蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂在制备治疗骨关节炎药物中的应用

摘要

本发明公开了一类可用于治疗骨关节炎的SHP2的变构抑制剂SHP099。针对DMM模型及自然衰老诱导的小鼠骨关节炎的疾病模型，SHP099均能有效抑制小鼠膝关节软骨缺损并促进软骨的修复效果。在细胞水平，SHP099显著降低IL‑1β刺激下的软骨降解酶的水平并促进软骨合成基因的表达，从而实现对软骨合成和分解代谢的双重调控。此外，SHP099还具有浓度梯度的促进软骨细胞分化作用。

说明书

一、技术领域

本发明属于制药技术领域。

二、背景技术

骨关节炎(OA)是中老年最常见的关节疾病，其病理特征为软骨结构的破 坏，关节间隙变窄，软骨下骨的硬化及边缘骨赘的形成并伴随着滑膜的炎症的发 生。OA早期的主要症状包括关节疼痛、晨僵和压痛等短暂的关节运动障碍，随 后会发展成为关节肿胀以及关节畸形等，严重影响了病人的生活质量。据统计， 60岁以上的人中发病率为50％，而在75岁老人中发病率高达80％。但到目前为 止，还没有公认的能改变骨关节炎疾病进程的的有效治疗策略，现有的治疗技术 主要是提供一些药物用于对骨关节炎患者疼痛症状的缓解。目前，在骨关节炎的 药物治疗中，首选药物依然是非甾体抗炎药。特异性的COX-2抑制剂如塞来昔 布罗非昔布等胃肠道安全性虽然优于传统的非甾体抗炎药，但经过长期研究表 明，长时间使用特异性COX-2抑制剂也可能增加心血管事件的风险，如心肌梗 塞、心血管血栓，受到FDA的警告。

SHP099作为蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的变构抑制剂于2016年被开发，对该 化合物的研究主要集中在抗肿瘤方面。关于其治疗骨疾病，尤其是治疗骨关节炎 的独特药理作用方面，迄今未见报道。本发明主要发现了SHP099对小鼠骨关节 炎模型具有显著的改善作用。

SHP099结构式如下：

三、发明内容

为了解决现有的临床治疗骨关节炎药物均用来消炎镇痛，还没有一种逆转改 变OA进程的药物，本发明案例提供了一种蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂SHP099可用于骨关节炎相关疾病的治疗。

对DMM手术诱导的小鼠骨关节炎模型，腹腔给药SHP099 10mg/kg能显 著降低OARSI评分。该化合物在软骨细胞上具有双向调控，一方面能抑制 Mmp13、Mmp3等用于降解软骨基质的基质金属蛋白酶的表达，从而抑制软骨 细胞的降解；另一方面还可以促进软骨合成marker如Aggrecan、Col2a1的表达 从而促进软骨合成。

以上结果提示，SHP099能改善小鼠骨关节炎的相关症状，尤其对软骨细胞 具有明显的作用，故其可在骨关节炎的治疗药物中得到应用。

附图说明

图1SHP099抑制DMM手术诱导的小鼠软骨损伤。

图1-A为SHP099给药治疗DMM手术诱导的OA模型下的番红固绿染色结 果；图1-B为SHP099给药治疗DMM手术诱导的OA模型下的OA关节软骨损 伤评分结果；图1-C为SHP099给药治疗DMM手术诱导的OA模型下的关节软 骨组织中的OA相关marker的表达的IHC和IF结果；图1-D为SHP099给药治 疗DMM手术诱导的OA模型下的关节软骨组织中的OA相关marker表达的统 计结果。给药治疗后结果以平均数±标准差表示。*：P<0.05，**：P<0.01，***： P<0.001vs DMM(Student’s-t test)。

图2SHP099促进自然衰老条件下的小鼠软骨损伤修复。

图2-A为SHP099给药治疗衰老小鼠(20M)6周后的关节部位番红固绿染 色结果；图2-B为SHP099给药治疗老年小鼠6周后的关节软骨厚度；图2-C为 SHP099给药治疗后老年小鼠关节软骨组织中的OA相关marker表达的IHC结果； 结果以平均数±标准差表示；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001vs PBS组 (Student’s-t test)。

图3在细胞水平上，SHP099抑制软骨降解，促进软骨合成。

图3：A-F分别为IL-1β诱导条件下SHP099对软骨降解相关基因Mmp3、 Mmp13、Adamts5和软骨合成相关基因Sox9、Col2a1、Acan等基因的mRNA水 平影响。图3-G为IL-1β诱导条件下SHP099对MMP3、MMP13、SOX9等蛋白 水平影响。图3-H为SHP099对软骨细胞存活的影响。结果以平均数±标准差表 示；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001vs IL-1β(Student’s-t test)。

图4SHP099促进OA病人软骨外植体ECM的合成。

图4:A-B为SHP099作用下OA病人软骨外植体的番红固绿染色结果。结 果以平均数±标准差表示：**：P<0.01，***：P<0.001vs 0(Student’s-t test)。

图5SHP099促进软骨细胞分化。

图5-A为SHP099对原代软骨细胞分化的阿尔新蓝染色结果；图5:B-D为 SHP099对原代软骨细胞过程中软骨合成相关基因Sox9、Col2a1、Acan的mRNA 水平影响。结果以平均数±标准差表示：**：P<0.01，***：P<0.001vs DM (Student’s-t test)。

