恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置和分离方法

摘要

本申请提供了一种恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置和分离方法，分离装置包括容纳罐、振动过滤筛、引流漏斗和过滤杯，振动过滤筛、引流漏斗和过滤杯均位于容纳罐内，振动过滤筛设有第一微孔滤膜，过滤杯设有第二微孔滤膜，过滤杯设置于振动过滤筛内，使得第二微孔滤膜对准第一微孔滤膜。第一微孔滤膜和第二微孔滤膜的微孔孔径设置，使得含有待去除细胞的胸腔积液依次经过第一微孔滤膜和第二微孔滤膜时，胸腺肿瘤细胞能够残留在第二微孔滤膜上。分离方法包括该分离装置的使用方法。本发明具有快速、高效的从胸腔积液中分离、富集肿瘤细胞的优点，可为下游的胸腔肿瘤细胞检测鉴定提供高纯度、高浓度的样本，提高了病原体检测的时间和准确性。

说明书

技术领域

本申请涉及先进制造加工与生物医学技术领域，特别是涉及恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置和分离方法。

背景技术

恶性胸腔积液(Malignantpleuraleffusion,MPE)是指原发于胸膜的恶性肿瘤或其他部位的恶性肿瘤转移到胸膜所引起的胸腔积液。国内目前尚缺乏MPE流行病学的调查研究资料。据统计，美国每年MPE的发病人数超过150000人，以人口基数校正，预计我国每年新发恶性胸腔积液约1200000人。几乎所有的恶性肿瘤都可以出现MPE，肺癌是最常见的病因，约占MPE的1/3，乳腺癌次之，淋巴瘤、卵巢癌、消化道肿瘤出现MPE亦不少见。5％～10％的MPE找不到原发肿瘤病灶。出现MPE表明肿瘤播散或进展至晚期，患者预期寿命将显著缩短。MPE从确诊开始计算，中位生存期为3～12个月，其中肺癌所导致的MPE的生存期最短。因此对该类患者及时诊断非常重要。

恶性胸腔积液的诊断标准是在胸水中发现恶性肿瘤细胞或胸膜上找到恶性肿瘤组织。传统的诊断思路是，首先鉴别胸腔积液是渗出液、漏出液；其次，如为渗出液需要结合患者情况考虑肿瘤、结核、炎性、创伤等可能。目前临床常用的检查手段包括胸腔积液的细胞病理、盲法或B超/CT引导下胸膜活检，对仍不能明确的可考虑内科胸腔镜或者胸外科开胸活检。胸腔积液细胞病理阳性率在30～62％，胸膜活检阳性率约30～40％，内科胸腔镜可以使90％以上的胸腔积液得到明确诊断。但后三者创伤性大，对于老年患者、全身衰竭患者更加倾向于胸腔积液细胞学检查。目前积液细胞学检查虽能明确诊断病因，但其诊断率仅有40-87％，因此，如何最大化利用胸腔积液、提高恶性胸腔积液肿瘤细胞的富集率和检出率，将有助于明确胸腔积液疾病诊断、避免进一步创伤性检查。

近年来，随着微/纳米技术的发展，从临床液体中回收特定细胞的灵敏度得到了显著提高。现已知的液体活检技术包括基于微流体的液体活检技术和基于过滤的液体活检技术(如微柱、微珠、微孔)。基于过滤的液体活检技术被认为是有望实现高通量的细胞富集方法。许多微孔滤器具有均匀的孔径和孔对孔空间，已经实现了高效的细胞富集。然而，这些过滤器的孔隙度仍然很低，只能实现低于2mL/min的过滤通量，不能完成大容量临床液体的富集过程。

发明内容

本申请提供一种恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置和分离方法，以解决上述提到的问题。

根据本发明的一个方面，提供一种恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置，包括容纳罐、振动过滤筛、引流漏斗和过滤杯，引流漏斗、振动过滤筛和过滤杯均位于容纳罐内。

