公开/公告号CN112852746A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-05-28
原文格式PDF
申请/专利权人 中吉智药(南京)生物技术有限公司;
申请/专利号CN202110157755.2
申请日2021-02-04
分类号C12N5/10(20060101);C12N15/867(20060101);C12N15/866(20060101);C12N15/66(20060101);C12N15/12(20060101);C12N15/52(20060101);C12N7/01(20060101);C07K14/47(20060101);
代理机构11613 北京易捷胜知识产权代理事务所(普通合伙);
代理人齐胜杰
地址 211199 江苏省南京市江北新区新锦湖路3-1号中丹生态生命科学产业园一期A座618室
入库时间 2023-06-19 11:08:20
技术领域
本发明涉及基因药物技术领域,尤其涉及一种基于Cre重组酶诱导的大规模慢病毒基因药物制备系统及方法。
背景技术
基因治疗药物是生物医药的重要组成部分,有机会在人类历史上首次实现从根本上治愈罕见遗传病和癌症,也有潜力大幅度改善现有心血管疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病等传统药物治疗效果不佳、治疗方式繁琐等固有疾病。
目前全球细胞和基因治疗的新药已有7款上市,未来十年将有数十个新药上市,总产值将突破千亿美元。目前已上市的产品中有3款是基于慢病毒载体的基因药物:其中2款针对淋巴瘤的Car-T药物和1款治疗β地中海贫血的基因药物Zynteglo(Bluebird Bio)。目前基因药物价格昂贵,病毒载体的生产成本是关键因素。
重组慢病毒的产生方式是将慢病毒的基因组分成3个或4个部分,分别装到不同的质粒载体中,利用质粒载体转染贴壁或悬浮培养的HEK293细胞,包装重组慢病毒。目前基于安全性考虑,临床上普遍应用4个质粒载体的生产系统。如图1所示。
临床级慢病毒的生产,目前国际上仍然没有理想的解决方案,瞬时转染的方法无论是贴壁细胞还是悬浮细胞都需要大量的临床级质粒载体。质粒载体的生产需要单独的生产线,同时在法规和工艺等方面都面临着巨大的挑战。此外,贴壁细胞的培养很难工业化放大,且成本极高。悬浮细胞培养相比贴壁细胞培养更容易利用生物反应器进行放大,但质粒的转染效率会大大降低。为了避免上述问题,科学家们把目光转向诱导性系统。其中研发比较成熟的是四环素诱导体系,但四环素的添加和去除是临床级慢病毒生产和纯化的难点,此方法目前仍然没有被大规模应用。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足,本发明提供一种基于Cre重组酶诱导的大规模慢病毒基因药物制备系统及方法,其解决了质粒瞬时转染成本高,放大困难的问题;同时利用表达Cre基因的病毒感染进行诱导,避免四环素等抗生素诱导后难以去除的工艺难题。
(二)技术方案
为了达到上述目的,本发明采用的主要技术方案包括:
第一方面,本发明提供一种基于Cre重组酶诱导的大规模慢病毒基因药物制备方法,其包括:
S1:构建用于产慢病毒的悬浮稳转细胞株;该悬浮稳转细胞株的基因组上稳定整合了慢病毒包装蛋白表达序列和目的基因序列,且所述慢病毒包装蛋白表达序列与驱动其表达的启动子之间插入loxP-Stop-loxP序列;loxP-Stop-loxP序列包含两个方向相同的loxP位点以及连接在两个loxP位点之间的Stop序列;
S2:构建表达Cre重组酶的病毒;
S3:大规模扩增、培养所述稳转细胞株;
在需要生产慢病毒颗粒时,利用该表达Cre基因的病毒感染所述悬浮稳转细胞株,利用该病毒表达的Cre重组酶切除loxP-Stop-loxP序列的Stop序列,以诱导慢病毒包装蛋白表达序列得以表达,从而包装表达目的基因的重组慢病毒颗粒,该重组慢病毒颗粒即为病毒基因药物。
其中,所述表达Cre基因的病毒为任何一种可感染悬浮293细胞且能够表达Cre蛋白的病毒。实际生产中,由于杆状病毒是复制型病毒,生产起来比较方便,因而可使用表达Cre基因的杆状病毒来实现。
根据本发明较佳实施例,步骤S1中,在构建悬浮稳转细胞株时,先分别构建表达gag-pol的质粒和表达VSV.G的质粒,该表达gag-pol的质粒包含启动子和gag-pol基因序列,且在启动子和gag-pol基因序列之间插入loxP-Stop-loxP序列,该表达VSV.G的质粒包含启动子和VSV.G基因序列,且在启动子和VSV.G基因序列之间插入loxP-Stop-loxP序列;然后(通过PiggyBac载体)将表达gag-pol的质粒和表达VSV.G的质粒整合到该悬浮细胞基因组上。
根据本发明较佳实施例,步骤S1中,在构建稳转细胞株时,在目的基因序列与驱动其表达的启动子之间插入loxP-Stop-loxP序列以构建目的基因质粒,再(通过PiggyBac载体)将该目的基因质粒整合到悬浮细胞株的基因组上。
根据本发明较佳实施例,步骤S1中,构建悬浮293稳转细胞株的步骤包括:S11、构建如下三种质粒:
gag-pol质粒:piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-gag-pol、
VSV.G质粒:piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-VSV.G和
目的质粒:piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-Target Gene质粒;
S12、构建悬浮293稳转细胞株:将获得的上述三种质粒,通过转染进入悬浮239细胞,并使用含有抗生素的培养基进行筛选,获得抗性细胞,该抗性细胞中即包含用于产慢病毒的239悬浮稳转细胞。
根据本发明的较佳实施例,步骤S11中在构建所述质粒时,包括如下步骤:
①将piggybac-dual-promoter质粒用限制性内切酶SnaBI和HindIII进行双酶切,琼脂糖电泳后切胶回收piggybac-dual-promoter载体片段;
②设计用于无缝克隆的CBA(启动子)序列片段(序列如SEQ ID NO:1所示)、loxp-stop-loxp序列片段(序列如SEQ ID NO:2所示)、和gag-pol序列(序列如SEQ ID NO:4所示)或VSV.G(序列如SEQ ID NO:5所示)或Target Gene序列片段;
③然后将piggybac-dual-promoter载体片段、CBA序列片段及loxp-stop-loxp片段,分别与gag-pol或VSV.G或Target Gene序列片段采用无缝克隆试剂盒进行连接;
④将连接产物转化感受态trans1-t1,混匀、冰浴、热休克、立即再次冰浴,先用无抗生素培养液培养,再将菌液涂布至含有氨苄青霉素的平板培养基中继续培养;挑取单克隆菌落接种到含有氨苄青霉素的液体培养液中振荡培养,提取质粒,并用XbaI和HpaI双酶切鉴定后进行测序鉴定,获得目标质粒。
根据本发明较佳实施例,步骤S1中,所述Target Gene为密码子优化的COL7A1基因,其序列如SEQ ID NO:7所示。
根据本发明较佳实施例,S2中,所述表达Cre重组酶的病毒为杆状病毒,其构建方法为:
先将Cre基因表达序列(如SEQ ID NO:6所示)无缝克隆至pFast Bac1质粒(invitrogen,Cat.No.10359-016)中,构建构带有Cre表达盒的杆状病毒质粒pFast-Bac-Cre;然后将该pFast-Bac-Cre质粒转化DH10bac感受态细胞,获取Bacmid-Cre,再用Bacmid转染Sf9细胞,转染预定时间后,收集上清,获得表达Cre重组酶的杆状病毒Baculovirus-Cre。
根据本发明较佳实施例,S2中,pFast-Bac-Cre质粒的构建方法为:
(1)将pFast Bac1质粒用限制性内切酶SnaBI和HpaI于37℃±0.5进行双酶切50-70min,琼脂糖电泳后切胶回收pFast Bac1载体片段,将回收的pFast Bac1载体片段用碱性磷酸酶CIAP于50℃±2进行去磷处理50-70min,用65℃±2进行灭活处理10-25min;
(2)将碱性磷酸酶处理的pFast Bac1载体片段和含有Cre表达盒基因片段采用无缝克隆重组酶连接,50℃±2反应8-15min,得到无缝连接重组产物;
(3)取无缝连接重组产物转化感受态DH5a,混匀,冰浴、热休克,立刻再次冰浴,使用无抗生素的培养液振荡培养后,将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的平板培养基上,37℃±0.5倒置培养12-18h;
(4)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素的液体培养液中,37℃±0.5振荡12-18h;提取pFast-Bac-Cre质粒,进行SnaBI和HpaI双酶切鉴定后进行测序鉴定,构建得到带有Cre表达盒的杆状病毒质粒。
根据本发明较佳实施例,S2中,表达Cre重组酶的杆状病毒Baculovirus-Cre的制备方法为:
(1)将pFast-Bac-Cre质粒转化至DH10Bac感受态细胞:取pFast-Bac-Cre质粒转化感受态DH10Bac,轻轻混匀,冰浴25-35min;42℃±0.5热休克40-50s,立刻冰浴2-5min,加入无抗生素的LB培养液37℃±0.5振荡40-80min,用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB琼脂平板上,37℃±0.5倒置培养24-32h;
(2)挑取白色单克隆接种于含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的液体培养液中,37℃±0.5振荡14-18h,用酚氯仿抽提法提取Bacmid-Cre,获取Bacmid-Cre的用PCR方法进行鉴定;
(3)用孔板细胞板,按照1x10^6细胞/孔,每孔用20±1μl Bacmid-Cre转染Sf9细胞,转染后6-8h换液,转染后96h收集上清,获得携带Cre表达盒的杆状病毒。
