一种淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒

摘要

本发明公开了一种淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒，包括顶部带盒盖的盒体，盒体内从上至下依次设有裂解腔、第一清洗腔和第二清洗腔，其中裂解腔连通至盒盖，第二清洗腔连通至盒体外侧底部设置的反应腔；所述裂解腔、第一清洗腔、第二清洗腔和反应腔的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞，柱塞的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔内设有扩增反应液，所述反应腔中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有淋病奈瑟菌PorA假基因的引物探针混合液。本发明可以在相对较低成本的情况下，快速一体化地淋病奈瑟菌进行PCR扩增及检测，解决现行技术重复性差、检测方法耗时、操作复杂等问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒，属于医学检测技术领域。

背景技术

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)是淋病奈瑟菌的简称，是淋病的病原菌，有严格的人类寄生性，对人体有很强的适应性和侵袭力。在奈瑟菌菌种中，对人致病的只有脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌，其他奈瑟菌则在一定条件下可引起人类的机会感染。流行病学的调查结果显示，淋病一直是性传播疾病中最常见、且为排列第一位的疾病。淋病的分布呈全球性，但主要分布于人口密集的发展中国家。淋球菌感染与年龄、性别、种族、受教育程度、性行为方式和机体免疫力有关，也受社会、文化和经济等因素影响。

淋病是发展中国家发病率最高的传染病之一，也是目前国内发病率最高的性病。感染NG初期，人体常无临床症状，但若得不到及时诊疗可能会导致严重的泌尿生殖道疾病，尤其是女性患者常导致盆腔炎或继发不孕。因此，及时准确诊断NG感染已成为治疗淋病的关键。

目前淋病奈瑟菌的检测方法主要有以下几种：

(1)分离培养法

目前世界卫生组织推荐的可筛选淋病的唯一方法是培养法，其优点是准确率高，对症状很轻或无症状的女性和男性病人都是敏感的，缺点是费时，代价高，且易受污染、用药状况、采样等多种因素的影响，检出率低，容易漏诊。NG耐药性也逐年上升，多重耐药菌的出现使NG培养日趋困难。

(2)显微镜观察法

最常用的方法是分泌物涂片作革兰染色，在光学显微镜下观察淋球菌细胞形态。革兰染色法具有操作简单、取材容易、成本低、易普及等优点，同时标本经染色后大大降低了病原体的污染。这种方法灵敏度高、操作简便、快速、结果易判断，但这种方法假阳性率比较高。同时革兰染色法易与其他革兰阴性球菌混淆，所以阳性检出率不高，即使有些标本中找到了淋病双球菌，只能疑为淋病也必须依靠其他实验室检查进一步诊断。

(3)核酸分子检测法

PCR法淋球菌阳性检出率高于革兰染色法，并且具有快速、敏感的特点，已广泛用于淋病实验室诊断，具有广阔的应用前景。采用实时荧光PCR方法，通过对等标本进行淋球菌核酸检测，可对感染进行确诊。但常规荧光PCR整体检测操作时间需要3-4小时，过程繁杂，且需要PCR实验室和专业人员，限制条件较多。

由于传统检测方法受标本的储存、运输条件以及细菌在培养基中生长状况的限制，常导致结果出现假阴性。病原菌培养是临床检验诊断NG感染的“金标准”，病原菌培养检测周期长，NG耐药性也逐年上升，多重耐药菌的出现使NG培养日趋困难。相关的非培养法，如直接免疫荧光分析法、酶免疫分析法的敏感性也较低。核酸检测目前陆续应用于淋球菌感染的诊断方面，具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点。

在上述方法虽然能在临床上提供较好的价值，却不能做到两全，省时省力的同时又无法确保结果准确性；在这样的条件下只能将样本至有资质的实验室，又会错过最佳治疗时间，在诊断周期上对医生和患者来说都是一个难题。为此开发出一个省时省力的淋病奈瑟菌的一体化核酸快速检测卡盒对基层检测机构来说无疑是解决了各种燃眉之急，没有核酸检测的门槛问题，只需要手工加样过程，而后的核酸提取检测均由机器完成，一方面减少了实验人员长期接触高危病毒，另一方面机器自动化使得检验结果的可靠性大大提高。为医务工作者提供方便的同时，也为患者争取最佳的治疗时间。

