海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法及应用

摘要

本发明公开了一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；二、使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的培养基中，孵育培养；三、离心去除感染期幼体，收集上清液；四、上清液通过滤膜除菌，浓缩滤液；五、浓缩液离心收集外泌体粗沉淀；六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的PBS重悬，并加入蛋白酶抑制剂；七、离心去除上清液，使用重悬沉淀，获得所述外泌体。本发明能够有效分离提取刺激隐核虫的外泌体，提取后的外泌体具有典型的碟形或茶托形囊泡状结构，粒径大小整体符合标准，且外泌体提取浓度较高。

说明书

技术领域

本发明属于外泌体提取领域。更具体地说，本发明涉及一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体的提取分离方法。

背景技术

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown1951)，俗称海水小瓜虫，属于前口纲(Class Prostomatea)、前管目(Order Proreodonisa)、隐核虫科(FamilyCryptocaryonidae)、隐核虫属(Genus Cryptocaryon)。刺激隐核虫作为一种寄生性海水纤毛虫，广泛分布于大西洋、加勒比海、波斯湾、印度洋、我国东海和南海等热带和亚热带海域，对少数软骨鱼和绝大多数硬骨鱼类都具有很强的感染性。刺激隐核虫主要寄生宿主的背部皮肤，鳍条和鳃瓣，以及眼角膜和口腔等暴露位置。受感染的患鱼皮肤和鳃因受到刺激，从而分泌大量粘液，甚至形成增生组织。严重感染病鱼体表形成一层浑浊的白色粘膜，皮肤出现密集的点状充血，眼角膜出现损伤。严重的机械损伤往往又导致继发性细菌感染，引起体表溃烂，喙部、鳍条溃烂缺损，甚至出现败血症状，最终导致死亡。刺激隐核虫病爆发无征兆，传播蔓延速度较快，死亡率高，短期内可导致养殖区鱼类毁灭性死亡。2008年，我国农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》中，已经将刺激隐核虫病列为二类动物疫病。

外泌体作为生物体广泛存在的最小的细胞囊泡，是通过多泡体和腔内囊泡融合形成，直径约30-150nm，密度在1.13-1.19g/mL之间。外泌体可通过向临近及其他细胞传递内含的蛋白质、脂质和核酸，在诸如细胞间通讯、疾病发生、生长发育等一系列的生物学效应中发挥调控作用。近年来，随着外泌体的发现及其在寄生虫分泌/排泄物信号传递和细胞功能调控中的重要性，寄生虫病中的外泌体已成为研究关注的焦点，而刺激隐核虫外泌体的研究对于理解刺激隐核虫与宿主相互调控及刺激隐核虫病的防治具有重要意义。因此，寻找一种有效提取刺激隐核虫外泌体的方法很有必要。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其能够有效分离提取刺激隐核虫的外泌体，提取后的外泌体浓度、纯度均很高，粒径大小整体符合标准。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：

步骤一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；

步骤二、包囊孵化，感染期幼虫逸出后，使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的海水等渗Leibovitz's L-15细胞培养基中，孵育培养；

