丝，游动孢子囊，游动孢子和厚垣孢子制成临时玻片，用蔡司荧光显微镜观察发现转化成功的菌丝，游动孢子囊，游动孢子和厚垣孢子都能发出绿色荧光，菌株ATCC 15400转化效率为15％左右，其他菌株效率仅在5％左右。如图6所示。转化子经过G418继代培养后，仍能观察到较强的绿色荧光，切生长发育没有特别变化，表明其具有较高的遗传稳定性。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 樟疫霉原生质体遗传转化菌株的筛选及其应用

<130> 2021

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

aggctcattc tccttttcac tc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

ggccttcttt tgaaaacaat cg 22