常规的核酸检测采用实时荧光定量PCR方法，操作技能要求严格，需经专业培训，执PCR上岗证上岗，必须在PCR认证实验室开展。淋球菌核酸检测根据核酸提取的方式的不同一般耗时30分钟至120分钟不等、核酸扩增时间在2小时之内，而加上试剂准备、加样、结果分析等人工操作的时间，一般一次实验需要耗时4-5小时，如果考虑到样本在院内的流转时间，则从患者取样到拿到检测结果一般需要6-8小时。绝大多数基层医院实验室并不具备上述专业人员和设备设施，只会将样本运送至有资质的实验室，而大部分情况下，有资质的实验室自己医院的样本都做不完，核酸确诊的难度可想而知。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒。它可以在相对较低成本的情况下，快速一体化地对淋病奈瑟菌进行PCR扩增及检测，解决现行技术重复性差、检测方法耗时、操作复杂等问题。

本发明的技术方案：一种淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒，其特点是：包括顶部带盒盖的盒体，盒体内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔、带第一清洗液的第一清洗腔和带第二清洗液的第二清洗腔，其中裂解腔连通至盒盖，第二清洗腔连通至盒体外侧底部设置的反应腔；所述裂解腔、第一清洗腔、第二清洗腔和反应腔的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞，柱塞的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔内设有扩增反应液；所述反应腔中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有淋病奈瑟菌PorA假基因的引物探针混合液；所述裂解腔内设有能穿过柱塞的柱塞孔的磁珠(磁珠可以在使用时加入裂解腔)。通过推动柱塞，可以使柱塞孔对准两个相邻腔体的连通区间，此时两个腔体件依靠附着在柱塞孔内的疏水性液态封闭材料进行隔离，然后磁珠(利用外部磁钢拖动)便可穿过柱塞孔的疏水性液态封闭材料，从一个腔体转移到另一个腔体。扩增反应所需的引物探针混合液在可熔性材料内，使反应液体系的反应液与引物探针混合液分离，避免PCR反应提前进行，延长卡盒的有效期。可熔性材料为石蜡、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃类物质中的任意一种或多种的组合，熔点范围为20℃-95℃，优选石蜡，使用时熔化为液态的石蜡油可以防止形成气溶胶的PCR产物污染环间；石蜡油热传导性弱，有效保证PCR的温度条件；石蜡的低温凝固特性在磁珠回拖温度下降后可以固定磁珠位置。石蜡可熔性使包埋物可以使反应液从隔离状态合并。

上述的淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒中，所述所述扩增反应液内包含Taq DNA聚合酶。

前述的淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒中，所述淋病奈瑟菌PorA假基因的引物探针混合液包括：淋病奈瑟菌PorA假基因上游引物和淋病奈瑟菌PorA假基因下游引物，内标上游引物和内标下游引物，以及淋病奈瑟菌PorA假基因探针和内标探针，具体为

前述的淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒中，所述裂解液包含1-1000mM乙酸-乙酸钠，0.1-20％聚乙二醇，0.1-10M异硫氰酸胍，pH值为2.0-7.0，溶剂为ddH

前述的淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒中，所述所述第一清洗液包含1-1000mMTris-HCl、和0.1-10％PEG；第二清洗液包含1-1000mM Tris-HCl、0.1-10％PEG和0.1-2％非蛋白封闭剂。溶剂为ddH

前述的淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒中，所述柱塞的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠的直径为0.1-100μm，疏水性液态封闭材料的密度为0.1-1.5g/cm

前述的淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒中，所述疏水性液态封闭材料为硅油。

前述的淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒中，所述反应腔为置于盒体外侧的锥管，锥管一侧设有平面，便于外部磁钢将磁珠拉回至上方的可熔性材料中(降温后凝固)，进而不会对光学检测产生干扰。

与现有技术相比，本发明的淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒，可对淋病奈瑟菌进行快速准确的检测。结合本发明经过反复研究试验而筛选出的引物与探针，使其在检测的时效性、特异性、灵敏性、便捷性和技术参数等多个方面都优于其它分子诊断试剂盒。

