HBV PreS1多肽修饰的人肝细胞特异靶向性的rAAV2载体及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了HBV PreS1多肽修饰的人肝细胞特异靶向性的rAAV2载体及其制备方法和用途。本发明运用同源重组法，将preS1多肽基因插入rAAV 2的衣壳质粒，构建得到改造质粒；然后通过三质粒共转染HEK293细胞对改造质粒进行包装，再对病毒载体进行纯化以及检测后，得到具有肝靶向性的改造病毒载体，在肝脏的基因编辑与基因治疗研究领域具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学范畴中病毒载体技术领域，具体涉及重组腺相关病毒载体及其临床应用前景。

背景技术

我国是肝脏疾病的高发地区，肝癌更是危害我国国民健康的主要恶性肿瘤之一，迄今没有理想的根治药物。而随着生物医学科技的飞速发展，基因编辑与基因疗法有望成为人类战胜各类疾病的新技术之一。重组腺相关病毒(rAAV)作为常用的递送外源目的基因的载体之一，具有稳定性高、致病性低、免疫原性低、宿主范围广，能够介导外源基因长期表达等优点，因此被视为最有发展前景的基因治疗载体之一。但由于AAV的主要细胞受体硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的广泛分布于各种细胞的细胞膜上，所以天然血清型的AAV不具有特定组织和器官的靶向性。因此，研究人员尝试通过多种手段以期赋予AAV新的靶向性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有基因编辑与基因治疗技术的不足之处，提供了HBVPreS1多肽修饰的人肝细胞特异靶向性的rAAV2载体及其制备方法和用途。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种HBV PreS1多肽修饰的rAAV2载体，其特征在于：在所述HBV PreS1多肽修饰的rAAV2载体的氨基酸序列中含有PreS1多肽序列，所述PreS1多肽序列选自：氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的PreS1-1、氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的PreS1-2、氨基酸序列如SEQID No.5所示的PreS1-3、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的PreS1-4、或氨基酸序列如SEQID No.8所示的PreS1-6。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种编码HBV PreS1多肽修饰的rAAV2载体的核酸分子，所述核酸分子的序列为：在pAAV-H22质粒的587号位点插入有编码PreS1多肽的基因序列；所述PreS1多肽选自：氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的PreS1-1、氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的PreS1-2、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的PreS1-3、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的PreS1-4、或氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的PreS1-6。

在一个具体的实施例中：编码所述PreS1-1的基因序列的相应的引物对包括如SEQID No.9所示的上游引物和如SEQ ID No.10所示的下游引物，编码所述PreS1-2的基因序列的相应的引物对包括如SEQ ID No.11所示的上游引物和如SEQ ID No.12所示的下游引物，编码所述PreS1-3的基因序列的相应的引物对包括如SEQ ID No.13所示的上游引物和如SEQ ID No.14所示的下游引物，编码所述PreS1-4的基因序列的相应的引物对包括如SEQID No.15所示的上游引物和如SEQ ID No.16所示的下游引物，编码所述PreS1-6的基因序列的相应的引物对包括如SEQ ID No.19所示的上游引物和如SEQ ID No.20所示的下游引物。

上述的HBV PreS1多肽修饰的rAAV2载体例如可通过上述的核酸分子编码得到。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：

一种HBV PreS1多肽修饰的rAAV2载体的制备方法，包括：

1)病毒包装质粒的改造：通过同源重组法，将所述PreS1多肽序列对应的基因序列插入到pAAV-H22质粒的587号位点处，获得改造质粒，该改造质粒将作为后续改造病毒载体包装所需的实验材料；

2)改造病毒载体的包装与检测：将改造质粒转入宿主细胞并进行病毒的包装，包装完成后使用碘克沙醇密度梯度离心和超滤离心对病毒载体进行纯化，纯化后的病毒载体进行衣壳蛋白检测(western blot)和滴度检测(qPCR)，得到改造成功且滴度足够的改造病毒载体，即为所述的HBV PreS1多肽修饰的rAAV2载体。

