一种从骨髓、外周血以及淋巴瘤组织中提取高质量B细胞的方法

摘要

本发明公开了一种从骨髓、外周血以及淋巴瘤组织中提取高质量B细胞的方法，步骤如下：分别取淋巴瘤患者外周血和骨髓，加入羟乙基淀粉，静置留取上清；取与上清等体积的淋巴细胞分离液，将上清加入到淋巴细胞分离液，离心；取离心后的白膜层，洗涤并重悬；取淋巴瘤患者肿瘤组织进行裂解，剪碎组织并孵育；上清转移至含有10％血清的PBS中并反复冲刷组织；再将获得的上清过细胞筛并离心，收集细胞沉淀，洗涤、重悬。本申请通过改变分离纯化骨髓和外周血的实验方法，更高效的提取骨髓和外周血来源的B细胞，减少杂质细胞；通过改变淋巴瘤组织的裂解方法，更温和而有效的提取更多的淋巴瘤细胞，为后续细胞培养和单细胞测序提供必备的细胞基础。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种从骨髓、外周血以及淋巴瘤组织中提取高质量B细胞的方法。

背景技术

恶性淋巴瘤是发生于淋巴结或结外部分淋巴组织的免疫细胞肿瘤，来源于淋巴细胞或组织细胞的恶变。恶性淋巴瘤近年来发病率逐年增高，按发病人数统计，占全部恶性肿瘤的第4-6位，好发于青少年及中老年人群。弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是细胞形态中大形的B细胞恶性肿瘤，呈弥漫性生长。DLBCL是最常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，占NHL总发病率的20-30％。在过去20年中，多项Ⅲ期临床研究显示利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松的联合免疫化疗方案(R-CHOP)可使50-70％的患者受益因而被认为是标准的一线治疗方案。然而，对于R-CHOP方案耐药或复发的患者，仅有10％可通过大剂量免疫化疗联合自体移植获得治愈，多数患者最终因疾病死亡。目前，还没有一个合适的方法能够在诊断时确定R-CHOP耐药的患者。有研究显示，此部分耐药患者表现为MYC和BCL2重排的双打击淋巴瘤或MYC和BCL2同时高表达的双表达淋巴瘤，此类患者临床表现更具侵袭性。

明确恶性淋巴瘤患者肿瘤细胞的生物学特性对于发现潜在的耐药机制以及研发潜在的靶向药物十分重要。目前关于淋巴瘤患者这些畸变的B细胞成熟阶段的信息有限，来自淋巴瘤患者的肿瘤细胞，以及骨髓内B起始细胞，外周血内的异常B淋巴细胞的细胞功能和基因谱数据可能有助于解决这些问题。对淋巴瘤患者的肿瘤细胞，骨髓内的B细胞，以及外周血内的B细胞的深入了解，将对阐明耐药机制和阐明B细胞克隆性进化在肿瘤复发和耐药中的作用具有重要意义。了解淋巴瘤患者的肿瘤细胞的生物学特性也可能为研究新的治疗方法或是对特定基因异常的在肿瘤发生中的作用机制提供新的思路。

目前，虽然从骨髓和外周血中分离纯化有核血细胞的实验技术，以及从肿瘤组织中分离纯化肿瘤细胞的技术已经取得了很大进展，但如何从淋巴瘤患者骨髓、外周血和肿瘤组织中获得高纯度、活性强的B细胞或淋巴瘤细胞方法知之甚少。这也限制了使用单细胞测序技术获得淋巴瘤细胞DNA谱和RNA谱，同时限制了对淋巴瘤细胞克隆起源，克隆演变的认知，导致临床不能针对淋巴瘤细胞的病因给与治疗。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供了一种从骨髓、外周血以及淋巴瘤组织中提取高质量B细胞的方法。

本发明是通过以下技术方案得以实现的。

一种从骨髓、外周血以及淋巴瘤组织中提取高质量B细胞的方法，包括以下步骤：

S1.外周血中B细胞的提取：取淋巴瘤患者外周血，加入羟乙基淀粉，外周血与羟乙基淀粉的体积比为4-5:1，室温放置1-2h，留取上清；取与上清等体积的淋巴细胞分离液，将上清加入到淋巴细胞分离液上，进行离心；取离心后中间的白膜层，洗涤并重悬；

S2.骨髓中B细胞的提取：取淋巴瘤患者骨髓，加入羟乙基淀粉，外周血与羟乙基淀粉的体积比为4-5:1，室温放置1-2h，留取上清；取与上清等体积的淋巴细胞分离液，将上清加入到淋巴细胞分离液上，进行离心；取离心后中间的白膜层，洗涤并重悬；

S3.肿瘤组织中淋巴瘤细胞的提取：取淋巴瘤患者肿瘤组织，加入胶原酶Ⅰ裂解，剪碎组织并在36℃-37℃孵育30-40分钟，边孵育边震荡；上清转移至含有10％血清的PBS中并反复冲刷组织；再将获得的上清过细胞筛并离心，收集细胞沉淀；洗涤细胞沉淀并重悬。