本发明涉及的淋病奈瑟菌一体化核酸快速检测卡盒具有以下优点：

1)全封闭式设计：1台AIGS设备，少量实验室基础小设备就能完成复杂的核酸检测实验。它采用将核酸提取、扩增、检测等流程集中在全封闭卡盒内，从结构上杜绝气溶胶污染，保护检测人员安全性，无需PCR实验室。大大降低了核酸检测对实验室建设标准的要求。有助于条件有限地区的联防布控；

2)极简操作：以手工操作时间2-5分钟，上机30-90分钟出结果，核酸提取与扩增一体化技术设计及自动判断软件，真正实现从样本处理到结果报告的全自动化，大大降低了对检验人员专业技能的要求，适合于快速现场的床边诊断；

3)冷藏保存：2-8度冷藏保存，无需常规的-20度冷冻保存，有助于产品的冷链运输和保存。

此外，本发明使用柱塞结合疏水性液态封闭材料的方式对多个功能性腔体进行隔离，使各个腔体间的液体不会外溢，生物样本能够在各个腔体内分别进行裂解、清洗纯化和扩增反应，并可以利用磁珠以附着方式将核酸依次带入各个腔体，其中疏水性液态封闭材料能够对磁珠有个分散作用，它能够允许穿过磁珠和磁珠上的核酸，阻隔其它杂质，当磁珠穿过时，磁珠上附着的如一些非极性大颗粒的杂质会浸润在疏水性液态封闭材料内而被截留，可以降低杂质对检测结果的影响。

图1是本发明卡盒的结构示意图；

图2是图1的侧向示意图。

附图中的标记为：1-盒体，2-盒盖，3-裂解腔，4-第一清洗腔，5-第二清洗腔，6-反应腔，7-柱塞，8-磁珠。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例。一种淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒，如图1所示：包括顶部带盒盖2的盒体1，盒体1内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔3、带第一清洗液的第一清洗腔4和带第二清洗液的第二清洗腔5，其中裂解腔3连通至盒盖2，第二清洗腔5连通至盒体1外侧底部设置的反应腔6；所述裂解腔3、第一清洗腔4、第二清洗腔5和反应腔6的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞7，柱塞7的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔6内设有扩增反应液；所述反应腔6中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有淋病奈瑟菌PorA假基因的引物探针混合液；所述裂解腔3内设有能穿过柱塞7的柱塞孔的磁珠8。所述扩增反应液内包含Taq DNA聚合酶。所述淋病奈瑟菌PorA假基因的引物探针混合液包括：淋病奈瑟菌PorA假基因上游引物和淋病奈瑟菌PorA假基因下游引物，内标上游引物和内标下游引物，以及淋病奈瑟菌PorA假基因探针和内标探针，具体为

所述裂解液包含1-1000mM乙酸-乙酸钠，0.1-20％聚乙二醇，0.1-10M异硫氰酸胍，pH值为2.0-7.0。所述所述第一清洗液包含1-1000mM Tris-HCl、和0.1-10％PEG；第二清洗液包含1-1000mM Tris-HCl、0.1-10％PEG和0.1-2％非蛋白封闭剂。

所述柱塞7的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠8的直径为0.01至100μm，疏水性液态封闭材料的密度为0.1-1.5g/cm

一、淋病奈瑟菌一体化核酸检测卡盒的建立。每管PCR加入30ul PCR扩增液及5ulDNA聚合酶液。并加入5ul模板DNA。

1分装PCR缓冲液：向扩增区底部分装30ul PCR缓冲液；PCR缓冲液的组成为：50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L(NH

2包埋引物探针混合液：在PCR缓冲液上层用可熔性材料包埋5ul引物探针混合液：5ul引物探针用于检测PorA假基因的探针使用浓度500nM，用于检测内标的探针使用浓度200nM，用于检测PorA假基因的上下游引物使用浓度400nM，用于检测内标的上下游引物使用浓度250nM。

