一种基于生物金属有机骨架材料的药物递送载体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开一种基于生物金属有机骨架材料的药物递送载体及其制备方法和应用，将胱氨酸和金属盐溶解在去离子水中，用碱液调节pH后进行反应，获得产物；将抗癌药物与之在水中混合，室温避光搅拌，随后离心取沉淀，水洗后得到纳米复合物，可经静脉注射用于肿瘤治疗。利用本发明技术方案制备的药物递送载体具有很好的还原响应性，在肿瘤细胞内可以快速裂解，释放抗癌药物；在正常细胞内则可以保持稳定，限制药物释放，减少对正常细胞的损伤。

说明书

技术领域

本发明涉及纳米材料技术领域及生物医学材料领域，具体涉及一种对肿瘤微环境具有氧化还原响应性，且生物相容性好的生物金属有机骨架材料(bioMOF-M(Cys))的制备，以及利用该材料负载抗癌药物作为药物递送载体的应用。

背景技术

金属有机骨架材料(MOF)是一类由金属离子和有机配体组装而成的多孔材料，选择不同的金属离子和有机配体可以获得具有不同结构和功能的多孔材料。利用其多孔性的特点可以大量负载药物，是一种很好的药物递送载体。

肿瘤细胞微环境与正常细胞相比有所差异，如pH更偏酸性，温度较高，还原性谷胱甘肽水平较高等。利用这些特点开发对肿瘤微环境具有响应性的药物递送载体可以提高药物在肿瘤细胞的释放效率，增强疗效，同时降低抗癌药物对正常细胞的损伤。对于MOF材料，酸性条件下金属与配体间的配位键很容易断裂，故其本身可以作为pH响应型的药物载体。如：Zheng等人通过了“一锅法”合成了负载抗癌药物阿霉素的ZIF-8纳米颗粒，该药物载体在酸性pH(5.0-6.5)条件下能够快速分解释放药物，因此可以实现在肿瘤细胞微酸性环境下的响应性释放(Journal of the American Chemical Society，2015，138(3)，962)。张继稳等人公开了一种“一步法”原位聚合的方法，实现了ZIF-8的合成以及聚多巴胺(PDA)和阿霉素(DOX)的装载，制得的ZIF-8-PDA-DOX杂化金属有机骨架化合物实现了pH以及近红外双响应的药物释放，以及化疗与光热治疗的联合(中国发明专利，申请号201910267043.9)。此外，通过向有机配体上引入响应性基团也可以实现MOF载体对肿瘤微环境的响应性。如：Zhao等人开发了一种由锰离子(Mn

上述方法构成MOF材料的金属通常为Al、Mn、Cu等过渡金属，有机配体多为人工合成化合物，且合成反应中常引入有机溶剂，生物相容性难以保证，因此，MOF材料本身对肿瘤细胞和正常细胞均会产生毒性，且其降解产物对人体也会产生毒副作用，限制了MOF材料在实际药物递送中的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术的不足之处，提供一种具有还原响应性且生物相容性好的生物金属有机骨架材料药物递送载体(bioMOF-M(Cys))及其制备方法。该MOF以内源性金属离子作为配位结点(M)，以天然生物分子胱氨酸(Cys)作为配体，在水溶液中绿色合成。利用所制成的bioMOF-M(Cys)作为载体，负载抗癌药物，当其经静脉注射进入肿瘤细胞后，细胞中过表达的谷胱甘肽与胱氨酸配体中的S-S相互作用，令S-S键发生断裂，多孔骨架结构遭破坏，从而快速释放抗癌药物。而在正常细胞中，S-S键不断裂，药物仍被限制在载体中，从而降低了药物对正常组织的损伤和毒副作用。

本发明的技术目的是通过以下技术方案实现的。

一种基于生物金属有机骨架材料的药物递送载体及其制备方法，按照下述步骤进行：将胱氨酸和金属盐均匀分散在去离子水中并使用碱液调节pH为碱性，进行反应之后冷却离心并收集沉淀，洗涤，获得药物递送载体bioMOF-M(Cys)。

而且，碱液为氢氧化钠水溶液，或氢氧化钾水溶液，或氨水溶液，浓度为0.1～1mol/L，使用碱液调节pH为10～13。

而且，反应温度为40℃～180℃，反应时间为4～12h，优选反应温度为80℃～120℃，反应时间为6～10h。

而且，将胱氨酸和金属盐均匀分散在去离子水中，胱氨酸浓度为1～20mmol/L，优选8～15mmol/L。

而且，将胱氨酸和金属盐均匀分散在去离子水中，金属盐浓度为1～20mmol/L，优选8～15mmol/L。

而且，金属盐为锌盐(如：ZnCl

将本发明制备的药物递送载体bioMOF-M(Cys)与抗癌药物在水中混合，在室温避光且搅拌条件下进行反应，随后离心取沉淀，水洗后得到纳米复合物，可经静脉注射用于肿瘤治疗。

