一种基于VDBP/VSIG4的免疫负向调节多价疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种基于VDBP/VSIG4的免疫负向调节多价疫苗及其制备方法，该疫苗为VDBP多价表位肽与VSIG4基因重组表达载体的复合物；VDBP1多价表位肽/VDBP2多价表位肽分别由表位VDBP211–219/VDBP 235–243与穿膜序列LWMRWYSPK和接头序列组成，穿膜序列位于氨基端，表位VDBP211–219/VDBP 235–243序列位于羧基端，表位与穿膜序列之间以接头序列连接；该疫苗可成通过穿膜序列进入细胞，有效促进1型糖尿病抗原表位VDBP1/VDBP2进入抗原递呈途径，进一步合成VSIG4蛋白，抑制VDBP特异性CD8+T细胞应答，达到降低免疫应答，从而延长1型糖尿病的病程进展。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多价疫苗，特别涉及一种1型糖尿病的双靶向免疫负向调节多价疫苗，还涉及该疫苗的制备方法。

背景技术

近年来全球范围内糖尿病的患病率在逐年上升,最新流行病学调查显示,预计到2040年全球糖尿病患病总人数将达到6.42亿。糖尿病分型中以1型和2型两种较为常见，其中1型糖尿病(type 1diab T1DM)占糖尿病总数的10％～15％，它是一种在T淋巴细胞介导下，出现胰岛β细胞损伤、胰岛功能受损，导致胰岛素分泌绝对不足的自身免疫性疾病。在T1DM发病机制中,有遗传、饮食、环境等多种因素参。

维生素D结合蛋白(vitamin D binding protein,VDBP)为球蛋白,是一种58k Da糖蛋白, 作为血浆维生素D及其代谢物的主要载体蛋白,支持活性1,25-二羟维生素D[1,25(OH)2D] 及其前体25-羟维生素D[25(OH)D]的生物利用度,最重要的作用是维持维生素D的生物活性。VDBP作为25-(OH)VitD3/VDBP复合物被巨噬细胞介导的内吞作用重新吸收,并被近端小管上皮细胞分解代谢,有助于降低其尿排泄水平。最近相关研究表明,1型糖尿病(T1DM) 或2型糖尿病(T2DM)伴正常蛋白尿、微量蛋白尿、大量蛋白尿患者尿VDBP均增高。因此，VDBP有望成为1型糖尿病的相关抗原。

新近鉴定的B7家族相关蛋白VSIG4(V-set and immunoglobulin domain-containing4),又称为Ig超家族蛋白-39(Ig superfamily protein 39,Z39Ig)。VSIG4特异性的表达在组织巨噬细胞上,如腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages,PEMs)、肝Kupffer细胞。最初的研究表明,VSIG4 作为补体受体通过与其配体C3b/i C3b结合,介导经C3b调理的病原体的清除。Ⅰ型糖尿病(非肥胖性)小鼠模型中发现,VSIG4+巨噬细胞与糖尿病抵抗相关。另外,作为孤儿配体,VSIG4与 T细胞上的未知配体结合,抑制T细胞的增殖、活化及IL-2的产生。表明VSIG4可能在炎性病理损伤中传递抗炎信号。

由于细胞膜的屏障作用，生物大分子不能自由进入细胞。近年来，一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽相继被发现，其可有效携带外源性大分子进入细胞，并对宿主细胞没有显著毒副作用。这些具有细胞穿透能力的多肽被命名为细胞穿膜肽(CPP)。研究发现，LWMRWYSPK可有效促进与之偶联的外源表位进入MHC-Ⅰ类抗原递呈途径，表现为动力学显著增强，且该过程表现为蛋白酶体/TAP非依赖、氨基肽酶依赖。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种1型糖尿病的免疫负向调节多价疫苗，目的之二在于提供所述1型糖尿病的免疫负向调节多价疫苗的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、1型糖尿病的免疫负向调节多价疫苗，其特征在于：该疫苗为VDBP1多价表位肽、VDBP2多价表位肽与VSIG4基因重组表达载体的的复合物；

所述VDBP1多价表位肽由穿膜序列LWMRWYSPK、接头序列：SYSY、糖尿病相关抗原VDBP蛋白CD8细胞表位VDBP 211–219：LLTTLSNRV组成；

所述VDBP2多价表位肽由穿膜序列LWMRWYSPK接头序列：SYSY、糖尿病相关抗原VDBP蛋白CD8细胞表位VDBP 235–243：NLIKLAQKV组成；