3封闭：用适量硅油封闭反应液；

4分装第二清洗液：向第二清洗腔分装140ul第二清洗液，100mM乙酸-乙酸钠，1％PEG，3.5M GTC；

5封闭：用适量硅油封闭第二清洗液；

6分装第一清洗液：向第一清洗腔分装140ul第一清洗液：100mM Tris-HCl，2％PEG；

7封闭：用适量硅油封闭第一清洗液，；

8分装裂解液：向裂解液区分装800ul裂解液。裂解液：10mM Tris-HCl，2％PEG，1.8％无蛋白封闭液。

二、使用方法及快速鉴定。

样本的采集、保存和运输。

1.1样本类型：拭子；

1.2样本采集：

建议样本按国家标准：《GB 15975-1995淋病诊断标准及处理原则》和行业标准：《中华人民共和国卫生行业标准淋病诊断标准(WS268-2019)》

尿道拭子:对男性患者，先用生理盐水清洗尿道口，将男用取材拭子插入尿道内2cm～3cm，稍用力转动，保留5s～10s后取出。

女性生殖道拭子：用扩阴器扩张阴道，先用无菌棉球擦去宫颈口分泌物；用女性拭子于阴道深部或阴道后穹窿、宫颈口等处取材，取出拭子到采样管。

检测卡盒的使用。

打开卡盒的盖子，再打开封口膜，加入10μL的磁珠(使用前请振荡使之充分悬浮)。再加入200μL样本，用移液器分吹打试剂混匀(建议至少吹打15次)，后盖紧盖子。

实时荧光定量PCR扩增及检测。

2.1样本检测

应用全自动核酸检测荧光定量PCR仪Life Ready K1000，采用全自动核酸检测分析系统对PCR扩增产物进行分析，综合扩增曲线与Tm值判定结果。荧光通道设置如下表。

设置扩增程序如下：

2.2对照组设置。

本发明对淋病奈瑟菌NG序列进行分析和研究，设计了下表所示的引物探针组。

本发明引物探针

对照组1引物探针

对照组2引物探针

各组引物探针配置的反应液检测结果如下：

结果显示：对比对照组1-2，本发明的引物探针的检测敏感性和特异性最优。

2.3结果分析。

1.检测程序运行结束后，适用仪器自动报告检测结果。

2.结果显示淋球菌(Neisseria Gonorrhoeae)PorA假基因(FAM)、内部质控(ROX)的检测结果。

3.淋球菌(NG)PorA假基因(FAM)基因结果应呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，且Ct≤38，判为淋球菌(Neisseria Gonorrhoeae)阳性。

4.内部质控ROX荧光通道检测结果应呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)。当靶标(FAM)阴性且内部质控Ct≤38时，实验结果有效。否则需要重新取样后检测。

2.4为检测本发明卡盒针对UU检测的准确性和有效性，我们对卡盒的灵敏度和特异性进行测试。

1)对不同浓度的NG质控品进行检测，来确认检测限；

2)1.2对可能在相同取样部位取到的其他病原体(包括解脲脲原体、人型支原体、单纯疱疹病毒、人类乳头状瘤病毒、沙眼衣原体、人巨细胞病毒、肺炎支原体、生殖支原体以及克鲁斯假丝酵母、表皮葡萄球菌、粪链球菌、热带假丝酵母、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种、乳酸乳球菌乳亚种、无乳链球菌(GBS)等均进行检测，来验证特异性。

结果：我们对不同浓度的UU质控品进行检测，如下表是PorA假基因的结果。

确认本发明的检测卡盒对UU的检测限为250copies/ml。

3)可能在相同取样部位取到的其他病原体(包括解脲脲原体、人型支原体、单纯疱疹病毒、人类乳头状瘤病毒、淋病奈瑟菌、人巨细胞病毒、肺炎支原体、生殖支原体以及克鲁斯假丝酵母、表皮葡萄球菌、粪链球菌、热带假丝酵母、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种、乳酸乳球菌乳亚种、无乳链球菌(GBS)等均无非特异性扩增。

三、检测实例。

浙江邵逸夫医院验证结果。

样本类型：男性尿道拭子、女性生殖道拭子

样本数量：196例

临床样本检测结果如下表所示：

52例阳性样本经对比方法确认后，检测结果一致结论：196例样本检测结果中52例阳性样本符合率100％，144例阴性样本符合率100％。

以上所述实施例为本发明较佳实施例，并不用以限制本发明，其他的任何未背离本发明的实质原理所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州遂曾生物技术有限公司

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