根据本发明较佳实施例,步骤S3包括:扩增培养悬浮293稳转株细胞系至预定密度,用Baculovirus-Cre按照MOI1感染悬浮293稳转株细胞系,感染72h后,收集细胞上清,层析纯化,得到表达目的基因的慢病毒。
第二方面,本发明提供一种基于Cre重组酶诱导的大规模慢病毒基因药物制备系统,其包括:
悬浮293稳转细胞株和表达Cre基因的病毒;
所述悬浮293稳转细胞株的基因组上整合了慢病毒包装蛋白表达序列和目的基因序列;且所述慢病毒包装蛋白表达序列与驱动其表达的启动子之间插入loxP-Stop-loxP序列;loxP-Stop-loxP序列包含两个方向相同的loxP位点以及连接在两个loxP位点之间的Stop序列;
所述表达Cre基因的病毒为可感染悬浮293细胞且能够表达Cre蛋白的病毒;所述表达Cre基因的病毒用于感染所述悬浮293稳转细胞株,激活慢病毒包装蛋白表达序列进行表达,以包装产生慢病毒。
所述表达Cre基因的病毒可使用杆状病毒,杆状病毒为复制型病毒,易于大量生产。
优选地,所述悬浮293稳转细胞株中,所述目的基因序列与驱动其表达的启动子之间插入loxP-Stop-loxP序列。
优选地,所述目的基因为密码子优化的COL7A1基因,其序列如SEQ ID NO:7所示。此时,制备的慢病毒颗粒为治疗营养不良型大疱性表皮松解症的慢病毒基因药物。
(三)有益效果
本发明的技术效果主要为:
本发明利用Cre-loxP重组系统介导的诱导型慢病毒产生系统。摆脱质粒瞬时转染成本高,放大困难的问题。此外,本发明利用病毒感染进行诱导,避免四环素等抗生素诱导后难以去除的工艺难题。
优选在构建稳转细胞株时,在目的基因序列与驱动其表达的启动子之间同样也插入loxP-Stop-loxP序列以构建目的基因质粒,再将该目的基因质粒整合到悬浮细胞株的基因组上。可避免构建的悬浮稳转细胞株在扩增培养过程中持续大量表达外源蛋白给细胞带来的压力,抑制悬浮稳转细胞的增长和培养密度。
附图说明
图1为现有技术中重组慢病毒的产生方法示意图。
图2为采用携带Cre基因的杆状病毒感染悬浮293稳转株前后,用Western Blot检测悬浮293稳转株细胞裂解液中慢病毒包装蛋白gag-pol和VSV.G的表达水平的比对结果,其中-表示感染前,+表示感染后。
图3为使用携带Cre基因的杆状病毒感染悬浮293稳转株前后,从悬浮293稳转株细胞上清液中层析纯化慢病毒,以慢病毒感染靶细胞(239T),用荧光显微镜观察靶细胞(239T)的荧光变化;其中Cre(-)表示感染前,Cre(+)表示感染后。
具体实施方式
为了更好的解释本发明,以便于理解,下面结合附图,通过具体实施方式,对本发明作详细描述。
本发明的技术方案的主要思路和原理如下:
Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme)是由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因所编码、由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性,而且与限制酶相似,能够特异性识别loxP位点。LoxP(locus ofX-overP1)位点长为34bp,包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中,反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点,而间隔区域决定了loxP位点的方向。当基因组内存在loxP位点时,一旦遇到Cre重组酶,Cre重组酶便会结合到loxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合,进而形成四聚体。随后,介于两个loxP位点之间的DNA被Cre重组酶切下,切口在DNA连接酶的作用下重新连接。
基于上述原理,本发明是将Stop序列置于两个方向相同的loxP位点之间组成loxP-Stop-loxP序列,组成一个可被Cre重组酶诱导激活的开关序列,然后将loxP-Stop-loxP序列置于慢病毒包装蛋白表达序列(gag-pol或VSV.G等)的前面(在驱动慢病毒包装蛋白表达序列(gag-pol或VSV.G等)表达的启动子后面),由此得到一种可被Cre重组酶激活诱导的质粒结构,然后将这种质粒通过PiggyBac载体系统整合到悬浮293细胞基因组上。如此得到的悬浮293细胞在无Cre重组酶的情况下不表达慢病毒包装蛋白,避免慢病毒包装蛋白的细胞毒性抑制悬浮293细胞的生长,有利于悬浮293细胞的规模化扩增和培养。此外,构建表达Cre重组酶的病毒,以该表达Cre重组酶的病毒感染稳定整合的悬浮293细胞(即其基因组上整合了前置loxP-Stop-loxP序列的慢病毒包装蛋白表达序列),利用Cre重组酶loxP-Stop-loxP序列中的Sotp序列,以激活连在loxP-Stop-loxP序列后面的慢病毒包装蛋白表达序列(gag-pol或VSV.G等)得以表达,包装出重组慢病毒。
现以目的基因为G2P(GFP-T2A-Puro)为例,对本发明方案、可实现性和技术效果验证进行说明。实施方法如下:
一、构建悬浮293稳转细胞株
在构建悬浮293稳转细胞株之前,需要先构建三种质粒,分别是目的基因质粒、慢病毒包装蛋白gag-pol质粒、慢病毒包装蛋白VSV.G质粒等三种质粒,然后以这三种质粒通过转染进入悬浮293细胞中,用抗生素筛选出整合到悬浮293细胞基因组的细胞系。具体方法和步骤如下:
(一)构建piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-G2P质粒,其过程为:
(1)将piggybac-dual-promoter质粒(优宝生物,VT1663)用限制性内切酶SnaBI和HindIII于37℃进行双酶切30min,琼脂糖电泳后切胶回收piggybac-dual-promoter载体片段。
(2)设计用于无缝克隆的CBA序列片段(序列为SEQ ID NO:1),loxp-stop-loxp序列片段(序列为SEQ ID NO:2)和G2P(GFP-T2A-Puro)序列片段(序列为SEQ ID NO:3)。
(3)将胶回收试剂盒分别回收的piggybac-dual-promoter载体片段和CBA片段以及loxp-stop-loxp片段,采用CloneSmarter的无缝克隆试剂盒进行连接,10ul体系50℃反应15min。
(4)将5ul连接产物转化至大肠杆菌:连接产物转化感受态trans1-t1,轻轻混匀,冰浴20min;42℃热休克80s,立刻冰浴5min,加入无抗生素的LB培养液37℃振荡约60min,用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上,37℃倒置培养14h。
(5)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中,37℃振荡16h;用axygen质粒提取试剂盒提取piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-G2P质粒,进行XbaI和HpaI(KspAI)双酶切鉴定后进行测序鉴定,获得piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-G2P质粒。
(二)构建piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-gag-pol质粒,其过程为:
(1)为了简便,取上述构建的piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-G2P质粒用限制性内切酶HpaI(KspAI)和HindIII于37℃进行双酶切30min,琼脂糖电泳后切胶回收piggybac-CBA-loxp-stop-loxp载体片段。
(2)设计无缝克隆引物gag-pol-F
(GCTGGCGCGAGCTGGTCGACAAGCTgaattcgggccgcgtt)和gag-pol-R(Taaccattataagctgcaataaacaagttaactgagagacacaaaaaattcc),将gag-pol片段(序列为SEQ ID NO:4)从psPAX2质粒载体(addgene plasmid#12260)进行PCR扩增,琼脂糖电泳后切胶回收gag-pol片段。
(3)将胶回收试剂盒分别回收的piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-G2P载体片段和gag-pol片段,采用CloneSmarter的无缝克隆试剂盒进行连接,10ul体系50℃反应15min。
(4)将5ul连接产物转化至大肠杆菌:连接产物转化感受态trans1-t1,轻轻混匀,冰浴20min;42℃热休克80s,立刻冰浴5min,加入无抗生素的LB培养液37℃振荡约60min,用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上,37℃倒置培养14h。
(5)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中,37℃振荡16h。
(6)用axygen质粒提取试剂盒提取piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-gag-pol质粒,进行NdeI和HpaI(KspAI)双酶切鉴定后进行测序鉴定,获得piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-gag-pol质粒。
(三)构建piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-VSV.G质粒,其过程为:
(1)为了简便,取上述构建的piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-G2P质粒用限制性内切酶HpaI(KspAI)和HindIII于37℃进行双酶切30min,琼脂糖电泳后切胶回收piggybac-CBA-loxp-stop-loxp载体片段。
(2)设计无缝克隆引物VSV.G-F