步骤三、离心去除感染期幼体，收集上清液；

步骤四、上清液通过0.22μm滤膜除菌，并浓缩滤液，获得浓缩液；

步骤五、浓缩液离心收集外泌体粗沉淀；

步骤六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的PBS重悬，并加入1×HALT蛋白酶抑制剂；

步骤七、离心去除上清液，使用预冷DEPC PBS溶液重悬沉淀，获得所述刺激隐核虫外泌体。

优选的是，步骤一中，所述抗生素为80-100I.U.ml

优选的是，步骤二中，无菌滤网收集感染期幼虫后稀释至1×10

优选的是，步骤三中，离心力为1000-1500×g以达到去除刺激隐核虫感染期幼虫的作用。

优选的是，步骤四中，使用vivaflow超滤膜包系统进行浓缩。通过vivaflow超滤膜包系统进行培养基浓缩，浓缩至适宜进行超速离心的体积，一般是<15mL。

优选的是，步骤五中，浓缩液在离心力为100000×g的条件下离心120min以达到富集分离培养基中外泌体的作用。

优选的是，步骤六中，PBS的使用量为2-5ml。

优选的是，步骤七中，离心条件为4℃冷冻条件下，120000×g离心60min，去除上清液。

优选的是，步骤七中，使用预冷DEPC PBS溶液重悬沉淀的体积为200-300μl以避免外源核酸污染，所述刺激隐核虫外泌体的保存条件为-80℃。

上述方法提取的刺激隐核虫外泌体的外泌体在后续转录组学、蛋白质组学分析及制备外泌体载药系统中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：本发明通过体外暂养刺激隐核虫的方式，收集培养液，在提取外泌体，降低了外泌体的分离难度，提高了外泌体的纯度，并且本发明提取的外泌体在电镜视野下具有典型的碟形或茶托形的囊泡状结构，且囊泡粒径大小符合外泌体的检测标准。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明提取的刺激隐核虫的外泌体的粒径检测分析图。

图2为本发明提取的刺激隐核虫的外泌体的电镜检测分析图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：

步骤一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；

步骤二、包囊孵化，感染期幼虫逸出后，使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的海水等渗Leibovitz's L-15细胞培养基中，孵育培养；

步骤三、离心去除感染期幼体，收集上清液；

步骤四、上清液通过0.22μm滤膜除菌，浓缩滤液，获得浓缩液；

步骤五、浓缩液离心收集外泌体粗沉淀；

步骤六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的PBS重悬，并加入1×HALT蛋白酶抑制剂；

步骤七、离心去除上清液，使用预冷DEPC PBS溶液重悬沉淀，获得所述刺激隐核虫外泌体。

实施例2

一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：

步骤一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；其中，所述抗生素为100I.U.ml

步骤二、包囊孵化，感染期幼虫逸出后，使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的海水等渗Leibovitz's L-15细胞培养基中，孵育培养；

步骤三、离心去除感染期幼体，收集上清液；

步骤四、上清液通过0.22μm滤膜除菌，浓缩滤液，获得浓缩液；

步骤五、浓缩液离心收集外泌体粗沉淀；

步骤六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的PBS重悬，并加入1×HALT蛋白酶抑制剂；

步骤七、离心去除上清液，使用预冷DEPC PBS溶液重悬沉淀，获得所述刺激隐核虫外泌体。

实施例3

一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：

步骤一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；其中，所述抗生素为80I.U.ml

步骤二、包囊孵化，感染期幼虫逸出后，使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的海水等渗Leibovitz's L-15细胞培养基中，孵育培养；其中，无菌滤网收集感染期幼虫后稀释至1×10

步骤三、离心去除感染期幼体，收集上清液；

步骤四、上清液通过0.22μm滤膜除菌，浓缩滤液，获得浓缩液；

步骤五、浓缩液离心收集外泌体粗沉淀；

步骤六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的PBS重悬，并加入1×HALT蛋白酶抑制剂；

步骤七、离心去除上清液，使用预冷DEPC PBS溶液重悬沉淀，获得所述刺激隐核虫外泌体。

实施例4

一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：

步骤一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；其中，所述抗生素为100I.U.ml

步骤二、包囊孵化，感染期幼虫逸出后，使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的海水等渗Leibovitz's L-15细胞培养基中，孵育培养；其中，无菌滤网收集感染期幼虫后稀释至1×10

步骤三、在离心力为1000×g的条件下离心去除感染期幼体，收集上清液；

步骤四、上清液通过0.22μm滤膜除菌，浓缩滤液，获得浓缩液；

步骤五、浓缩液离心收集外泌体粗沉淀；

步骤六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的PBS重悬，并加入1×HALT蛋白酶抑制剂；

步骤七、离心去除上清液，使用预冷DEPC PBS溶液重悬沉淀，获得所述刺激隐核虫外泌体。

实施例5

一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：

步骤一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；其中，所述抗生素为90I.U.ml

步骤二、包囊孵化，感染期幼虫逸出后，使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的海水等渗Leibovitz's L-15细胞培养基中，孵育培养；其中，无菌滤网收集感染期幼虫后稀释至1×10

步骤三、在离心力为1500×g的条件下离心去除感染期幼体，收集上清液；

步骤四、上清液通过0.22μm滤膜除菌，使用vivaflow超滤膜包系统进行浓缩滤液，获得浓缩液；

步骤五、浓缩液离心收集外泌体粗沉淀；

步骤六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的PBS重悬，并加入1×HALT蛋白酶抑制剂；

步骤七、离心去除上清液，使用预冷DEPC PBS溶液重悬沉淀，获得所述刺激隐核虫外泌体。

实施例6

一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：

步骤一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；其中，所述抗生素为80-100I.U.ml

步骤二、包囊孵化，感染期幼虫逸出后，使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的海水等渗Leibovitz's L-15细胞培养基中，孵育培养；其中，无菌滤网收集感染期幼虫后稀释至1×10