进一步地，所述步骤1)包括：将pAAV-H22质粒与pUCm-T质粒双酶切后，回收2749bp和2705bp的片段，进行酶连，构成工作质粒，该工作质粒含有pAAV-H22质粒上的587号改造位点；随后对所述工作质粒的587号位点进行线性化，再将所述PreS1多肽序列对应的基因序列插入到587号位点处，再对插入了基因序列的587号位点片段进行酶切，重新连回pAAV-H22质粒上，获得改造质粒。

进一步地，所述线性化采用的引物对包括如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQID No.2所示的下游引物。

进一步地，所述步骤2)中，通过三质粒共转染法将改造质粒转入宿主细胞；采用的质粒包括pFd6、pAAV-eGFP和改造质粒。

进一步地，所述宿主细胞为HEK293。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：

一种上述的HBV PreS1多肽修饰的rAAV2载体在制备治疗肝脏疾病的药物中的用途。

一种上述的核酸分子在制备治疗肝脏疾病的药物中的用途。

具体的，所述肝脏疾病例如包括肝癌。

本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。

本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。

本发明所述“大约”、“约”或“左右”等指的是所述范围或数值的±20％范围内。

本发明中，除有特别说明或在领域内有通用含义外，％均为质量百分比。

本发明经研究发现，HBV只能特异性侵染灵长类动物的肝脏，preS1基因、preS2基因和S基因共同编码HBV衣壳表面的L蛋白，而PreS1多肽在HBV感染人肝细胞中发挥着重要作用。本发明运用同源重组法，将不同片段长度的6条preS1多肽基因分别插入rAAV 2的衣壳质粒的587号位点处，由此构建出6种改造成功的衣壳质粒。然后通过三质粒共转染HEK293细胞对改造的病毒载体进行包装，再对病毒载体进行纯化以及检测后，于体外对人肝细胞系和非肝细胞系进行感染，通过荧光图片对比结果及统计结果，最终得到5种具有肝靶向性的改造病毒载体。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明得到的HBV PreS1多肽修饰的人肝细胞特异靶向性的rAAV2载体，其肝细胞靶向性明显高于天然血清型的病毒载体，且对肝细胞的转染效率明显增强，在肝癌的基因编辑与基因治疗研究领域具有潜在的用途。

附图说明

图1为实施例1中各单个质粒载体酶切鉴定图(A：pAAV-H22和pUCm-T酶切验证；B：连接正确的工作载体的酶切验证)。

图2用于说明实施例1中得到的587号位点处的线性化载体。

图3用于说明实施例1中得到的含有587号位点处同源臂的各单个改造基因。

图4为实施例1中得到的改造基因的测序比对结果。

图5为实施例1中得到改造成功的质粒的酶切验证图。

图6为实施例2中用于包装病毒的各质粒的酶切验证图(A：pAAV-eGFP；B：pFd6)。

图7为实施例2中质粒转染48h后荧光表达情况(左白光，右荧光)，图中标尺为271μm。

图8为实施例2中采用碘克沙醇作为密度梯度离心介质的装柱图。

图9为实施例2中各种业经改造的病毒衣壳蛋白的检测。

图10为实施例2中的qPCR检测结果(A：标准曲线；B：溶解曲线)。

图11为实施例3中各病毒载体感染SMMC-7721效果图(各图中左白光，右荧光；A：rAAV-1C5；B：rAAV-2C5；C：rAAV-3C5；D：rAAV-4C5；E：rAAV-6C5；F：rAAV-H22)，图中标尺为271μm。

图12为实施例3中各病毒载体感染Huh7效果图(各图中左白光，右荧光；A：rAAV-1C5；B：rAAV-2C5；C：rAAV-3C5；D：rAAV-4C5；E：rAAV-6C5；F：rAAV-H22)，图中标尺为271μm。

图13为实施例3中各病毒载体感染HepG2效果图(各图中左白光，右荧光；A：rAAV-1C5；B：rAAV-2C5；C：rAAV-3C5；D：rAAV-4C5；E：rAAV-6C5；F：rAAV-H22)，图中标尺为271μm。

图14为实施例3中各病毒载体感染Lo-2效果图(各图中左白光，右荧光；A：rAAV-1C5；B：rAAV-2C5；C：rAAV-3C5；D：rAAV-4C5；E：rAAV-6C5；F：rAAV-H22)，图中标尺为271μm。