在所述VDBP1表位肽、VDBP2表位肽中，穿膜序列均位于氨基端，CD8细胞表位序列均位于羧基端，表位与穿膜序列或表位之间均以接头序列连接。

2、根据权利要求1所述1型糖尿病的免疫负向调节多价疫苗，其特征在于：所述接头序列为SYSY。

3、根据权利要求1所述1型糖尿病的免疫负向调节多价疫苗，其特征在于：所述VDBP1 表位肽、VDBP2表位肽的摩尔比为1:1。

4、根据权利要求1所述1型糖尿病的免疫负向调节多价疫苗，其特征在于：所述VSIG4 基因重组表达载体是在真核表达载体pAZV5Z中插入VSIG4序列而得到。

5、权利要求1所述1型糖尿病的免疫负向调节多价疫苗的制备方法，其特征在于：在搅拌条件下，向溶解有VSIG4基因重组表达载体的0.5％的KHCO

6、根据权利要求5所述1型糖尿病的免疫负向调节多价疫苗的制备方法，其特征在于：所述VDBP1表位肽、VDBP2表位肽的摩尔比为1:1。

本发明的有益效果在于：本发明疫苗可通过穿膜序列进入细胞，有效促进1型糖尿病抗原表位VDBP1/VDBP2进入抗原递呈途径激发特异性CD8+T细胞应答，同时VSIG4基因在细胞内表达生成VSIG4蛋白，诱导特异性CD8+T细胞免疫抑制，达到降低免疫应答，从而延长1 型糖尿病的病程进展。

动物实验结果证实，本发明疫苗能够抑制特异性的CD8+T细胞的增值和细胞因子分泌，并进一步降低糖尿病小鼠的发病率，减轻胰岛细胞损伤，达到治疗1型糖尿病的的作用。本发明疫苗制备方法简单，成本低廉，在1型糖尿病预防领域有着较好的开发应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为VDBP1表位肽、VDBP2表位肽的一级结构示意图；

图2为VSIG4基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图3为VSIG4重组真核表达质粒双酶切产物电泳鉴定图；

图4为本发明疫苗的透射电镜图；

图5为多价疫苗VDBP/VSIG的免疫印迹(Western Blot)结果；

图6为淋巴细胞增殖能力的检测结果；

图7为淋巴细胞分泌细胞因子能力的检测结果；

图8为NOD小鼠糖尿病的平均发病率；

图9为胰岛平均生存期检测结

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、1型糖尿病的免疫负向调节多价疫苗的制备

1、VDBP1表位肽、VDBP2表位肽的设计与合成

本发明设计的VDBP1表位肽、VDBP2表位肽的一级结构如图1所示，各表位与穿膜序列或表位肽序列之间以接头序列连接，以便于各表位保持独立性和能够有效递呈。在本实施例中，接头序列为丝氨酸-酪氨酸-丝氨酸-酪氨酸(Ser-Tyr-Ser-Tyr，SYSY)；VDBP1表位肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，VDBP2表位肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所；同时，以卵清蛋白(OVA)表位肽作为对照肽(由表位OVA257-264、穿膜序列HIV-Tat49-57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列组成，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

多肽的合成在ABI 431A型固相多肽合成仪(美国PE公司)上进行。方法采用标准芴甲氧羰基(Fmoc)方案，精氨酸采用两次偶联。起始选用0.125mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP树脂)，按照多肽序列使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸，每种氨基酸的用量为0.5mmol，与树脂的摩尔比为4:1。各种氨基酸的α-氨基为Fmoc保护，其余侧链保护基团分别为：Lys(Boc)、Ser(tBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)、His(Trt)、Thr(tBu)和Tyr(tBu)。第一个氨基酸连接到树脂上用4-二甲氨基吡啶(DMAP)，氨基酸的活化用1-羟基苯并三唑(HOBt) 和二环己基碳二亚胺(DCC)，偶联后用体积分数为20％的哌啶水溶液去除Fmoc保护基。多肽合成后，将树脂-粗肽产品在冰浴条件下混合于10mL切割液A(由结晶苯酚0.75g、1,2-乙二硫醇即EDT 0.25mL、苯甲硫醚0.5mL、去离子水0.25mL和三氟乙酸即TFA 10mL组成) 中，待切割液温度上升至室温后，搅拌反应2小时，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团。将反应混合液经G4玻砂漏斗过滤以去除树脂，先后用1mL TFA、5～10mL二氯甲烷反复冲洗反应瓶、树脂和漏斗。将滤液在常温低压下蒸发至1～2mL，加入50mL预冷乙醚沉淀多肽，4℃放置过夜，G6玻砂漏斗过滤，真空抽干，即得多肽粗品，-20℃保存备用。