具体实施方式

SHP099购自MCE。

实施例1：SHP099抑制DMM手术诱导的小鼠软骨损伤

技术方法：内侧半月板失衡(DMM)手术诱导的小鼠骨关节炎模型

取野生的C57BL/6雄性小鼠，8-10周龄，饲养于SPF级动物房，21±2℃， 自由饮水取食，12h昼夜交替。用阿弗丁(350ul-400ul)麻醉小鼠后，将小鼠右腿 膝关节毛发刮去，暴露膝关节，用手术刀片切断内侧半月板-胫骨韧带，游离内 侧半月板。第二天，将小鼠随机分为3组，正常组(Sham组)，模型组(DMM 组)，SHP099(10mg/kg)组。DMM+SHP099组按腹腔给药，每天一次，每次 100μl，正常组和模型组给予等量PBS。给药治疗42天后，最后实验动物进行 安乐死，取其右腿进行固定脱水包埋切片，进行番红固绿染色观察其软骨损伤修 复情况，对其胫骨损伤进行评分，评分标准按照国际骨关节炎研究协会(OARSI，Osteoarthritis Research Society International)制定的骨关节炎软骨病理评价体系OARSI Score system[1]来进行。

实施例3：SHP099促进自然衰老模型下的软骨损伤修复。

技术方法：自然衰老模型、番红固绿染色

野生的C57BL/6雄性小鼠，饲养至20个月大，生长条件同上。将小鼠随机 分为2组，PBS组和SHP099(10mg/kg)组。给药治疗42天后，最后实验动物 进行安乐死，取其右腿进行固定脱水包埋切片，进行番红固绿染色观察其软骨损 伤修复情况，对其胫骨损伤进行评分，

实施例4：在细胞水平上，SHP099抑制软骨降解，促进软骨合成。

技术方法：软骨细胞体外培养、qRT-PCR

取出生三天之内的野生C57小鼠的软骨细胞用胰酶消化30分钟后，继续用 0.2％二型胶原酶消化2h以上,分批收细胞，加入含10％血清的DMEM/F12置于 CO2恒温培养箱中培养。在体外培养至F1代后接种在24孔板中。临用前SHP099 用DMSO稀释成10mmol的母液，分装每管50ul,至于-20℃保存，避免反复冻融， 检测其他软骨分解代谢相关基因。SHP099提前预处细胞2h后,体外加10ng/ml IL-1β刺激软骨细胞模拟骨关节炎的炎症反应，12h后用Trizol收细胞提取细胞 中RNA反转成cDNA并进行qRT-PCR检测Mmp13、Mmp3和Adamts5等用于 降解软骨的基因的表达。

实施例5：SHP099促进OA病人软骨细胞外基质(ECM)的合成。

技术方法：软骨外植体培养实验、番红固绿染色

将进行关节置换手术的骨关节炎病人的膝关节软骨样本切割成1cm左右的 小块，置于24孔板中；饥饿24h后加入1ml含10％血清的DMEM/F12培养基， 培养基中包含了不同浓度的SHP099,在培养7天后将软骨外植体进行固定脱钙包 埋；进行番红固绿染色观察其软骨细胞外基质的合成情况。

实施例6：SHP099促进软骨细胞分化

技术方法：软骨细胞分化实验、阿尔新蓝染色、qRT-PCR

小鼠原代软骨细胞在增殖培养基(含10％血清的DMEM/F12)中培养待细胞长 满后接板至24孔板中，培养液换成软骨分化培养基(软骨分化培养基配方：ITS1x、 10ng/ml TGFβ3、地塞米松100nM、维生素C 50μg/ml、脯氨酸40μg/ml、丙酮 酸钠1mM)。并且在分化培养基的条件下加入不同浓度梯度的SHP099药物,培 养1.3.7后后进行阿尔新蓝染色，并收集分化培养两天后细胞提取RNA并反转 成cDNA并进行qRT-PCR，检测细胞中Sox9、Col2a1和Acan的表达情况。

SHP099药理实验结果分析

1)SHP099对DMM诱导的小鼠骨关节炎模型的影响

如图1所示，正常组(Sham组)相比，模型组(DMM组)OARSI评分明 显升高；给药SHP099 10mg/kg后显著降低OARSI评分。

如图1所示，与正常组相比，模型组的胫骨MMP13、MMP3、COLX等软 骨降解和肥大相关蛋白的表达明显增多，软骨合成相关基因SOX9表达下降，免 疫荧光及免疫组化染色结果显示，SHP099能明显抑制软骨降解酶的表达及软骨 细胞的肥大，并促进软骨合成因子SOX9的表达。

2)SHP099对自然衰老条件下的小鼠软骨退变模型的影响

如图2所示，与衰老组相比，给予SHP099治疗能明显促进软骨厚度的增加

3)SHP099对体外IL-1β诱导的小鼠骨关节炎模型的影响

如图3所示，在细胞水平上，SHP099抑制软骨降解，促进软骨合成

4)SHP099对自然衰老条件下的小鼠软骨退变模型的影响

如图3所示，与衰老组相比，给予SHP099治疗能明显促进软骨厚度的增加

5)SHP099对体外IL-1β诱导的小鼠骨关节炎模型的影响

如图4所示，在细胞水平上，SHP099抑制软骨降解，促进软骨合成SHP099 对自然衰老条件下的小鼠软骨退变模型的影响。