新型免疫调节分子VSIG4对Ⅱ型胶原诱发小鼠关节炎症进展的影响

摘要

目的：以牛Ⅱ型胶原蛋白诱导的VSIG4-/-（基因背景：C57BL/6）及野生型（基因背景：C57BL/6）关节炎模型小鼠为研究对象，探讨新型免疫调节分子VSIG4在类风湿关节炎病理进程中的影响。进一步构建 VSIG4-Fc重组慢病毒载体和稳定表达 VSIG4-Fc的RAW264.7细胞株，并初步探讨VSIG4-Fc对巨噬细胞活化的影响。
　　方法：首先将VSIG4-/-（基因背景：C57BL/6）小鼠，以牛Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）与完全弗氏佐剂完全乳化制成乳剂后尾根部皮下注射，在第21天以牛Ⅱ型胶原蛋白与不完全弗氏佐剂加强免疫获得CIA模型。与同系正常小鼠比较分析小鼠关节改变，并进行关节炎临床评分。用H&E染色法检测小鼠关节组织病理学改变、免疫组织化学染色法检测关节中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ以及IL-17等细胞因子的变化，并采用流式细胞术检测脾淋巴细胞以及腹腔巨噬细胞中TNF-α的变化。接下来将VSIG4-/-（基因背景：C57BL/6）及野生型C57BL/6小鼠，以牛Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）与完全弗氏佐剂完全乳化制成乳剂后尾根部皮下注射，在第21天以牛Ⅱ型胶原蛋白与不完全弗氏佐剂加强免疫获得胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis，CIA）模型，定期观察关节改变，并进行关节炎临床评分。H&E染色观察小鼠关节组织病理学改变，免疫组织化学染色法检测关节中 TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ以及 IL-17等细胞因子的变化。进一步将目的基因VSIG4-Fc和PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV慢病毒载体以ECORⅠ和BamHⅠ进行酶切后连接，获得表达VSIG4-Fc的慢病毒载体，与辅助病毒载体以脂质体法共转染于293T细胞，获得病毒上清后将其感染于RAW264.7细胞，构建稳定表达目的基因的细胞株。采用western blot法检测转基因细胞中VSIG4的表达。进一步使用定量 PCR法体外分析 VSIG4-Fc融合蛋白对骨髓来源巨噬细胞(BM-derived macrophages，BMDM)及其TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ以及IL-17等细胞因子分泌的影响。
　　结果：1. VSIG4-/-小鼠在牛Ⅱ型胶原蛋白免疫后第9天开始出现明显的多关节肿胀。小鼠踝关节病理检测结果显示明显的滑膜增生，炎症细胞浸润以及关节坏死。进一步研究发现来源于 VSIG4-/- CIA小鼠与同系正常小鼠相比，虽然脾淋巴CD4+T细胞分泌的TNF-α没有显著性差异（P>0.05），但是腹腔巨噬细胞分泌的TNF-α具有显著性差异（P<0.05）。此外，VSIG4-/-CIA小鼠关节组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等细胞因子的表达明显高于同系正常小鼠(P<0.05)。
　　2.VSIG4-/-（基因背景：C57BL/6）及野生型（基因背景：C57BL/6） CIA小鼠均在初次免疫后第8天开始后脚掌出现明显的红肿，并且在初次免疫后第33天开始，VSIG4-/-模型组临床评分明显高于野生型模型组小鼠（P<0.05）。小鼠踝关节病理检测结果显示明显的滑膜增生，炎症细胞浸润以及关节坏死，并且VSIG4-/- CIA小鼠关节滑膜中IL-Iβ、IL-17、IL-6和TNF-α等炎症因子的表达明显高于野生型CIA小鼠（P<0.05）。
　　3.成功构建表达VSIG4-Fc的慢病毒载体，并获得稳定表达VSIG4-Fc基因的细胞株，鉴定结果显示其稳定高表达 VSIG4。体外实验结果显示，VSIG4-Fc融合蛋白可抑制炎症巨噬细胞所分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等细胞因子。
　　结论：牛Ⅱ型胶原蛋白可诱导 VSIG4-/-小鼠的关节炎，其中腹腔巨噬细胞分泌的TNF-α在其发病过程中可能起关键作用。且 VSIG4的基因敲除可加剧Ⅱ型胶原蛋白诱导的关节炎症。并且 VSIG4-Fc融合蛋白可抑制巨噬细胞所分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-17等炎症因子。此外，稳定表达VISG4-Fc的RAW264.7转基因细胞的成功构建，为VSIG4的功能研究提供了必要的手段。

目录

声明

前言

第一部分 牛Ⅱ型胶原蛋白诱导VSIG4-/-小鼠关节炎模型的建立

1. 1材料与仪器

1. 2 实验方法

1.3统计学处理

1.4 实验结果

第二部分VSIG4基因敲除对牛Ⅱ型胶原蛋白诱导性关节炎症的作用

2.3 材料与仪器

2.2 实验方法

2.3 统计学处理

2.4 实验结果

第三部分 稳定表达VSIG4-Fc的RAW264.7细胞系的建立及VSIG4-Fc对巨噬细胞活化的影响

3.1 材料和仪器

3.2 实验方法

3. 3统计学处理

3.4 实验结果

第四部分 讨论与结论

4.1 讨论

4.2 结论

参考文献

致谢

文献综述:新型免疫调节分子 VSIG4 介导免疫清除及炎症的研究进展