(GCTGGCGCGAGCTGGTCGACAAGCTgaattctgacactatgaagtgcct)和VSV.G-R(aaccattataagctgcaataaacaagttaactaaaatacagcatagcaaaac),将VSV.G片段(序列为SEQ ID NO:5)从pMD2.G质粒载体(addgene plasmid#12259)进行PCR扩增,琼脂糖电泳后切胶回收VSV.G片段。
(3)将胶回收试剂盒分别回收的piggybac-CBA-loxp-stop-loxp载体片段和VSV.G片段,采用CloneSmarter的无缝克隆试剂盒进行连接,10ul体系50℃反应15min。
(4)将5ul连接产物转化至大肠杆菌:连接产物转化感受态trans1-t1,轻轻混匀,冰浴20min;42℃热休克80s,立刻冰浴5min,加入无抗生素的LB培养液37℃振荡约60min,用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上,37℃倒置培养14h。
(5)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中,37℃振荡16h
(6)用axygen质粒提取试剂盒提取piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-VSV.G质粒,进行XbaI和HpaI(KspAI)双酶切鉴定后进行测序鉴定,获得piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-VSV.G质粒。
(二)将上述三个质粒,转染进入悬浮293细胞中,筛选符合要求的细胞株作为生产慢病毒的稳转株
稳定细胞系筛选是将质粒通过转染进入悬浮293细胞中,筛选出整合到悬浮293细胞基因组的Cell pool,具体步骤如下:
(1)将293细胞以2x10^6/孔铺一块35mm平皿,37℃培养1h;
(2)取piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-G2P质粒,piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-gag-pol质粒和piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-VSV.G质粒各2μg用Grace培养基稀释至100μl,轻弹混匀,室温静置5min,取8μl CellfectinII转染试剂用Grace培养基稀释至100μl,轻弹混匀,室温静置5min,稀释的转染试剂加入稀释的质粒中,轻弹混匀,室温静置15min。
(3)将转染试剂质粒混合物加入293细胞中,于37℃培养6h后换成新鲜的培养基。
(4)转染后24h,293细胞换成含有8μg/ml Puromycin的培养基,继续于37℃培养,每三天换新鲜的8μg/ml Puromycin的培养基,直至细胞不再出现死亡,存活的细胞均为抗Puromycin的细胞,至此获得诱导型产慢病毒的悬浮293细胞系。
在本实施例中,没有对所述三个质粒转染成功逐一进行筛选,但抗Puromycin的细胞中必然包含已稳定整合了上述三个质粒的悬浮293细胞株,因此筛选出的抗Puromycin的细胞可用作为产慢病毒的悬浮细胞(参见下文中的验证过程)。
在其他实施例和实际上生产中,可根据实际情况对三个质粒进行逐一转染和逐一筛选确认,以筛选出稳定整合了所述三个质粒的悬浮293细胞株。
二、构建表达Cre重组酶的杆状病毒
事实上,任何可感染293细胞且能够表达Cre重组酶的病毒都可以作为感染病毒。在实际上生产中考虑到成本和工艺性,选择复制型的杆状病毒作为表达Cre重组酶的载体。表达Cre重组酶的杆状病毒的构建过程包括pFast-Bac-Cre质粒的构建和重组获得表达Cre重组酶的杆状病毒。过程如下:
(一)构建pFast-Bac-Cre质粒
将合成的Cre基因表达序列(序列为SEQ ID NO:6)无缝克隆至pFast Bac1质粒(invitrogen,Cat.No.10359-016)中,得到pFast-Bac-Cre质粒;该克隆过程包括如下步骤:
(1)将pFast Bac1质粒用限制性内切酶SnaBI和HpaI于37℃进行双酶切1h,琼脂糖电泳后切胶回收pFast Bac1载体片段,回收后的pFast Bac1载体片段用碱性磷酸酶CIAP于50℃进行去磷处理60min,用65℃进行灭活处理15min。
(2)将碱性磷酸酶处理的pFast Bac1载体片段和含有Cre表达盒基因片段,采用无缝克隆重组酶连接,50℃反应10min,得到无缝连接重组产物。
(3)取无缝连接重组产物转化感受态DH5a,轻轻混匀,冰浴30min;42℃热休克80s,立刻冰浴4min,加入无抗生素的LB培养液37℃振荡60min,用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上,37℃倒置培养14h。
(4)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中,37℃振荡16h;用质粒提取试剂盒提取质粒pFast-Bac-Cre质粒,进行SnaBI和HpaI双酶切鉴定后进行测序鉴定,至此带有Cre表达盒的杆状病毒质粒构建成功。
(二)重组获得表达Cre重组酶的杆状病毒
用pFast-Bac-Cre质粒转化DH10bac感受态细胞,获取Bacmid-Cre,随后用Bacmid转染Sf9细胞,转染预定时间后,收集上清,获得Baculovirus-Cre。具体过程包括如下步骤:
(1)将pFast-Bac-Cre质粒转化至DH10Bac感受态细胞:取pFast-Bac-Cre质粒转化感受态DH10Bac,轻轻混匀,冰浴30min;42℃热休克45s,立刻冰浴4min,加入无抗生素的LB培养液37℃振荡60min,用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB琼脂平板上,37℃倒置培养28h。
(2)挑取白色单克隆接种于含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的LB液体培养液中,37℃振荡16h,用酚氯仿抽提法提取Bacmid-Cre,获取Bacmid-Cre的用PCR方法进行鉴定。
(3)按照2×10
三、杆状病毒感染悬浮293细胞产慢病毒的诱导型系统的验证
验证包括两部分,一部分是杆状病毒感染悬浮293细胞后,细胞中慢病毒包装蛋白的表达验证;另一部分是杆状病毒感染悬浮293细胞后,上清液的层析纯化产生的慢病毒感染靶细胞后目的基因表达的验证。
(一)、利用携带Cre重组酶表达盒的杆状病毒感染稳定整合慢病毒包装系统的悬浮293细胞,Western Blot检测感染前后慢病毒包装组分的表达。结果如图2所示,感染前由于loxp-stop-loxp的存在gag-pol和VSV.G均无表达。感染后明显表达。过程包括如下步骤:
(1)按照2×10
(2)配制10%SDS-PAGE胶,将裂解液用BCA法进行蛋白浓度测定,向6%SDS-PAGE胶中加入相同蛋白量的细胞裂解液,用80V的电压跑至压缩胶与分离胶交界处,用120V电压跑至胶的底部。
(3)用400mA恒定电流将含有蛋白的SDS-PAGE胶转至NC膜上。
(4)将转有蛋白的NC膜用5%脱脂牛奶在室温孵育1h,用TBST清洗膜3次,每次5min。
(5)用gag-pol和VSV.G蛋白的一抗于4℃孵育过夜。
(6)第二天用TBST清洗膜3次,每次10min,用含有HRP的二抗室温孵育1h,用TBST清洗膜3次,每次5min。
(7)用ECL法进行显影,获得感染前后gag-pol和VSV.G的表达水平比较结果。结果如图2所示,在感染后可以清楚看到gag-pol和VSV.G的表达。
说明利用携带Cre重组酶表达盒的杆状病毒感染稳定整合慢病毒包装系统的悬浮293细胞,可以激活慢病毒包装蛋白gag-pol和VSV.G序列进行表达。
(二)、利用携带Cre重组酶表达盒的杆状病毒感染稳定整合慢病毒包装系统的悬浮293细胞,收集感染前后的悬浮293细胞的培养基上清,纯化重组慢病毒,感染靶细胞(293T细胞)。过程包括如下步骤:
(1)将整合gag-pol,VSV.G和GFP的悬浮293细胞系扩增至细胞密度达到1×10
(2)用已经测好基因组滴度的Cre重组酶杆状病毒,以MOI1感染细胞系,感染后72h后收集细胞培养基上清。
(3)纯化采用GE的AKTA avant层析系统,采用DEAE层析,切向流过滤和core700层析纯化工艺,纯化得表达GFP的慢病毒。
(4)以MOI1为0.1感染靶细胞,进行流式分析和荧光显微镜观察。
用流式细胞仪检测GFP的阳性率,感染前无阳性细胞,感染后阳性率为46%。用荧光显微镜观察,结果如图3所示,Cre重组酶感染悬浮293细胞后,从上清收集、层析纯化的慢病毒感染靶细胞后,出现荧光,说明慢病毒中携带的目的基因G2P通过感染靶细胞,在靶细胞中得到表达。由此证明,本发明方法制备的重组慢病毒具有感染靶细胞并在靶细胞中表达目的基因的能力。
上述实施例是以目的基因为G2P为例所进行的说明。在实际生产应用制备慢病毒基因药物时,根据治疗需求可以携带不同的目的基因,以达到特定的治疗目的。因而,在上述实施例的基础上,目的基因质粒可以用通式piggybac-CBA-loxp-stop-loxp-TargetGene来表示,其中,Target Gene可以是各种目的基因,例如Target Gene是COL7A1基因(序列为SEQ ID NO:7),可以由此生产出治疗营养不良型大疱性表皮松解症的慢基因药物。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 中吉智药(南京) 生物技术有限公司
<120> 基于Cre重组酶诱导的大规模慢病毒基因药物制备系统及方法
<141> 2021-02-03
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 935
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtacgtta cataacttac ggtaaatggc 60
ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc 120
atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact 180
gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat 240
gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact 300
tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc 360
tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt 420
taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg 480
gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc 540
ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag 600
cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc 660
gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg 720
cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct 780
tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg ctccgggagg gcccctctgc taaccatgtt 840
catgccttct tctctttcct acagctcctg ggcaacgtgc tggttgttgt gctgtctcat 900
cattttggca aagaattccc cggggatcct ctaga 935
<210> 2
<211> 1383
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gtcgacataa cttcgtatag catacattat acgaagttat cgccaccatg attgaacaag 60
atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 120
cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 180
cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag 240
cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 300
ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 360
ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 420
cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 480
gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 540
tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg 600
tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 660
gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 720
cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 780
gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 840
gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga 900
tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc 960
cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctagggg 1020
gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga acccgcgcta tgacggcaat 1080
aaaaagacag aataaaacgc acggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg gggttcggtc 1140
ccagggctgg cactctgtcg ataccccacc gagaccccat tggggccaat acgcccgcgt 1200
ttcttccttt tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc tcgcagccaa 1260
cgtcggggcg gcaggccctg ccaataactt cgtatagcat acattatacg aagttatcgt 1320
cggatcagct ggcgcgagct ggtcgacaag cttgccacca gcttcgaggg gctcgcatct 1380
ctc 1383
<210> 3
<211> 1392
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ccggcgcaac aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag 780
aatcctggac cgatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc 840
cccagggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc 900
gtcgatccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc 960
gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg 1020
accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc 1080
gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac 1140
cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc 1200
aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg 1260
cccgccttcc tggagacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc 1320
accgtcaccg ccgacgtcga gtgcccgaag gaccgcgcga cctggtgcat gacccgcaag 1380
cccggtgcct ga 1392
<210> 4
<211> 6182
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gctggcgcga gctggtcgac aagctgaatt cgggccgcgt tgacgcgcac ggcaagaggc 60
gaggggcggc gactggtgag agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt 120
agatcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca 180
tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac 240
atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga 300
agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga 360
gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagaa 420
aaaagcacag caagcagcag ctgacacagg acacagcaat caggtcagcc aaaattaccc 480
tatagtgcag aacatccagg ggcaaatggt acatcaggcc atatcaccta gaactttaaa 540
tgcatgggta aaagtagtag aagagaaggc tttcagccca gaagtgatac ccatgttttc 600
agcattatca gaaggagcca ccccacaaga tttaaacacc atgctaaaca cagtgggggg 660
acatcaagca gccatgcaaa tgttaaaaga gaccatcaat gaggaagctg cagaatggga 720
tagagtgcat ccagtgcatg cagggcctat tgcaccaggc cagatgagag aaccaagggg 780
aagtgacata gcaggaacta ctagtaccct tcaggaacaa ataggatgga tgacacataa 840
tccacctatc ccagtaggag aaatctataa aagatggata atcctgggat taaataaaat 900
agtaagaatg tatagcccta ccagcattct ggacataaga caaggaccaa aggaaccctt 960