将多肽粗品用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成浓度为20mg/mL的溶液，经孔径为0.45μm 的微孔滤膜过滤后，在AKTA explorer 100型中压液相色谱仪(瑞典AmersshamBioscienc公司)上用SOURCE凝胶柱进行纯化。流动相A由体积百分含量为10％的乙醇和体积百分含量为0.1％的TFA组成，流动相B由体积百分含量为90％的乙醇和体积百分含量为0.1％的 TFA组成；洗脱梯度为：先用流动相A 1.5个柱体积洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液(流动相B占混合液的体积分数在8个柱体积内由0％逐渐增加至80％)洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液(流动相B占混合液的体积分数在0.5个柱体积内由80％逐渐增加至100％)洗脱，在主峰处收集多肽溶液，冷冻干燥，即得多肽纯品，用DMSO溶解，-20℃保存备用。

将多肽纯品用Delta 600型高压液相色谱仪(美国Waters公司)鉴定纯度，采用Symmetry ShieldTM C18柱，流动相由体积百分含量为10％～60％的乙腈和体积百分含量为0.1％的TFA 组成，梯度洗脱，流速为1mL/min。结果显示，合成多肽的纯度均达到90％以上。同时，将多肽纯品用API 2000LC/MS型电喷雾离子化质谱仪测定分子量。结果显示，合成多肽的分子量均与理论值相符。

2、VSIG4基因重组表达载体的构建

(1)VSIG4全长编码基因的克隆

根据GenBank登录号为NC_000086.8的VSIG4基因序列，设计并合成上下游引物,序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。PCR引物以扩增VSIG4全长编码基因；以人胎盘cDNA文库为模板进行PCR，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、56℃退火30 秒，72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与载体pGEM-T连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有Amp/IPTG/X-GAL的培养基进行蓝白斑筛选，挑取白斑培养，提取质粒，委托上海生工公司测定基因序列，将序列正确的阳性克隆质粒命名为pGEM-T/VSIG4；

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图如图2所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见1泳道在约1200bp处呈单一特异性条带，与预期结果相符；质粒的测序结果显示插入基因序列与VSIG4全长编码基因序列一致。

(2)VSIG4基因重组真核表达载体的制备

根据VSIG4全长编码基因序列和真核表达载体pAZV5Z的多克隆位点，设计并合成PCR 引物，序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；以扩增包含VSIG4全长编码基因、5’端XBI 酶切位点和3’端Ecor1酶切位点的cDNA片段；以pGEM-T/VSIG4为模板进行PCR，PCR条件与步骤(1)相同；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，用限制性内切酶XBI和Ecor1进行双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经XBI和Ecor1双酶切的pAZV5Z在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用含有Amp/IPTG/X-GAL的培养基进行蓝白斑筛选，挑取白斑培养，提取质粒，用XBI和Ecor1进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定基因序列，将序列和阅读框架正确的阳性克隆质粒命名为pAZV5Z/VSIG4；

重组真核表达质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图如图3所示，其中M泳道为DNA 分子量标准，1泳道为双酶切产物，可见1泳道在约3000bp和1000bp处出现两条电泳带，与预期结果相符；质粒的测序结果显示插入基因序列无突变，阅读框架正确，无移码。

3、VDBP1表位肽、VDBP2表位肽与VSIG4基因重组表达载体的复合物的制备

将pAZV5Z/VSIG4用浓度为0.5％的KHCO

透射电镜分析：将新制复合物滴于200目铜网上，吸附3分钟，用吸水纸吸干，晾干30秒，以质量体积百分浓度为1％的醋酸铀水溶液负染30秒，用吸水纸吸干，晾干30秒，80kV透射电镜观察。结果如图4所示，所得复合物呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。

二、多价疫苗VDBP/VSIG4转染树突状细胞疫苗的制备

1、树突状细胞的分选

取4周龄Balb/c小鼠，脱颈处死，用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡5分钟，无菌条件下切开皮肤及皮下组织，分离小鼠股骨和胫骨，用浓度为0.01mol/L的无菌PBS清洗3～5次，剪断股骨和胫骨两端，用浓度为0.01mol/L的无菌PBS反复冲洗骨髓腔，制成单细胞悬液，1000r/min 离心5分钟去掉脂肪层，细胞用浓度为0.01mol/L的无菌PBS重悬，再缓慢加入等体积Percoll 细胞分离液，3000r/min离心30分钟，收集单核细胞，用浓度为0.01mol/L的无菌PBS洗涤2次，再用含血清的DMEM培养基重悬，所得单细胞悬液接种于T-25培养瓶内，并补充粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)，置温度为37℃、CO