图15为实施例3中各病毒载体感染H446效果图(各图中左白光，右荧光；A：rAAV-1C5；B：rAAV-2C5；C：rAAV-3C5；D：rAAV-4C5；E：rAAV-6C5；F：rAAV-H22)，图中标尺为271μm。

图16为实施例3中各病毒载体感染DLD-1效果图(各图中左白光，右荧光；A：rAAV-1C5；B：rAAV-2C5；C：rAAV-3C5；D：rAAV-4C5；E：rAAV-6C5；F：rAAV-H22)，图中标尺为271μm。

图17为实施例3中各病毒载体感染NCI-H460效果图(各图中左白光，右荧光；A：rAAV-1C5；B：rAAV-2C5；C：rAAV-3C5；D：rAAV-4C5；E：rAAV-6C5；F：rAAV-H22)，图中标尺为271μm。

图18为实施例3中各病毒载体感染后的荧光细胞百分比统计图(A：SMMC-7721；B：Huh7；C：HepG2；D：Lo-2；E：H446；F：DLD-1；G：NCI-H460)。

图19为实施例3中各改造型病毒载体感染各细胞系后荧光细胞百分比的汇总对比示意图，各细胞组中，从左到右依次为rAAV-1C5、rAAV-2C5、rAAV-3C5、rAAV-4C5、rAAV-6C5、rAAV-H22。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1衣壳质粒pAAV-H22的改造

1.1工作质粒的构建

由于后续实验需要运用同源重组法，而pAAV-H22质粒过大，线性化过程中容易发生突变，因此，将衣壳RC质粒pAAV-H22与pUCm-T质粒经HindⅢ和NdeI双酶切后，回收2749bp和2705bp的片段，进行酶连，构成的工作质粒含有原衣壳RC质粒pAAV-H22上的587号改造位点。如图1。

1.2工作质粒的线性化

在工作质粒的基础上在587号位点处，运用反向PCR进行线性化，再与改造基因进行同源重组后即完成改造基因在位点上的插入。线性化载体的引物设计，使用SnapGene进行引物设计，用于587号位点的工作质粒的线性化，引物序列见表1。

表1引物设计

配制好反应体系后，设置反应程序，反应结束后使用核酸电泳，电泳条带切胶回收获得线性化载体。如图2。

1.3PCR获取改造基因

改造基因氨基酸序列见下表2。

表2插入的氨基酸序列及编号

为了后续同源重组实验，在设计引物的同时，加入各位点的同源臂序列，使得PCR扩增后的改造基因已经含有各位点处的同源臂序列。使用SnapGene进行引物设计，各位点的引物序列见表3。

表3含587号位点处同源臂的改造基因引物序列

配制好反应体系后，设置反应程序，反应结束后使用核酸电泳，如图3，电泳条带切胶回收获得线性化载体。

1.4同源重组法于587号位点处插入改造基因

按照碧云天同源重组试剂盒说明书，将6条不同的改造基因插入587号位点处，反应完成后，将产物进行转化，挑取单克隆加到5mL的含氨苄的LB液体培养基中，做好标记，37℃，220rpm震荡培养10～12h。吸取少量菌液，送至生工进行测序，检测改造基因是否插入正确。如图4，对比结果显示，改造基因插入成功。

1.5将成功插入改造基因的位点片段重新连回RC质粒

将插入了改造基因的587号位点片段进行酶切，重新连回RC质粒pAAV-H22上，由此完成包装质粒pAAV-H22的改造。然后再对连接产物进行酶切验证，如图5，确认得到改造成功的质粒。改造的质粒的命名见表4。

表4改造后的质粒的命名

实施例2改造病毒载体的包装及检测

2.1质粒的酶切验证

对于用于包装病毒的质粒小量提取后进行酶切验证，其中包括pFd6、改造后的pAAV-H22和pAAV-eGFP3种质粒，如图6。酶切加样体系见表5～7。

表5pAAV-eGFP的双酶切体系

表6pAAV-H22的双酶切体系

表7pFd6的双酶切体系

验证正确后可进行扩增以及用于病毒载体的包装。

2.2质粒的提取

将验证正确后的质粒菌液于超净台加到含双抗LB液体培养基中，每200mL培养基加1mL小摇后的菌液，做好标记，220rpm，37℃，过夜(12～16h)培养。提取实验步骤见天根质粒大提试剂盒说明书。