进一步的，步骤S1、S2和S3中，离心条件为23-30℃，1500-1800rpm离心15-20min。

进一步的，步骤S3中，震荡的条件为：200-250rpm/min。

进一步的，所述方法还包括对步骤S3得到的淋巴瘤细胞进行纯化；所述纯化方法为：每10

进一步的，所述方法还包括对步骤S1、S2得到的血细胞以及纯化后的淋巴瘤细胞进行冻存；所述冻存方法为：每5x10

本申请具有以下有益效果。

本发明提取淋巴瘤组织肿瘤细胞的方法，以及提取淋巴瘤患者骨髓、外周血B细胞的方法，具有原料取材容易，制备方法简单易行，生产效率高的特点，且培养获得的淋巴瘤细胞具有高细胞活力，在淋巴瘤原代细胞培养，靶向药物筛选，基因检测方面具有较大潜能和应用价值。

附图说明

图1是流式检测本发明方法体外分离1号患者外周血中各类细胞情况图；

图2是流式检测本发明方法体外分离2号患者外周血中各类细胞情况图；

图3是流式检测本发明方法体外分离1号患者骨髓中各类细胞情况图；

图4是流式检测本发明方法体外分离2号患者骨髓中各类细胞情况图；

图5是流式检测本发明方法体外分离1号患者肿瘤组织中淋巴瘤细胞情况图；

图6是流式检测本发明方法体外分离2号患者肿瘤组织中淋巴瘤细胞情况图。

具体实施方式

实施例1获得淋巴瘤患者外周血血细胞

取5ml新鲜淋巴瘤患者外周血，加入羟乙基淀粉(外周血：羟乙基淀粉＝5:1)，室温放置1h。取上清(白细胞层)，除去下层红细胞。

在离心管中加入与上清等体积的淋巴细胞分离液，将上清小心转移至分离液之上(轻柔操作避免打破交界液面)；离心1800rpm，30摄氏度，15分钟；离心后溶液分层，上清为血清，吸取后转移至新离心管(备用)；中间为白膜层(即淋巴细胞层)，吸取后转移至新离心管中。室温PBS清洗三次，用1ml PBS重悬。(表1为1号患者新鲜外周血中各类细胞情况，表2为2号患者新鲜外周血中各类细胞情况)

表1 1号患者5ml外周血中各类细胞情况

备注：CD3：T细胞；CD19：B细胞；CD33：髓系细胞；CD45：白细胞

表2 2号患者5ml外周血中各类细胞情况

备注：CD3：T细胞；CD19：B细胞；CD33：髓系细胞；CD45：白细胞

实施例2测定淋巴瘤患者外周血中B细胞以及其他血细胞浓度

取上述1x10

实施例3获得淋巴瘤患者骨髓内血细胞

取3ml新鲜淋巴瘤患者骨髓，加入羟乙基淀粉(外周血：羟乙基淀粉＝5:1)，室温放置1h。取上清(白细胞层)，除去下层红细胞。

在离心管中加入与上清等体积的淋巴细胞分离液，将上清小心转移至分离液之上(轻柔操作避免打破交界液面)；离心1800rpm，30摄氏度，15分钟；离心后溶液分层，中间为白膜层(即淋巴细胞层)，吸取后转移至新离心管中。室温PBS清洗三次，用1ml PBS重悬。(表3为1号患者新鲜骨髓中各类细胞情况，表4为2号患者新鲜骨髓中各类细胞情况)

表3 1号患者5ml骨髓中各类细胞情况

备注：CD3：T细胞；CD19：B细胞；CD33：髓系细胞；CD45：白细胞

表4 2号患者5ml骨髓中各类细胞情况

备注：CD3：T细胞；CD19：B细胞；CD33：髓系细胞；CD45：白细胞

实施例4测定淋巴瘤患者骨髓中B细胞以及其他血细胞浓度

取上述1x10

实施例5获得淋巴瘤患者肿瘤组织中淋巴瘤细胞

取小米粒大小肿瘤组织，放入无菌的1.5ml EP管中，加入100ul collagenaseⅠ裂解，使用眼科外科剪刀充分剪碎组织，放入36.5℃水浴锅中孵育30分钟，边孵育边震荡250转/分钟。上清转移至含有10％血清的PBS中；同时，用10％血清的PBS反复冲刷组织，把上清转移到无菌的离心管中。

把上清过细胞筛，转移到新的无菌的离心管中。15000转/分钟离心，收集细胞沉淀。用10％血清的PBS清洗细胞三次，重复15000转/分钟离心，收集细胞沉淀三次。用1ml10％血清的PBS重新悬浮细胞。细胞计数。(表5为1号患者新鲜肿瘤组织中各类细胞情况，表6为2号患者新鲜肿瘤组织中各类细胞情况)

表5 1号患者0.5mg肿瘤组织中淋巴瘤细胞情况

备注：CD3：T细胞；CD19：B细胞；CD33：髓系细胞；CD45：白细胞

表6 2号患者0.5mg肿瘤组织中淋巴瘤细胞情况

备注：CD3：T细胞；CD19：B细胞；CD33：髓系细胞；CD45：白细胞

实施例6测定淋巴瘤患者肿瘤组织中淋巴瘤细胞比例

取上述细胞悬液1x10

实施例7细胞计数

在显微镜下观察骨髓、外周血和肿瘤组织来源的细胞状态为通透，折光性好的活细胞。细胞计数见(见表1-表6)。可见，通过本方法，可以从微量组织中获得足够的血细胞和淋巴瘤细胞。

实施例8获得肿瘤组织中高纯度淋巴瘤细胞

每10

实施例9淋巴瘤组织肿瘤细胞/骨髓血细胞/外周血血细胞冻存待用

每10

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。