tagagactat gtagaccgat tctataaaac tctaagagcc gagcaagctt cacaagaggt 1020
aaaaaattgg atgacagaaa ccttgttggt ccaaaatgcg aacccagatt gtaagactat 1080
tttaaaagca ttgggaccag gagcgacact agaagaaatg atgacagcat gtcagggagt 1140
ggggggaccc ggccataaag caagagtttt ggctgaagca atgagccaag taacaaatcc 1200
agctaccata atgatacaga aaggcaattt taggaaccaa agaaagactg ttaagtgttt 1260
caattgtggc aaagaagggc acatagccaa aaattgcagg gcccctagga aaaagggctg 1320
ttggaaatgt ggaaaggaag gacaccaaat gaaagattgt actgagagac aggctaattt 1380
tttagggaag atctggcctt cccacaaggg aaggccaggg aattttcttc agagcagacc 1440
agagccaaca gccccaccag aagagagctt caggtttggg gaagagacaa caactccctc 1500
tcagaagcag gagccgatag acaaggaact gtatccttta gcttccctca gatcactctt 1560
tggcagcgac ccctcgtcac aataaagata ggggggcaat taaaggaagc tctattagat 1620
acaggagcag atgatacagt attagaagaa atgaatttgc caggaagatg gaaaccaaaa 1680
atgatagggg gaattggagg ttttatcaaa gtaagacagt atgatcagat actcatagaa 1740
atctgcggac ataaagctat aggtacagta ttagtaggac ctacacctgt caacataatt 1800
ggaagaaatc tgttgactca gattggctgc actttaaatt ttcccattag tcctattgag 1860
actgtaccag taaaattaaa gccaggaatg gatggcccaa aagttaaaca atggccattg 1920
acagaagaaa aaataaaagc attagtagaa atttgtacag aaatggaaaa ggaaggaaaa 1980
atttcaaaaa ttgggcctga aaatccatac aatactccag tatttgccat aaagaaaaaa 2040
gacagtacta aatggagaaa attagtagat ttcagagaac ttaataagag aactcaagat 2100
ttctgggaag ttcaattagg aataccacat cctgcagggt taaaacagaa aaaatcagta 2160
acagtactgg atgtgggcga tgcatatttt tcagttccct tagataaaga cttcaggaag 2220
tatactgcat ttaccatacc tagtataaac aatgagacac cagggattag atatcagtac 2280
aatgtgcttc cacagggatg gaaaggatca ccagcaatat tccagtgtag catgacaaaa 2340
atcttagagc cttttagaaa acaaaatcca gacatagtca tctatcaata catggatgat 2400
ttgtatgtag gatctgactt agaaataggg cagcatagaa caaaaataga ggaactgaga 2460
caacatctgt tgaggtgggg atttaccaca ccagacaaaa aacatcagaa agaacctcca 2520
ttcctttgga tgggttatga actccatcct gataaatgga cagtacagcc tatagtgctg 2580
ccagaaaagg acagctggac tgtcaatgac atacagaaat tagtgggaaa attgaattgg 2640
gcaagtcaga tttatgcagg gattaaagta aggcaattat gtaaacttct taggggaacc 2700
aaagcactaa cagaagtagt accactaaca gaagaagcag agctagaact ggcagaaaac 2760
agggagattc taaaagaacc ggtacatgga gtgtattatg acccatcaaa agacttaata 2820
gcagaaatac agaagcaggg gcaaggccaa tggacatatc aaatttatca agagccattt 2880
aaaaatctga aaacaggaaa gtatgcaaga atgaagggtg cccacactaa tgatgtgaaa 2940
caattaacag aggcagtaca aaaaatagcc acagaaagca tagtaatatg gggaaagact 3000
cctaaattta aattacccat acaaaaggaa acatgggaag catggtggac agagtattgg 3060
caagccacct ggattcctga gtgggagttt gtcaataccc ctcccttagt gaagttatgg 3120
taccagttag agaaagaacc cataatagga gcagaaactt tctatgtaga tggggcagcc 3180
aatagggaaa ctaaattagg aaaagcagga tatgtaactg acagaggaag acaaaaagtt 3240
gtccccctaa cggacacaac aaatcagaag actgagttac aagcaattca tctagctttg 3300
caggattcgg gattagaagt aaacatagtg acagactcac aatatgcatt gggaatcatt 3360
caagcacaac cagataagag tgaatcagag ttagtcagtc aaataataga gcagttaata 3420
aaaaaggaaa aagtctacct ggcatgggta ccagcacaca aaggaattgg aggaaatgaa 3480
caagtagata aattggtcag tgctggaatc aggaaagtac tatttttaga tggaatagat 3540
aaggcccaag aagaacatga gaaatatcac agtaattgga gagcaatggc tagtgatttt 3600
aacctaccac ctgtagtagc aaaagaaata gtagccagct gtgataaatg tcagctaaaa 3660
ggggaagcca tgcatggaca agtagactgt agcccaggaa tatggcagct agattgtaca 3720
catttagaag gaaaagttat cttggtagca gttcatgtag ccagtggata tatagaagca 3780
gaagtaattc cagcagagac agggcaagaa acagcatact tcctcttaaa attagcagga 3840
agatggccag taaaaacagt acatacagac aatggcagca atttcaccag tactacagtt 3900
aaggccgcct gttggtgggc ggggatcaag caggaatttg gcattcccta caatccccaa 3960
agtcaaggag taatagaatc tatgaataaa gaattaaaga aaattatagg acaggtaaga 4020
gatcaggctg aacatcttaa gacagcagta caaatggcag tattcatcca caattttaaa 4080
agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca 4140
gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt tcgggtttat 4200
tacagggaca gcagagatcc agtttggaaa ggaccagcaa agctcctctg gaaaggtgaa 4260
ggggcagtag taatacaaga taatagtgac ataaaagtag tgccaagaag aaaagcaaag 4320
atcatcaggg attatggaaa acagatggca ggtgatgatt gtgtggcaag tagacaggat 4380
gaggattaac acatggaatt ctgcaacaac tgctgtttat ccatttcaga attgggtgtc 4440
gacatagcag aataggcgtt actcgacaga ggagagcaag aaatggagcc agtagatcct 4500
agactagagc cctggaagca tccaggaagt cagcctaaaa ctgcttgtac caattgctat 4560
tgtaaaaagt gttgctttca ttgccaagtt tgtttcatga caaaagcctt aggcatctcc 4620
tatggcagga agaagcggag acagcgacga agagctcatc agaacagtca gactcatcaa 4680
gcttctctat caaagcagta agtagtacat gtaatgcaac ctataatagt agcaatagta 4740