其中，振动过滤筛包括盖形过滤部和设有振荡器的弹性支撑架，盖形过滤部的中间设有第一微孔滤膜，过滤杯包括杯体和盖于杯体上的第二微孔滤膜，过滤杯设置与弹性支撑架内，使得第二微孔滤膜位置对准第一微孔滤膜，引流漏斗的下端伸入盖形过滤部并位于第一微孔滤膜的上方，其下口对准第一微孔滤膜，过滤杯的上半部设有用于加速引流的负压吸引器。

其中，第一微孔滤膜的微孔孔径小于待去除大细胞的直径，且第一微孔滤膜的微孔孔径大于胸腺肿瘤细胞的直径与待去除小细胞的直径。第二微孔滤膜的微孔孔径小于胸腺肿瘤细胞的直径微孔而大于待去除小细胞的直径，使得含有待去除细胞的胸腔积液在经过第一微孔滤膜时避免待去除大细胞穿过第一微孔滤膜，同时使得胸腺肿瘤细胞和待去除小细胞穿过第一微孔滤膜，再使得胸腺肿瘤细胞残留在第二微孔滤膜上。

其中，第一微孔滤膜和第二微孔滤膜均采用聚对二甲苯Parylene C制成。

其中，第一微孔滤膜的微孔与微孔之间的间距和第二微孔滤膜的微孔与微孔之间的间距均小于非俘获目标的直径。

其中，第一微孔滤膜和第二微孔滤膜的微孔形状为正六边形或正方形。

其中，引流漏斗的上部外壁与容纳罐的内壁抵接，对引流漏斗形成水平限位，盖形过滤部的上口与引流漏斗的下端外壁抵接，对盖形过滤部形成水平定位，弹性支撑架的底部与容纳罐的内壁底部抵接，对弹性支撑架形成水平限位。

其中，弹性支撑架包括底座和四个设有弹簧的支撑柱，每个支撑柱的底部各设有一个微型振荡器，过滤杯的上端伸入至过滤部的下口，形成水平方向的限位。

其中，待去除大细胞包括纤维素样物质，待去除小细胞包括脱落间皮细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血细胞。

根据本发明的另一方面，提供基于该恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置的分离方法，包括以下步骤：步骤S1，打开微型振荡器和负压吸引器；步骤S2，将装有胸腔积液的容器置于容纳罐的上方，缓慢倾倒；步骤S3，待胸腔积液完全通过滤过装置后，关闭振荡器和负压吸引器，将下层膜取出，得到膜上富集的肿瘤细胞。

与现有技术相比，本申请包括以下优点：

本发明提供的恶性胸腔积液肿瘤细胞的分离装置，基于双层微孔滤膜，对胸腔积液中的肿瘤细胞进行富集回收，其主要依靠肿瘤细胞与体液中其他细胞之间的尺寸差异和变形能力差异，从而针对不同目标进行选择性地分离、富集。

本发明提供的应用恶性胸腔积液肿瘤细胞的分离装置具有快速、高效的从胸腔积液中分离、富集肿瘤细胞的优点，可为下游的胸腔肿瘤细胞检测鉴定提供高纯度、高浓度的样本，极大地提高了病原体检测的时间和准确性，经试验证明，能够在3分钟内完成样品的细胞分离。

本发明提供的恶性胸腔积液肿瘤细胞的分离装置和分离方法，能够高效地去除体液中的较大尺寸细胞(例如纤维素样物质)和较小尺寸细胞(主要为脱落间皮细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血细胞)，从而实现高效地分离胸腔积液中的恶性肿瘤细胞，俘获灵敏度高达80％(传统传统细胞离心方法的俘获灵敏度仅为45％左右)。

本发明提供的应用恶性胸腔积液肿瘤细胞的分离装置，其中的微孔滤膜具有很好的柔性，与下游各类检测的兼容性极高。滤膜上俘获细胞的可实现大视场扫描成像，通过基于AI的机器学习和识别来进行肿瘤细胞的判读/初筛。