2、多价疫苗VDBP/VSIG4转染树突状细胞

将树突状细胞以细胞浓度为1×10

Western Blot检测：分别超声裂解VDBP/VSIG4转染树突状细胞和空质粒转染树突状细胞，收集细胞总蛋白进行SDS-PAGE，电泳完毕后电转印PVDF膜，洗膜，封闭，加入兔抗人VSIG4多克隆抗体，37℃孵育1小时，洗膜，再加入羊抗兔IgG，37℃孵育1小时，洗膜，显色。结果见图3，其中条带1为：PBS,条带2为：空质粒多价疫苗，条带3为：多价疫苗VDBP/VSIG4。结果所示：VDBP/VSIG4在树突状细胞中可以表达VSIG4。

三、多价疫苗VDBP/VSIG4转染树突状细胞疫苗抗1型糖尿病能力检测

取2月龄糖尿病易患性NOD小鼠，随机分为两组：实验组和对照组，实验组尾静脉回输多价疫苗VDBP/VSIG4转染树突状细胞疫苗，连续回输3次，每周1次，每次输入1×10

1、淋巴细胞增殖能力检测

末次回输后1周，断颈处死两组小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，用100目筛网碾磨成细胞悬液，用常规聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心法分离获得脾淋巴细胞，用含有体积分数为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为1×10

结果见图4，实验组小鼠淋巴细胞的cpm值为36000±3200，而对照组小鼠淋巴细胞的cpm 值为55000±6300，证实VDBP/VSIG4病毒转染树突状细胞疫苗能够有效降低淋巴细胞的增殖能力。

2、淋巴细胞分泌细胞因子能力检测

末次回输后1周，断颈处死两组小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，用100目筛网碾磨成细胞悬液，用常规聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心法分离获得脾淋巴细胞，用含有体积分数为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为1×10

结果见图5，实验组小鼠淋巴细胞的IL-2和IFN-γ含量分别为53.5±5.9pg/ml和48.4±5.3pg/ml，而对照组小鼠淋巴细胞的的IL-2和IFN-γ含量分别为126.8±15.3pg/ml和 102.7±11.4pg/ml，证实VDBP/VSIG4病毒转染树突状细胞疫苗能够有效降低淋巴细胞分泌细胞因子的能力。

3、NOD小鼠糖尿病发病率检测

监测实验组和对照组小鼠的血糖水平。

结果见图6，实验组小鼠18周龄开始出现血糖异常，30周龄的糖尿病发病率为30％，而对照组小鼠14周龄开始出现血糖异常，30周龄的糖尿病发病率高达70％；证实VDBP/VSIG4病毒转染树突状细胞疫苗能够有效延迟NOD小鼠糖尿病的发病时间，并降低糖尿病的发病率。

4、移植胰岛生存期检测

胰岛细胞分离和纯化：将C57BL/6J小鼠颈椎脱臼处死后，用体积分数为75％的乙醇溶液浸泡消毒，无菌条件下打开腹腔，暴露胆总管，在解剖显微镜下结扎胆胰管在十二指肠的开口，沿胆总管逆行灌注Hank's液(含有浓度为0.1g/L的胶原酶P和浓度为10mg/L的DNase-I)，待胰腺膨胀后，立即摘除胰腺组织，置温度4℃预冷的Hank's液中清洗2次，剪成0.5～1mm

胰岛细胞移植：分别在实验组和对照组NOD小鼠检测到血糖异常后1周，将5×10

结果如图7所示，实验组小鼠移植胰岛的平均生存期为10天，而对照组小鼠移植胰岛的平均生存期为4天，证实VDBP/VSIG4病毒转染树突状细胞疫苗能够有效延长NOD小鼠移植胰岛的生存期。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 重庆医科大学附属永川医院

<120>一种基于VDBP/VSIG4的免疫负向调节多价疫苗及其制备方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Leu Trp Met Arg Trp Tyr Ser Pro Lys Ser Tyr Ser Tyr Leu Leu

1 5 10 15

Thr Thr Leu Ser Asn Arg Val

20 25

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Leu Trp Met Arg Trp Tyr Ser Pro Lys Ser Tyr Ser Tyr Asn Leu

1 5 10 15

Ile Lys Leu Ala Gln Lys Val

20 25

<210> 3

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Lys Leu Trp Met Arg Trp Tyr Ser Pro Ala Tyr Ala Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Thr Thr Leu Leu Val Ala Tyr Ala Lys Asp Glu Leu

20 25

<210> 4

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tctgttcaac ggctatgtca cattgctct 29

<210> 5

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tgcgctgtga gatccagaat ttgaggaaa 29

<210> 6

<211> 35

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

agccacagat tgcgctgtga gggcgcagtt tcctc 35

<210> 7

<211> 35

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gacacttcgg gtcttaaact cctttgacgc gacac 35