2.3细胞的培养

打开水浴锅设置温度为37℃，待温度稳定后从液氮罐中取出HEK293细胞放置于水浴锅中，待全部溶解之后取出。将细胞复苏于T25培养瓶中，补齐10％DMEM完全培养基至5mL，补齐培养基后轻柔地吹打数次，拧紧培养瓶盖，于显微镜下观察到无聚团的细胞。置于37℃，5％CO

待细胞生长密度达到80％～90％，可进行传代或冻存。

2.4病毒载体的包装

病毒是使用脂质体PEI转染法，通过三质粒共转染HEK293细胞包装得到，同时包装得到6种587号位点处改造的病毒载体，以及天然血清型rAAV2病毒载体。

在转染后72h，收集上清培养基以及细胞进行病毒载体的粗提以及纯化。

2.4.1病毒粗提

(1)将收集到的上清液按照培养基∶40％PEG8000＝4∶1的比例加入40％PEG8000混合均匀，加入搅拌棒，在4℃下搅拌1h，然后在4℃保持3h不搅拌，使其完全沉淀(如果需要，病毒的沉淀可以在4℃过夜)。在4℃下以3000g离心15min。弃去上清液，将病毒(小颗粒)重悬于1mLPBS+0.001％pluronic F68+200mM NaCl中将重悬的颗粒保持在冰上。

(2)收集到的细胞用1.5～2mL PBS+0.001％pluronic F68+200mM NaCl重悬，震荡混匀后，于-80℃～37℃反复冻融3～4次，每次37℃溶解后，震荡混匀半分钟，然后在4℃下以3220g离心15min来沉淀细胞碎片，取病毒上清。

(3)将步骤(1)中的病毒重悬液与步骤(2)中的病毒上清混合。

(4)在每毫升病毒悬浮液中加入50单位的benzonase(Benzonase是一种内切核酸酶，可以降解包装过程中携带的任何残留DNA)，37℃水浴1h，4℃、5000g离心15min，取上清。

(5)完成上述步骤后，可进行碘克沙醇密度梯度离心纯化。

2.4.2病毒纯化

使用不同浓度的碘克沙醇进行密度梯度离心，对病毒载体进行纯化。如图8，装柱完成后，54000rpm、4℃、4h离心。吸取40％层碘克沙醇1mL左右，先将离心管上扎破保证与大气相连，再用注射器于40％碘克沙醇与60％碘克沙醇的交界面处抽取1mL 40％碘克沙醇的组分。此方法可用于分离纯化AAV粗提液中的所需AAV病毒，15％的碘克沙醇由1M NaCl/PBS-MK缓冲液稀释，其中的1M NaCl可破坏大分子之间的离子相互作用，40％和25％的碘克沙醇由1×PBS-MK缓冲液稀释，用于去除密度较低的污染物，包括空载病毒颗粒，60％的碘克沙醇用作含基因组病毒颗粒的缓冲垫，不同浓度的碘克沙醇可添加少量酚红以清楚地区分不同的浓度梯度，此方法将有助于病毒颗粒(含基因组)的收集。

将抽取出来的病毒加入超滤管中，加入10mL PBS混匀，4500g，15min离心。反复重复此步骤，直至加入PBS后不再形成分层，即代表去除大部分碘克沙醇，得到纯化后的病毒。

2.5病毒载体的检测

2.5.1荧光显微镜检测转染效率

PEI脂质体三质粒共转染法，转染HEK293细胞后48h，将转染后的细胞置于荧光显微镜下镜检，通过观察细胞荧光强度及表达量，从而判断转染是否成功，以及转染效率的高低，如图7。作为rAAV生产的关键环节，三质粒共转染的转染效率直接影响着rAAV的包装效率，而绿色荧光蛋白能直观地反应转染效率的高低。

2.5.2western blot检测病毒载体衣壳蛋白

rAAV衣壳蛋白由VP1、VP2和VP3组成，大小分别为90kDa、72kDa和60kDa，经过SDS-PAGE蛋白电泳后，利用Western-blot对其进行免疫印迹检测，从而确定病毒的包装是否成功。此试验方法是对病毒衣壳蛋白的定性分析，用于证明包装的出病毒载体中是否含有衣壳蛋白，以及证明病毒颗粒是否装配成功，使用抗体为anti-VP1、VP2、VP3抗体。