步骤三、在离心力为1000×g的条件下离心去除感染期幼体，收集上清液；

步骤四、上清液通过0.22μm滤膜除菌，使用vivaflow超滤膜包系统进行浓缩滤液，获得浓缩液；

步骤五、浓缩液在离心力为100000×g的条件下离心120min收集外泌体粗沉淀；

步骤六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的PBS重悬，并加入1×HALT蛋白酶抑制剂；

步骤七、离心去除上清液，使用预冷DEPC PBS溶液重悬沉淀，获得所述刺激隐核虫外泌体。

实施例7

一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：

步骤一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；其中，所述抗生素为80I.U.ml

步骤二、包囊孵化，感染期幼虫逸出后，使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的海水等渗Leibovitz's L-15细胞培养基中，孵育培养；其中，无菌滤网收集感染期幼虫后稀释至1×10

步骤三、在离心力为1200×g的条件下离心去除感染期幼体，收集上清液；

步骤四、上清液通过0.22μm滤膜除菌，使用vivaflow超滤膜包系统进行浓缩滤液，获得浓缩液；

步骤五、浓缩液在离心力为100000×g的条件下离心120min收集外泌体粗沉淀；

步骤六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的2ml PBS重悬，并加入1×HALT蛋白酶抑制剂；

步骤七、离心去除上清液，使用预冷DEPC PBS溶液重悬沉淀，获得所述刺激隐核虫外泌体。

实施例8

一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：

步骤一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；其中，所述抗生素为100I.U.ml

步骤二、包囊孵化，感染期幼虫逸出后，使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的海水等渗Leibovitz's L-15细胞培养基中，孵育培养；其中，无菌滤网收集感染期幼虫后稀释至1×10

步骤三、在离心力为1000×g的条件下离心去除感染期幼体，收集上清液；

步骤四、上清液通过0.22μm滤膜除菌，使用vivaflow超滤膜包系统进行浓缩滤液，获得浓缩液；

步骤五、浓缩液在离心力为100000×g的条件下离心120min收集外泌体粗沉淀；

步骤六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的5ml PBS重悬，并加入1×HALT蛋白酶抑制剂；

步骤七、离心条件为4℃冷冻条件下，120000×g离心60min，去除上清液，使用预冷DEPC PBS溶液重悬沉淀，获得所述刺激隐核虫外泌体。

实施例9

一种海水寄生纤毛虫刺激隐核虫的外泌体提取分离方法，其包括以下步骤：

步骤一、收集刺激隐核虫包囊后，将包囊清洗干净，置于含有抗生素的无菌海水中进行孵化；其中，所述抗生素为80I.U.ml

步骤二、包囊孵化，感染期幼虫逸出后，使用无菌滤网收集感染期幼虫，在含有抗生素、无外泌体胎牛血清的海水等渗Leibovitz's L-15细胞培养基中，孵育培养；其中，无菌滤网收集感染期幼虫后稀释至1×10

步骤三、在离心力为1500×g的条件下离心去除感染期幼体，收集上清液；

步骤四、上清液通过0.22μm滤膜除菌，使用vivaflow超滤膜包系统进行浓缩滤液，获得浓缩液；

步骤五、浓缩液在离心力为100000×g的条件下离心120min收集外泌体粗沉淀；

步骤六、外泌体粗沉淀使用无菌预冷的3ml PBS重悬，并加入1×HALT蛋白酶抑制剂；

步骤七、离心条件为4℃冷冻条件下，120000×g离心60min，去除上清液，使用预冷的体积为200μl的DEPC PBS溶液重悬沉淀，获得所述刺激隐核虫外泌体，所述刺激隐核虫外泌体的保存条件为-80℃。

对本实施例提取的外泌体进行粒径分布检测，结果如图1所示；对本实施例提取的外泌体进行电镜检测，结果如图2所示。

实施例10

将实施例1-9任一项所提取的刺激隐核虫的外泌体应用于后续转录组学、蛋白质组学分析及制备外泌体载药系统。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。