而且，抗癌药物为盐酸阿霉素、或姜黄素、或多烯紫杉醇、或5-氟尿嘧啶、或喜树碱等；浓度为100-1000mg/L。

而且，药物递送载体bioMOF-M(Cys)浓度为1000-5000mg/L。

而且，抗癌药物与药物递送载体bioMOF-M(Cys)在水中，室温20—25摄氏度下避光搅拌(如100—300转/min)时间为12-72h。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：(1)本发明的所述的生物金属有机骨架材料药物递送载体bioMOF-M(Cys)具有很好的还原响应性，在肿瘤细胞内可以快速裂解，释放抗癌药物；在正常细胞内则可以保持稳定，限制药物释放，减少对正常细胞的损伤。(2)本发明使用的金属为内源性金属，毒性低，有机配体为天然生物分子胱氨酸，合成反应溶剂为水，反应条件绿色环保，产物bioMOF-M(Cys)生物安全性好，体内代谢产物无毒副作用。(3)本发明合成bioMOF-M(Cys)的原料成本低廉，制备工艺简单。

附图说明

图1为实施例1制备的药物载体在负责盐酸阿霉素(DOX)之前(bioMOF-Zn(Cys))和之后(DOX@bioMOF-Zn(Cys))的透射电子显微镜图像及动态光散射测得的粒径结果。

图2为盐酸阿霉素(DOX)、bioMOF-Zn(Cys)、DOX@bioMOF-Zn(Cys)的水溶液的紫外-可见吸收光谱图。

图3为DOX@bioMOF-Zn(Cys)纳米颗粒在不同GSH浓度缓冲溶液中的释放效果图。

图4a和图4b分别为在含不同浓度bioMOF-Zn(Cys)的培养基孵育后A549细胞和BEAS-2B细胞的存活率。

图5为在含不同浓度盐酸阿霉素(DOX)和DOX@bioMOF-Zn(Cys)的培养基孵育后A549细胞的存活率。

图6为在含不同浓度的盐酸阿霉素(DOX)和DOX@bioMOF-Zn(Cys)的培养基孵育后BEAS-2B细胞的存活率。

图7a为A549细胞在游离DOX和DOX@bioMOF-Zn(Cys)纳米药物中进行培养的荧光照片。

图7b为BEAS-2B细胞在游离DOX和DOX@bioMOF-Zn(Cys)纳米药物中进行培养的荧光照片。

具体实施方式

为了清楚了解本发明的技术方案，下面通过实施例和附图，对本发明的技术方案做进一步的详细描述，搅拌速度为每分钟150转，避光反应温度为室温20—25摄氏度。

实施例1

1)将浓度为16mmol/L的胱氨酸和浓度为16mmol/L的ZnCl

2)将步骤1)的反应液置于100℃中反应8h后停止反应；

3)冷却后，将反应液离心收集沉淀，用去离子水多次洗涤，获得产物bioMOF-Zn(Cys)；

4)将盐酸阿霉素(DOX)与bioMOF-Zn(Cys)在水中混合，其中盐酸阿霉素浓度为400mg/L，bioMOF-Zn(Cys)浓度为2000mg/L，避光搅拌24h以后，离心取沉淀，水洗后得到纳米复合物DOX@bioMOF-Zn(Cys)，可经静脉注射用于肿瘤治疗。

实施例2

1)将浓度为20mmol/L的胱氨酸和浓度为20mmol/L的FeCl

2)将步骤1)的反应液置于180℃中反应3h后停止反应；

3)冷却后，将反应液离心收集沉淀，用去离子水多次洗涤，获得产物bioMOF-Fe(Cys)；

4)将姜黄素(CCM)与bioMOF-Zn(Cys)在水中混合，其中姜黄素浓度为100mg/L，bioMOF-Fe(Cys)浓度为1000mg/L，避光搅拌72h以后，离心取沉淀，水洗后得到纳米复合物CCM@bioMOF-Fe(Cys)，可经静脉注射用于肿瘤治疗。