gcattagtag tagcaataat aatagcaata gttgtgtggt ccatagtaat catagaatat 4800
aggaaaatgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 4860
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 4920
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 4980
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 5040
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 5100
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 5160
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 5220
actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 5280
gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 5340
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 5400
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 5460
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 5520
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 5580
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 5640
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atccttggca cttatctggg acgatctgcg 5700
gagcctgtgc ctcttcagct accaccgctt gagagactta ctcttgattg taacgaggat 5760
tgtggaactt ctgggacgca gggggtggga agccctcaaa tattggtgga atctcctaca 5820
atattggagt caggagctaa agaatagtgc tgttagcttg ctcaatgcca cagccatagc 5880
agtagctgag gggacagata gggttataga agtagtacaa ggagcttgta gagctattcg 5940
ccacatacct agaagaataa gacagggctt ggaaaggatt ttgctataag ctcgaaacaa 6000
ccggtacctc tagaactata gctagcagat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac 6060
atcatgaagc cccttgagca tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca 6120
atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt 6180
ta 6182
<210> 5
<211> 2200
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gctggcgcga gctggtcgac aagctgaatt ctgacactat gaagtgcctt ttgtacttag 60
cctttttatt cattggggtg aattgcaagt tcaccatagt ttttccacac aaccaaaaag 120
gaaactggaa aaatgttcct tctaattacc attattgccc gtcaagctca gatttaaatt 180
ggcataatga cttaataggc acagccttac aagtcaaaat gcccaagagt cacaaggcta 240
ttcaagcaga cggttggatg tgtcatgctt ccaaatgggt cactacttgt gatttccgct 300
ggtatggacc gaagtatata acacattcca tccgatcctt cactccatct gtagaacaat 360
gcaaggaaag cattgaacaa acgaaacaag gaacttggct gaatccaggc ttccctcctc 420
aaagttgtgg atatgcaact gtgacggatg ccgaagcagt gattgtccag gtgactcctc 480
accatgtgct ggttgatgaa tacacaggag aatgggttga ttcacagttc atcaacggaa 540
aatgcagcaa ttacatatgc cccactgtcc ataactctac aacctggcat tctgactata 600
aggtcaaagg gctatgtgat tctaacctca tttccatgga catcaccttc ttctcagagg 660
acggagagct atcatccctg ggaaaggagg gcacagggtt cagaagtaac tactttgctt 720
atgaaactgg aggcaaggcc tgcaaaatgc aatactgcaa gcattgggga gtcagactcc 780
catcaggtgt ctggttcgag atggctgata aggatctctt tgctgcagcc agattccctg 840
aatgcccaga agggtcaagt atctctgctc catctcagac ctcagtggat gtaagtctaa 900
ttcaggacgt tgagaggatc ttggattatt ccctctgcca agaaacctgg agcaaaatca 960
gagcgggtct tccaatctct ccagtggatc tcagctatct tgctcctaaa aacccaggaa 1020
ccggtcctgc tttcaccata atcaatggta ccctaaaata ctttgagacc agatacatca 1080
gagtcgatat tgctgctcca atcctctcaa gaatggtcgg aatgatcagt ggaactacca 1140
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gagttctgag gaccagttca ggatataagt ttcctttata catgattgga catggtatgt 1260
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tgtgatacca tgctcaaaga ggcctcaatt atatttgagt ttttaatttt tatgaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa acggaattca ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg 1740
tgtggctaat gccctggccc acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct 1800
attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc 1860
ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgcaatg atgtatttaa 1920
attatttctg aatattttac taaaaaggga atgtgggagg tcagtgcatt taaaacataa 1980
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<210> 6
<211> 1207
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa 60
cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa tttcgagggg cagagccgat 120
cctgtacact ttacttaaaa ccattatctg agtgtgaaat gtccaattta ctgaccgtac 180
accaaaattt gcctgcatta ccggtcgatg caacgagtga tgaggttcgc aagaacctga 240
tggacatgtt cagggatcgc caggcgtttt ctgagcatac ctggaaaatg cttctgtccg 300
tttgccggtc gtgggcggca tggtgcaagt tgaataaccg gaaatggttt cccgcagaac 360
ctgaagatgt tcgcgattat cttctatatc ttcaggcgcg cggtctggca gtaaaaacta 420
tccagcaaca tttgggccag ctaaacatgc ttcatcgtcg gtccgggctg ccacgaccaa 480
gtgacagcaa tgctgtttca ctggttatgc ggcggatccg aaaagaaaac gttgatgccg 540
gtgaacgtgc aaaacaggct ctagcgttcg aacgcactga tttcgaccag gttcgttcac 600