附图说明

图1是本发明中恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置的结构示意图；

图2是本发明中恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置和分离方法与细胞离心方法对支气管肺泡灌洗液(BALF)脱落肿瘤细胞的检出结果对比图，其中图2a为上述两种方法的肿瘤细胞的检出率对比图，图2b为上述两种方法的肿瘤细胞的检出灵敏度对比图，图2c为本发明的恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置和分离方法对不同黏度灌洗液的检出率对比图；

图3是本发明中恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置的分离结果的电镜图；

图4是本发明中恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置的过滤通量结果图；

图5是是本发明中恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置的分离结果的扫描成像图。

具体实施方式

为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细的说明。

如图1所示，一种恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置，包括容纳罐1、振动过滤筛2、引流漏斗3和过滤杯4，振动过滤筛2、引流漏斗3和过滤杯(4)均位于容纳罐1内。

其中，振动过滤筛2包括盖形过滤部和设有振荡器的弹性支撑架，盖形过滤部的中间设有第一微孔滤膜210，过滤杯4包括杯体410和盖于杯体410上的第二微孔滤膜420，过滤杯4设置于弹性支撑架内，使得第二微孔滤膜420位于所述第一微孔滤膜210的下方，且位置对准第一微孔滤膜210，引流漏斗3的下端伸入盖形过滤部并位于第一微孔滤膜210的上方，其下口对准第一微孔滤膜210，过滤杯4的上半部设有用于加速引流的负压吸引器430用于加速引流。

引流漏斗3的上部外壁与容纳罐1的内壁抵接，对引流漏斗3形成水平限位，使引流漏斗3在水平方向位置固定。盖形过滤部的上口与引流漏斗3的下端外壁抵接，对所盖形过滤部形成水平限位，限定盖形过滤部在水平方向上的可移动距离。弹性支撑架的底部与所述容纳罐1的内壁底部抵接，对弹性支撑架形成水平定位，使弹性支撑架在水平方向位置固定。

在一个具体的实施例中，弹性支撑架包括底座和四个设有弹簧的支撑柱，每个支撑柱的底部各设有一个微型振荡器2310，过滤杯4的上端伸入至所述盖形过滤部的下口，形成水平方向的限位，限定过滤杯4在水平方向上的可移动距离。

在另一个具体的实施例中，弹性支撑架包括微型振动器、底座和四个设有弹簧的支撑柱，微型振动器设置于改性过滤部的外缘，四个支撑柱分别从四个方向连接盖形过滤部和底座，并对盖形过滤部实现支撑。

其中，第一微孔滤膜210的微孔孔径小于待去除大细胞的直径，且第一微孔滤膜210的微孔孔径大于胸腺肿瘤细胞的直径与待去除小细胞的直径；第二微孔滤膜420的微孔孔径小于胸腺肿瘤细胞的直径，使得含有待去除细胞的胸腔积液在经过第一微孔滤膜210时避免待去除大细胞穿过第一微孔滤膜210，同时使得胸腺肿瘤细胞和待去除小细胞穿过第一微孔滤膜210，再使得胸腺肿瘤细胞残留在第二微孔滤膜420上。

第一微孔滤膜210和第二微孔滤膜420均采用聚对二甲苯Parylene C制成。第一微孔滤膜210和第二微孔滤膜420是基于微机电系统工艺(Parylene MEMS工艺)采用聚对二甲苯Parylene C制成的，具有柔性，同时具有较高地机械强度。聚对二甲苯Parylene C具有的特征是可耐高温、且化学稳定性好，可以直接兼容后续多聚酶链式反应(PCR)检测技术体系。