实施例3

1)将浓度为1mmol/L的胱氨酸和浓度为1mmol/L的ZrCl

2)将步骤1)的反应液置于40℃中反应12h后停止反应；

3)冷却后，将反应液离心收集沉淀，用去离子水多次洗涤，获得产物bioMOF-Zr(Cys)；

4)将5-氟尿嘧啶(5-Fu)与bioMOF-Zr(Cys)在水中混合，其中5-氟尿嘧啶浓度为1000mg/L，bioMOF-Zr(Cys)浓度为5000mg/L，避光搅拌12h以后，离心取沉淀，水洗后得到纳米复合物5-Fu@bioMOF-Zr(Cys)，可经静脉注射用于肿瘤治疗。

实施例4

1)将浓度为16mmol/L的胱氨酸和浓度为8mmol/L的MgCl

2)将步骤1)的反应液置于100℃中反应10h后停止反应；

3)冷却后，将反应液离心收集沉淀，用去离子水多次洗涤，获得产物bioMOF-Mg(Cys)；

4)将盐酸阿霉素(DOX)与bioMOF-Mg(Cys)在水中混合，其中盐酸阿霉素浓度为1000mg/L，bioMOF-Mg(Cys)浓度为1000mg/L，避光搅拌48h以后，离心取沉淀，水洗后得到纳米复合物DOX@bioMOF-Mg(Cys)，可经静脉注射用于肿瘤治疗。

实施例5

1)将浓度为5mmol/L的胱氨酸和浓度为5mmol/L的CaCl

2)将步骤1)的反应液置于80℃中反应12h后停止反应；

3)冷却后，将反应液离心收集沉淀，用去离子水多次洗涤，获得产物bioMOF-Ca(Cys)；

4)将姜黄素(CCM)与bioMOF-Ca(Cys)在水中混合，其中姜黄素浓度为200mg/L，bioMOF-Ca(Cys)浓度为3000mg/L，避光搅拌72h以后，离心取沉淀，水洗后得到纳米复合物CCM@bioMOF-Ca(Cys)，可经静脉注射用于肿瘤治疗。

测试例及测试结果

以实施例1制备得到的生物金属有机骨架材料bioMOF-Zn(Cys)，及其负载盐酸阿霉素后的纳米复合物DOX@bioMOF-Zn(Cys)为测试例详细叙述本发明产品性能。

1)负载药物前后形貌及粒径测试

透射电子显微镜测试：取100μL bioMOF-Zn(Cys)和DOX@bioMOF-Zn(Cys)悬浊液稀释20倍，超声20min使样品均匀分散于超纯水中。吸取10μL样品滴在300目铜网表面，室温下蒸干溶剂，然后使用透射电子显微镜(加速电压：200kV)观察样品形貌。

动态光散射测试：取200μL bioMOF-Zn(Cys)和DOX@bioMOF-Zn(Cys)的超纯水悬浊液，将其分散于5mL超纯水中，超声20min使样品均匀分散，然后将样品进行动态光散射测试。

负载药物前bioMOF-Zn(Cys)形貌如附图1中a所示，bioMOF-Zn(Cys)呈现纳米颗粒状形貌，动态光散射结果显示其平均粒径为189.1nm，且粒径均一。负载抗癌药物阿霉素以后DOX@bioMOF-Zn(Cys)的形貌仍维持纳米颗粒状，如附图1中b所示，平均粒径为195.4nm，粒径均一，符合静脉注射对于药物粒径(<200nm)的要求。

2)载药量测试

采用紫外-可见分光光度计分别测定游离盐酸阿霉素(DOX)、bioMOF-Zn(Cys)、DOX@bioMOF-Zn(Cys)的水溶液的吸收光谱，波长扫描范围190nm-600nm，以分析药物在MOF-Zn(Cys)中的负载。结果如附图2所示，游离的DOX在233nm、256nm和480nm处有特征吸收峰，这些峰同时存在于DOX@bioMOF-Zn(Cys)中，但在bioMOF-Zn(Cys)中没有显示，说明DOX成功负载于bioMOF-Zn(Cys)中。

载药量计算：取20mg实施例1所得的bioMOF-Zn(Cys)纳米颗粒加入至400μg/mL的盐酸阿霉素水溶液中充分混合，室温避光搅拌24h，离心，水洗3次收集合并上清液，测定上清液中未负载的盐酸阿霉素的量。载药量计算公式为：载药量(mg/g)＝[负载前溶液中总药物质量(mg)-上清液中未负载的药物质量(mg)]/加入的bioMOF-Zn(Cys)质量(g)。最终求得载药量为138.0mg/g。

3)体外药物响应性释放测试

测试纳米复合物DOX@bioMOF-Zn(Cys)在含不同浓度谷胱甘肽(GSH)的缓冲液中的释放：将1mg的DOX@bioMOF-Zn(Cys)固体粉末超声分散于8mL含有不同浓度GSH(0、1、5、10mM)的磷酸盐缓冲液中(10mM，pH＝7.4)37℃下避光搅拌。每隔一段时间于12000rpm转速下离心10min，取上清液测定其中游离盐酸阿霉素的量。