tcatggaaaa tagcgatcgc tgccaggata tacgtaatct ggcatttctg gggattgctt 660
ataacaccct gttacgtata gccgaaattg ccaggatcag ggttaaagat atctcacgta 720
ctgacggtgg gagaatgtta atccatattg gcagaacgaa aacgctggtt agcaccgcag 780
gtgtagagaa ggcacttagc ctgggggtaa ctaaactggt cgagcgatgg atttccgtct 840
ctggtgtagc tgatgatccg aataactacc tgttttgccg ggtcagaaaa aatggtgttg 900
ccgcgccatc tgccaccagc cagctatcaa ctcgcgccct ggaagggatt tttgaagcaa 960
ctcatcgatt gatttacggc gctaaggatg actctggtca gagatacctg gcctggtctg 1020
gacacagtgc ccgtgtcgga gccgcgcgag atatggcccg cgctggagtt tcaataccgg 1080
agatcatgca agctggtggc tggaccaatg taaatattgt catgaactat atccgtaacc 1140
tggatagtga aacaggggca atggtgcgcc tgctggaaga tggcgattag ccattaacgc 1200
gaattca 1207
<210> 7
<211> 8835
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
atgaccctga ggctgttggt cgcagcactg tgcgctggaa tccttgctga ggctccaaga 60
gtgagggccc agcacagaga gagagtgacc tgtacaagac tgtacgctgc agacattgtg 120
tttctgttag acggcagtag ctctattggg agatctaact tccgggaggt cagaagcttc 180
cttgagggcc tggtgctgcc ttttagcggg gccgcttctg cccagggcgt gaggttcgcc 240
actgtgcagt atagtgacga cccaaggact gagttcgggc tggatgcctt ggggagcggc 300
ggagatgtga ttagggcaat cagagagttg agctacaaag gcggcaatac tagaaccggc 360
gccgccatcc tgcacgtggc tgaccacgtg tttctgcccc aactggccag gcccggcgtc 420
cccaaagtgt gtatcctgat tactgacggc aaatcccagg acctggtaga caccgccgca 480
cagcgcctaa agggacaggg agtgaagttg ttcgcagtgg ggatcaagaa tgctgacccc 540
gaggaactga agcgggtggc cagtcagccc acctccgact tctttttctt cgtgaatgat 600
ttctcaatct tgaggaccct gctgcctctg gtgagccgta gagtgtgcac aacagcaggc 660
ggcgtacctg tgactagacc ccctgacgat tccacctcag ctcctagaga cctggtactc 720
tccgagccgt cctcccagag tctcagagtg cagtggactg ccgccagcgg gcccgtgaca 780
gggtacaagg tgcagtatac acctctgaca ggattgggac agcccctacc aagtgagcgg 840
caagaggtga acgtgccagc aggagagaca tcagtgagac tcagaggtct gaggcctctc 900
actgagtatc aggtcactgt gatcgcactc tatgccaatt ctataggaga ggccgttagt 960
ggaaccgccc gcaccacagc ccttgagggg cccgaactga ccattcagaa caccaccgcc 1020
cactcactgc tcgtggcctg gcggtctgtg ccaggtgcta ctgggtacag agtgacttgg 1080
agagtgctta gcggaggccc tacccagcag caggagttag gtcctggcca ggggagcgtg 1140
ctactcagag atctggagcc cggcaccgat tacgaagtga cagtaagtac cctctttggc 1200
agatccgttg ggcccgctac atcactcatg gctcgcaccg atgcctcagt ggagcaaaca 1260
ctgcggcccg tgatcttggg acctacctct attttgttaa gttggaacct ggtgcctgaa 1320
gccagggggt accggctgga atggcgcaga gagaccggac tggagcctcc acaaaaagtt 1380
gtgctgcctt ccgacgttac cagatatcag ttagacggat tacagcccgg aaccgaatac 1440
aggctgacgc tctacaccct cttggagggg cacgaggtcg ccacccccgc aactgttgtc 1500
ccaaccggac ctgaactgcc agtttctccc gtgaccgatc tgcaggcaac agagctgccc 1560
ggccagcggg tgcgcgtcag ctggtcccca gtgcctgggg ccacacagta cagaatcatc 1620
gtgcgatcta ctcagggcgt ggagcggact cttgtgctcc caggctccca gacagccttt 1680
gatctcgacg acgttcaggc cgggctctcc tatacagtga gagtcagtgc cagagtgggc 1740
cctagggagg ggtccgccag tgtgcttact gtgagaagag agccagagac ccctctggct 1800
gttcccggct tgcgcgtggt cgtgtctgac gccacaagag tgagggtggc ctggggaccc 1860
gtcccaggag cttctgggtt tcgcatatct tggagtaccg gatcaggccc cgaaagttct 1920
cagaccttgc cacctgactc aaccgctacc gacattactg gcctgcagcc cggtaccacc 1980
tatcaggtgg cagtctcagt gctgcgtgga agagaagaag gacctgcagc cgttattgtg 2040
gctcggaccg acccactcgg acctgtcagg accgtgcatg tcacgcaggc aagcagctct 2100
agcgtaacaa ttacatggac tcgagttccc ggagccacag gctaccgagt gtcctggcac 2160
agcgcccatg ggcctgagaa gtctcagctg gtcagcgggg aggctactgt agcagaactg 2220
gatggactcg agccggatac tgagtatacg gttcacgttc gtgctcacgt ggccggtgta 2280
gacggccctc ccgccagcgt tgtggtcaga actgcccctg agcccgtcgg cagggtgtca 2340
aggttacaaa ttttaaacgc aagctccgac gtcttgcgta tcacctgggt tggcgtgact 2400
ggggccaccg cctaccggtt agcttggggt cgatctgagg gaggacctat gaggcatcag 2460
atcctgcctg gtaatactga ttctgccgag atacgcggcc tggaaggtgg tgtgagctat 2520
tctgtgcgcg tcactgccct ggtgggtgac agagagggta cccctgtcag catcgtggtc 2580
accaccccac cagaagcacc acctgcactg ggaacactgc atgtcgtcca gagaggcgag 2640
cacagtctga gactgaggtg ggagcctgtc cccagggccc agggctttct gctccactgg 2700
cagcccgaag gaggccagga gcagagccgg gtcttgggtc ctgaactgtc ctcttaccac 2760
ctggacggcc tggagcctgc aacccagtac cgggtgaggc tttctgttct aggacccgcc 2820
ggggaaggac catcagccga agtcaccgcg aggacagaaa gtcctagggt accaagcatt 2880
gagctgcggg tggttgatac ttccatcgac agcgtgactc tcgcttggac ccctgtctct 2940
cgggcctcca gctatatcct ctcatggcgt cctctgcgag gacctggaca ggaagtccca 3000
ggctcccccc aaactctgcc aggtattagc tcttctcagc gggtaacagg cctggaaccc 3060
ggagttagct acatattcag cttgacccct gttctggatg gagtgagggg acctgaagct 3120