本发明中，第一微孔滤膜210和第二微孔滤膜420两层滤膜的微孔的孔径不相同，第一微孔滤膜210的微孔孔径大于第二微孔滤膜420的微孔孔径。其中，第一微孔滤膜210的微孔孔径较大，用以根据细胞尺寸俘获去除体液中的待去除的较大尺寸细胞(主要为纤维素样物质)，第一微孔滤膜210和为微型振荡器的配合，使肿瘤细胞和待去除的较小尺寸细胞(主要为脱落间皮细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血细胞)快速穿过第一微孔滤膜210；而所述第二微孔滤膜420的微孔孔径较小，通过与负压器配合，用以俘获回收体液中的目标肿瘤细胞，使其滞留在第二微孔滤膜420上。

在一个具体的实施例1中，第一微孔滤膜210是边长为17mm的正方形滤膜；第二微孔滤膜420是边长为10mm的正方形滤膜；体液通过第一微孔滤膜210的工作面积为28.3mm

第一微孔滤膜210和所述第二微孔滤膜420可精确调控微孔孔径及微孔-微孔间距，第一微孔滤膜210的微孔孔径小于待去除的较大尺寸细胞(例如纤维素样物质)的直径；第二微孔滤膜420的微孔孔径小于目标肿瘤细胞的直径而大于待去除小细胞直径(例如脱落间皮细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血细胞)。同时，所述第一微孔滤膜210和所述第二微孔滤膜420可精确调控微孔拓扑形状。所述第一微孔滤膜210和所述第二微孔滤膜420具有和微孔特征尺寸相当的滤膜厚度。

第一微孔滤膜210的微孔为正六边形，正六边形的对角线长度在30-80μm，第一微孔滤膜4的厚度在5-12μm左右。第二微孔滤膜420的微孔为正方形，正方形的边长为5-12μm左右，第二微孔滤膜8的厚度在2-3μm左右，第一微孔滤膜210的孔间距为6-8μm，第二微孔滤膜420的孔间距为1-3μm。

在上述实施例1中，第一微孔滤膜210的微孔为正六边形，正六边形的对角线长度在40μm，第一微孔滤膜4的厚度在7μm左右。第二微孔滤膜420的微孔为正方形，正方形的边长为5μm左右，第二微孔滤膜8的厚度在3μm，第一微孔滤膜210的孔间距为6μm，第二微孔滤膜420的孔间距为1μm。

第一微孔滤膜210的微孔与微孔之间的间距和第二微孔滤膜420的微孔与微孔之间的间距均小于非俘获目标的直径(即微孔与微孔之间的间距小于待去除的细胞的直径)，这样可以尽量避免非俘获目标落在微孔与微孔之间的间隙上，形成“非特异性粘附”。非特异性粘附是指：如果微孔与微孔之间间隙过大(主要是指第一微孔滤膜210)，则小于第一微孔滤膜210的微孔的待去除的较小尺寸细胞(例如脱落间皮细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血细胞)和肿瘤细胞有较大可能落在间隙上，从而不能通过第一微孔滤膜210，即形成了“非特异性粘附”(因为第一微孔滤膜210本来应该特异性去除待去除的较大尺寸细胞(例如纤维素样物质)，而使待去除的较小尺寸细胞(例如脱落间皮细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血细胞)、肿瘤细胞通过)。

其中，非俘获目标相对于第一微孔滤膜210而言是指：除“待去除的较大尺寸细胞”以外的目标；非俘获目标相对于第二微孔滤膜420而言是指：除“肿瘤细胞”以外的目标。

其中，第一层过滤的过程如下：

将体液样本放入引流漏斗中；在重力和负压的驱动下，积液样本往下渗透；由于第一微孔滤膜210的微孔孔径小于待去除的较大尺寸细胞的直径，同时第一微孔滤膜210的微孔孔径大于肿瘤细胞和待去除的较小尺寸细胞的直径，振荡装置的设置，使微孔不会被纤维样物质或者细胞团堵塞，因此，待去除的纤维素样物质会被“拦截”在第一微孔滤膜210上，而肿瘤细胞、待去除的较小尺寸细胞以及其余积液可以穿过第一微孔滤膜210；