结果如附图3所示，随着GSH浓度的增加，药物释放速率和累积释放量迅速增加。48h后，在含10mM GSH的磷酸盐缓冲液中，DOX@bioMOF-Zn(Cys)累积释放了80％的DOX，而在不含GSH的磷酸盐缓冲液中，DOX@bioMOF-Zn(Cys)仅释放了8.25％的DOX，证明了药物载体良好的氧化还原响应性。

4)bioMOF-Zn(Cys)材料的生物相容性测试

通过MTT实验测定bioMOF-Zn(Cys)对于人体肺癌细胞(A549)和正常人肺(支气管)上皮细胞(BEAS-2B)的毒性以评价其生物相容性：取经过传代达到对数生长期的A549和BEAS-2B细胞，分别接种于96孔板中，浓度为10

结果如附图4a和附图4b所示，bioMOF-Zn(Cys)在0-200μg/mL浓度范围内对于A549细胞和BEAS-2B细胞的生长无明显抑制作用，细胞存活率均在90％以上，说明bioMOF-Zn(Cys)毒性低，具有很好的生物相容性。

5)DOX@bioMOF-Zn(Cys)对肿瘤细胞的致死率测试

通过MTT实验测定DOX@bioMOF-Zn(Cys)对于人体肺癌细胞(A549)的细胞毒性：取经过传代达到对数生长期的A549细胞，接种于96孔板中，浓度为10

附图5显示当加入药物的浓度均为2.5μg/mL时，DOX@bioMOF-Zn(Cys)处理的肿瘤细胞存活率仅为40％，而游离DOX处理的肿瘤细胞存活率仍达80％，这说明DOX@bioMOF-Zn(Cys)相比于游离药物具有更高的肿瘤细胞致死率。

6)DOX@bioMOF-Zn(Cys)对正常细胞的毒副作用测试

通过MTT实验测定DOX@bioMOF-Zn(Cys)对于正常人肺(支气管)上皮细胞(BEAS-2B)的细胞毒性：取经过传代达到对数生长期的A549细胞，接种于96孔板中，浓度为10

附图6显示当加入药物的浓度均为2.5μg/mL时，DOX@bioMOF-Zn(Cys)处理的正常细胞存活率仍在90％以上，而游离DOX处理的正常细胞存活率仅有60％左右，这说明DOX@bioMOF-Zn(Cys)相比于游离药物对正常细胞的毒副作用更低。

7)肿瘤细胞和正常细胞对DOX@bioMOF-Zn(Cys)的摄取效率测试

取经过传代达到对数生长期的人体肺癌细胞(A549)和正常人肺(支气管)上皮细胞(BEAS-2B)，分别接种于6孔板中，每孔接种10

附图7a显示随着A549细胞在DOX@bioMOF-Zn(Cys)纳米药物中培养时间的增加，红色荧光强度增加，培养4h时，药物在整个细胞中比较均匀的分布，说明负载的DOX已经被释放出来，并能够作用于细胞核。而游离DOX组的红色荧光较弱，说明细胞摄取的药物较少，且药物主要分布在细胞质。附图7b显示随着BEAS-2B细胞在游离DOX和DOX@bioMOF-Zn(Cys)纳米药物中培养时间的增加，红色荧光强度并没有明显增加，且游离DOX组的红色荧光强度强于DOX@bioMOF-Zn(Cys)组。这说明DOX@bioMOF-Zn(Cys)纳米药物在肿瘤细胞能够快速释放抗癌药物，当经静脉注射进入肿瘤细胞后，细胞中过表达的谷胱甘肽与胱氨酸配体中的S-S相互作用，令S-S键发生断裂，多孔骨架结构遭破坏，从而快速释放抗癌药物。而在正常细胞中，S-S键不断裂，药物仍被限制在载体中，从而降低了药物对正常组织的损伤和毒副作用。

利用本发明内容进行工艺参数的调整，均可实现基于生物金属有机骨架材料的药物递送载体的制备，且表现出与本发明基本一致的性能，具有很好的还原响应性，在肿瘤细胞内可以快速裂解，释放抗癌药物；在正常细胞内则可以保持稳定，限制药物释放，减少对正常细胞的损伤，使用的金属为内源性金属，毒性低，有机配体为天然生物分子胱氨酸，合成反应溶剂为水，反应条件绿色环保，产物bioMOF-M(Cys)生物安全性好，体内代谢产物无毒副作用。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。