如图9，最终结果显示rAAV-5C5改造型病毒衣壳蛋白条带不明显，其他5种改造病毒载体衣壳蛋白检测条带清晰，可见这5种改造病毒载体包装成功。

2.5.3qPCR检测病毒载体基因组滴度

Real-time PCR即实时荧光定量PCR，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积变化实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品进行定量分析的检测方法。引物设计如下。

上游引物(SEQ ID No.21)：5’CCCATAGTAACGCCAATA3’

下游引物(SEQ ID No.22)：5’AGGTCATGACTGGACATAAT3’

各病毒载体的基因组滴度见表8。qPCR的标准曲线和溶解曲线如图10。

表8各病毒载体基因组滴度

由表8中的结果可以看出，改造型rAAV-5C5病毒载体的滴度明显低于其他改造型病毒载体，不足以完成后续的验证实验，而其他改造型病毒载体的滴度相对于未改造的rAAV-H22载体病毒，虽然出现不同程度的滴度下降的问题，但是基本不影响后续的验证实验。

实施例3改造病毒载体的体外验证

3.1细胞的选择与培养

为了验证改造的病毒载体是否具有人肝细胞的靶向性，分别选取了人肝细胞系和非肝细胞系的若干种细胞，见表9。

表9本实施例所用细胞株

将细胞复苏后置于37℃，5％CO

3.2病毒载体的体外验证

3.2.1细胞接板

(1)将上述复苏并经过一次传代后的细胞进行培养，当生长至85％～95％时，消化，离心，加入新培养基后，吸出微量细胞，用细胞计数板对其计数。

(2)将计数完毕后的细胞，分别接入到24孔板中，每孔1×10

(3)待细胞贴壁后，按照感染复数MOI＝10

(4)加入病毒后，置于37℃，5％CO

3.2.2荧光强度检测

细胞培养48h后，于倒置荧光显微镜下观察荧光强度。现有所获的改造病毒载体是在rAAV2型病毒载体的基础上改造得到，因此，本实验使用该血清型病毒载体作为阳性对照。上述7种细胞感染病毒后48h，通过荧光显微镜检测其绿色荧光蛋白表达情况，可以直观的反应每种病毒载体的感染情况。结果如图11～17。

3.2.3统计学处理

为了更直观的表现出改造病毒载体与天然血清型病毒载体的区别，根据改造病毒载体和rAAV2病毒载体分别感染单种细胞后的荧光图片，使用Image-J对荧光和白光下的细胞进行计数，通过计算得到细胞的荧光表达百分比，再使用GraphPad制作柱状图，并分析比较5种改造型病毒对比未改造的rAAV2病毒载体对各细胞的感染效果是否具有显著性差异。结果如图18～19。

结果显示，改造成功的病毒载体对比未改造的天然型病毒载体rAAV2，对人肝细胞的靶向性有明显的增强，且转染效率更高。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 华侨大学

<120> HBV PreS1多肽修饰的人肝细胞特异靶向性的rAAV2载体及其制备方法和用途

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agacaagcag ctaccgcaga tg 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttgcctctc tggaggttgg tag 23

<210> 3

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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1 5 10 15

His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp

20 25 30

Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Gly Leu Ser

35 40 45

<210> 4

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp

1 5 10 15

His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp

20 25 30

Asp Phe Asn Gly Leu Ser

35

<210> 5

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp

1 5 10 15

His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Gly Leu

20 25 30

Ser

<210> 6

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp

1 5 10 15

His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Gly Leu Ser

20 25

<210> 7

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp

1 5 10 15

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20

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro

1 5 10 15

Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Gly Leu Ser

20 25

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccaacctcca gagaggcaac atggggcaga atctttccac c 41

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atctgcggta gctgcttgtc tgctcaaccc gttggcgtct 40

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<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccaacctcca gagaggcaac atggggcaga atctttccac c 41

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atctgcggta gctgcttgtc tgctcaaccc attgaagtcc c 41

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccaacctcca gagaggcaac atggggcaga atctttccac c 41

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

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<210> 16

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cccatagtaa cgccaata 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

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