第二层过滤的过程如下：

经过第一微孔滤膜210过滤的积液样本落入第二微孔滤膜420的表面。残余体液属于流体，可以直接通过第二微孔滤膜420的微孔，由于负压和滤膜空隙的存在，待去除小细胞也会通过第二微孔滤膜420的微孔落入过滤杯的杯体中。肿瘤细胞会残留在第二微孔滤膜420上，将富集在第二微孔滤膜11的肿瘤细胞取下进行形态学、免疫组学、基因组学、功能性等研究。样本滤过完成，更换上、下双层微孔滤膜，可进行下一胸腔积液样本的富集。

基于该恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置的分离方法，具体包括以下步骤：

步骤S1，打开微型振荡器和负压吸引器。

步骤S2，将装有胸腔积液的容器置于容纳罐的上方，缓慢倾倒。

步骤S3，待胸腔积液完全通过滤过装置后，关闭振荡器和负压吸引器，将下层膜取出，得到膜上富集的肿瘤细胞。

试验例1

试验方法及步骤：

1.共入选39例胸腔积液标本。

入组标准：肿瘤合并中-大量胸腔积液患者；积液化验提示为渗出液。

2.对收集到的胸腔积液标本平均分为2等份。

(1)第一份标本首先进行离心(3000r，5min)，离心后弃去上清液，将沉渣进行重悬，总量为1ml样本，再进行超薄细胞涂片、苏木精-伊红(HE)染色。

(2)第二份标本应用本申请实施例1的双层滤膜装置分离细胞，1、记录每个样本的总量和滤过时间，将过滤器收集的细胞风干并用95％乙醇固定10min，然后进行HE染色。

(3)经验丰富的病理学专家对滤器和玻片上的细胞进行观察比对，确定俘获结果。

3.统计分析

实施例1的过滤装置与离心涂片法比较肿瘤细胞阳性检出率。

4.试验结果

1、对39例胸腔积液标本进行研究发现，本实施例1的滤膜分离装置和分离方法，将支气管肺泡灌洗液(BALF)脱落肿瘤细胞的检出率提高至80％，与之相比，传统细胞离心方法的检出率仅为45％，具体数据如图2(a)所示，分离结果图片如图3所示。

2、并且本实施例1的滤膜分离装置和分离方法，在检出灵敏度方面相对传统细胞离心方法有大幅的提高，具体数据如图2(b)所示。

3、于本实施例1的滤膜分离装置和分离方法，对于不同黏浊程度的BALF样品的阳性检出率没有区别，充分证明了本发明的基于滤膜分离装置的液态活检方法对实际临床BALF样品的普适通用性。

4、本实施例1的分离装置和方法实现了3分钟内完成54.6％BALF样品的细胞分离，其余样品均在10分钟内完成细胞分离(具体过滤通量，包括平均过滤通量和实时过滤通量，结果如图4所示)，从拿到样品到细胞分离、细胞检测、读片诊断全程可在30分钟内完成。

5、本装置与下游各类检测的兼容性极高。第二滤膜上俘获细胞的可实现大视场扫描成像(如图5所示)。

试验例2

为了验证实施例1的滤膜分离装置的细胞回收率，试验将肺泡灌洗液中10000个A549细胞进行了测试。试验步骤为：A549细胞被CellTrackerGreen(5μM,C2925,Invitrogen

试验结果表明，实施例1的滤膜装置达到了较高的细胞回收率89.8±5.2％。细胞离心法回收率较低，仅为13.6±7.8％。结果表明，本发明的滤膜装置和方法对A549细胞的回收率明显高于传统的细胞离心法。

综上所述，本发明的恶性胸腔积液肿瘤细胞分离装置和分离方法，相对于传统的细胞离心法，在肿瘤细胞的检出率和检查灵敏度方面，均具有大幅提升，并且其具有高滤过通量，因此对临床实践中恶性肿瘤细胞的诊断具有重要意义。

以上对本申请所提供的基于微孔滤膜的真菌孢子分离装置及其系统和分离方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。