tcagtgacac agacacccgt gtgccctcgc ggtctcgcgg acgtcgtgtt tctgccccac 3180
gccactcagg acaacgcaca ccgagccgag gcaactagac gcgtgctcga gagactggtc 3240
ctggcccttg ggcctttggg cccccaggct gttcaggtag gactgttgag ttattcacac 3300
cggccatccc ccctatttcc cctgaacgga agccatgatc tcggaatcat cctacagcga 3360
atccgtgata tgccttacat ggacccttct ggaaacaatc tggggactgc agtggtcaca 3420
gcccacaggt acatgcttgc acctgatgca ccaggccgca ggcagcacgt gcccggagtt 3480
atggtgctcc tcgtcgatga acccctgcgg ggcgatattt tctctcccat ccgagaggca 3540
caagcaagtg gactcaacgt cgtgatgctg ggcatggccg gggctgaccc agagcagctt 3600
agacgccttg ctccaggaat ggattctgtt cagaccttct ttgctgtgga tgatggcccc 3660
tcactagacc aggcagtgag cggcctggcc actgctctct gccaggccag tttcacaacg 3720
caaccacgcc ccgagccatg tcctgtgtat tgccctaaag gccagaaggg cgaaccaggg 3780
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ggggctccgg gcccacaagg cccacctgga agcgctaccg caaagggcga aagggggttt 3900
ccaggagccg atggcaggcc aggttctccc ggaagagctg gtaatcctgg tactcctggc 3960
gcgcccggac taaaaggtag tcctggactg ccaggtccta ggggagatcc aggagaaaga 4020
ggcccaagag gtcctaaggg agagcctggg gcaccagggc aagtgattgg aggagaaggg 4080
ccaggcctgc caggaaggaa aggcgatcct ggaccttctg gccctccagg gccacgcggg 4140
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gataagggag accggggaga gaggggcccc cccggaccag gcgagggagg catcgcccca 4260
ggggaaccag gtctcccagg cctgcctggt tccccaggtc cccagggtcc agtgggacct 4320
ccaggcaaga agggggagaa gggagattcg gaagatggcg ctcctggcct acctggccag 4380
cccggtagtc ctggggagca gggtccaaga ggaccgccag gcgccattgg ccccaaagga 4440
gaccgcggct tccctggccc attaggcgaa gccggcgaga aaggtgagcg gggacctccc 4500
ggccccgccg gctccagagg cctgcccggt gtggccgggc gtcccggtgc gaaaggacct 4560
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gaccccgctg tggtgggacc tgccgtcgcc ggtccaaagg gcgagaaagg cgatgttgga 4680
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ctgccagggg atccaggtcc aaagggagac cctggcgata ggggcccaat cggtttaaca 4800
ggcagagccg gaccccctgg ggattccgga ccaccaggcg aaaaagggga ccctggtagg 4860
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gatgaaggcc ctccaggcga tccagggttg cccggaaagg ctggggaacg cggcctacga 4980
ggagcacctg gggtgcgcgg ccccgtcggg gagaagggcg accaaggcga cccaggggaa 5040
gatgggcgga atgggtcccc tggctccagt ggtcccaaag gggacagagg ggaaccaggc 5100
ccacccggac cacccggcag gctggttgat acaggacctg gggccaggga gaaaggcgaa 5160
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gcacctgggg aacgcggtat cgaggggttc agaggacccc ctggacctca aggagaccct 5280
ggcgtccgcg gccctgcagg tgagaaggga gatagaggcc cccccggatt ggatgggaga 5340
tccggactgg atggcaaacc cggtgctgcc gggccaagtg gaccaaacgg agccgccgga 5400
aaagcaggag acccaggtcg cgatggtctg cctggcctta gaggcgaaca gggcctccca 5460
ggcccaagcg gacctcccgg actgcccggt aaaccaggtg aagatggcaa gcctggtctg 5520
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gactccggcg cctccggacg cgagggacgg gacggtccca agggcgagag aggcgctccc 5640
ggcattctgg gtccccaagg accacccgga ctccctggcc ctgtcggccc acctggacaa 5700
ggcttcccag gcgtgcccgg tgggactgga cctaagggcg acaggggtga gacaggttcc 5760
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aatgttgaca ggctgcttga aaccgctgga attaaggcct ctgcccttcg cgaaatcgtt 5880
gagacatggg atgaaagtag cggcagcttt cttcctgtcc ctgagcggag gcgggggcct 5940
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atcccagggt tacctggccg agccggcggc gtcggcgagg ctggccgtcc aggcgagcga 6180
ggggaacggg gagagaaagg agagaggggg gagcagggca gggacggccc ccccggcctg 6240
ccaggaacac ccggcccacc tggtcctccc ggacctaaag taagcgtgga tgagcccgga 6300
cctggactga gcggagagca agggcctcct ggactgaagg gagctaaggg cgagccgggt 6360
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ggacacgggg atccaggccc acctggcgcc cctggcttgg ctggccccgc tggcccccag 6600
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cccaagggcg accggggctt tgacggtcag ccggggccaa agggcgacca gggggagaaa 8100
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cattgtgcct gccagggcca gtttatcgcc tcaggatccc gccctctccc ctcctatgcc 8460
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gaggagtacc aggaccctga ggctccctgg gacagcgacg acccatgcag cctgcctctg 8640
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actgaggcct gccacccctt tgtgtacggc gggtgcggag gcaatgctaa tagattcggg 8760
acaagagaag cctgcgaaag gcgctgtcct ccgagggtgg tgcagtccca gggcacaggc 8820
acagcccagg attga 8835
机译: 用Cre重组酶诱导AID揭示,其中外部Cre重组酶基因表达在外部刺激
机译: 减毒的麻疹病毒,重组产生的,分离的,麻疹病毒,人呼吸道合胞病毒(rsv),b组,减毒,重组产生,分离的,rsv,b组,用于免疫接种以诱导针对病毒麻疹的保护的疫苗方法,免疫个体以诱导针对rsv的保护,b组,组成,减毒的传染性麻疹病毒的生产方法,减毒的rsv传染性亚组的生产方法
机译: 使用SAID重组酶的解离/重组关联系统对CRE重组酶进行调控